脂質(zhì)體制備方法

微脂體(又稱(chēng)脂質(zhì)體)及其制備方法一二微脂體(又稱(chēng)脂質(zhì)體)微脂體起源於1960年月中期，Bangham博士等人首先提出，在磷酸脂薄膜上參加含鹽分的水溶液後，再加以搖晃，會(huì)使脂質(zhì)形成具有通透性的小球；1968年，Sessa和Weissmann等人正式將此小球狀的物體命名為微脂體〔liposome〕並做出明確的定義:指出微脂體是由一到數(shù)層脂質(zhì)雙層膜(lipid bilayer)所組成的微小的囊泡，有自行密合〔self-closing〕的特性。微脂體由脂雙層膜包裹水溶液形成，由於構(gòu)造的特性，可同時(shí)作為厭水性〔hydrophobic〕及親水性〔hydrophilic〕藥品的載體，厭水性藥品可以嵌入脂雙層中，而親水性藥品則可負(fù)電荷、正電荷。此外，磷酸脂碳鏈局部的長(zhǎng)短，不飽和鍵數(shù)目，會(huì)決定微脂體的臨界溫度(transitiontemperature,Tc)，影響膜的緊密度。一般來(lái)說(shuō)，碳鏈長(zhǎng)度越長(zhǎng)臨界溫度越高，雙鍵數(shù)越多則臨界溫度越低，常見(jiàn)的DPPC(dipalmitoylphosphatidylcholine)與DSPC(distearoylphosphatidylcholine)的臨界溫度分別是42℃56℃，而EggPC(eggphosphatidylcholine)與POPC(palmitoyloleoylphosphatidylcholine)的Tc則低於0℃。臨界溫度影響微脂體包裹及結(jié)合藥物的Tc在的時(shí)間較長(zhǎng)。微脂體可依脂雙層的層數(shù)或是粒子大小，加以命名或分類(lèi)：Multilamellar vesicle〔MLV〕是具有多層脂雙層之微脂體，粒子大小介於100-1000nm直接水合後，即形成MLV，體積通常較為龐大，脂質(zhì)含量較高。MLV的脂雙MLV又稱(chēng)為oligo-lamellarliposomespaucilamellarvesicle。LargeUnilamellarVesicle(LUV)則是單層脂雙層所構(gòu)成的微脂體，一1000nm等級(jí)(250-2500nm或更大)的微脂體，動(dòng)物細(xì)胞便是一種LUV。Intermediate-sizedUnilamellarVesicle(IUV)也是單層脂雙層所構(gòu)成的100nm等級(jí)(25-250nm)的微脂體。不過(guò)，目前一般文獻(xiàn)已經(jīng)很少使用IUV，而是將它併入SUV中。SmallUnilamellarVesicle(SUV〕是單層脂雙層所構(gòu)成的小微脂體，早期的分類(lèi)指特定磷酸脂所能夠成的最小微脂體(一般以超音波震盪製成)如eggPC以生理食鹽水(normalsaline)水合的SUV是15nm；DPPC 則是25nm。的方法，包括：1.)薄膜搖振法〔Thinfilmmethod;Hand-shakingmethod〕：又稱(chēng)做Bangham’smethod，將脂質(zhì)以有機(jī)溶劑如氯仿〔chloroform〕、甲醇〔methanol〕及乙醇〔ethanol〕等溶解，均勻混合後，利用旋轉(zhuǎn)真空乾燥機(jī)(rotaryevaporator)使圓底瓶?jī)?nèi)的溶劑揮發(fā)之後，即可在瓶壁上形成均勻的脂質(zhì)膜，在臨界溫MLV。2.)冷凍-再解凍(freez-thaw)、均質(zhì)(homogenization)及超音波震盪法〔sonicationmethod〕：利用微脂體裂開(kāi)後會(huì)再自行密合的特性，以機(jī)械性的力氣均組再密合，最後可形成大小較均勻的單層微脂體。3.)反相蒸發(fā)法〔Reversephaseevaporationmethod〕：以有機(jī)溶劑溶解適合用來(lái)包覆較為稀有或是較珍貴的藥品及蛋白質(zhì)。4.)(solventinjection)和清潔劑透析法(detergentdialysis)：利用有機(jī)溶劑和清潔劑溶解脂質(zhì)，與準(zhǔn)備包覆的水溶液混合形成微脂體後，以透析法除去有機(jī)溶劑和清潔劑。5.)濾膜擠出法〔Extrusion〕：可將上述方法製成的微脂體，改變成所需粒MLVLUV置於擠壓器(extruder)微脂體。利用這種方法製成的微脂體可將粒徑大小掌握到一百奈米以下。兩類(lèi)血漿蛋白發(fā)生作用，1〕所謂調(diào)理素〔opsonins)可附著於微脂粒外表，促使其被RES之吞食細(xì)胞噬食。2〕高密度脂蛋白〔HDL〕襲擊微脂粒，藉phosphatidylcholinetransferase活性蛋白之助，抽掉微脂粒上之磷脂分子，使微脂粒微脂?！瞫tealthliposomes〕。微脂粒聚攏至目標(biāo)細(xì)胞。微脂粒與細(xì)胞作用的機(jī)制有數(shù)種：1〕膜組成交換〔intermembranetransfer〕：即微脂粒膜的組成與細(xì)胞膜的組成中有一部份相互交換；2〕吸著〔adsorption〕：微脂粒附著於細(xì)胞膜；3〕膜融合〔fusion〕：微脂粒與細(xì)胞膜融合，將包涵物送進(jìn)細(xì)胞內(nèi)；4〕吞食〔phagocytosis,endocytosis〕：微脂粒被細(xì)胞吞食。欲使微脂粒依期望之機(jī)制與細(xì)胞作用，則要設(shè)計(jì)微脂粒。陽(yáng)離子脂質(zhì)體(cationicliposome)80年月中期進(jìn)展起來(lái)的一種最具創(chuàng)性的、高效的轉(zhuǎn)染(transfection)技術(shù)。陽(yáng)性脂質(zhì)體(cationicliposome),又稱(chēng)陽(yáng)離子脂質(zhì)體、正電荷脂質(zhì)體(positivelychargedliposome),是一種本身帶有正電荷的脂質(zhì)囊泡。它可作為荷負(fù)電物質(zhì)的傳遞載體,特別適用于蛋白質(zhì)、多肽和寡核苷酸類(lèi)物質(zhì)、脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)等,所以在基因治療方面有獨(dú)特應(yīng)用,近年來(lái)，成為在體外爭(zhēng)論培育體系中均能應(yīng)用，并且能得到順時(shí)表達(dá)〔transientexpression〕和穩(wěn)定表達(dá)〔stableexpression〕的細(xì)胞株。陽(yáng)性脂質(zhì)體的組成分子層。其中,中性磷脂起到穩(wěn)定雙層膜和降低陽(yáng)性成分毒性的作用,同時(shí)供給陽(yáng),多為雙鏈季銨鹽型外表活性劑,為整個(gè)脂質(zhì)體供給正電荷，有很強(qiáng)的細(xì)胞膜去穩(wěn)定化作用。目前，使用最廣泛的陽(yáng)性成分有以N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)、3β-[N-(Nˊ,Nˊ-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]膽固醇(DC-Chol)2,3-二油酰氧-N-[2(精胺羧基酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙基-三氟乙酸銨(DOSPA)、1,2-二油酰氧丙基-N,N,N-三甲基溴化銨(DOTAP)等，具有體外穩(wěn)定性好，體內(nèi)可被生物降解的特點(diǎn)，但具有肯定的細(xì)胞毒性。陽(yáng)性脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的作用機(jī)制DNA形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物〔2〕與細(xì)胞膜的作用〔3〕DNA釋放到細(xì)胞中。陽(yáng)性脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物〔Lipoplex〕的形成附，這樣通過(guò)陽(yáng)性脂質(zhì)體的介導(dǎo)，可以把核酸物質(zhì)結(jié)合到細(xì)胞膜上。Gershon1993年使用電鏡技術(shù),爭(zhēng)論了復(fù)合物的形成和構(gòu)造特征。他認(rèn)為,陽(yáng)性脂質(zhì)體DNA分子上,程度時(shí),DNA誘導(dǎo)的脂質(zhì)體膜融合和脂質(zhì)體誘導(dǎo)的DNA斷裂同時(shí)發(fā)生,斷裂后的DNA分子被包封于重形成的脂質(zhì)體中。后來(lái)，StefanHuebner1999年DNA的電荷比例有親熱聯(lián)系。復(fù)合物有三種形式：〔1〕DNA包裹的單層囊泡〔2〕由單層囊泡組成的寡聚復(fù)合物〔3〕多層囊泡聚合物。并且他提出“脂質(zhì)體滾動(dòng)”DNA包裹的單層囊泡被另一個(gè)“模板”囊泡吸附，隨即發(fā)生斷裂，沿著“模板”囊泡“滾動(dòng)”，依此類(lèi)推，就形成了多層囊泡聚合物，這就解釋了復(fù)合物缺口形成的緣由。目前，這一觀點(diǎn)已漸漸為寬闊爭(zhēng)論者所認(rèn)可。細(xì)胞對(duì)陽(yáng)性脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物的攝取最初的爭(zhēng)論指出，最初的爭(zhēng)論指出,對(duì)于帶負(fù)電荷的核酸物質(zhì)(DNA、RNA和寡核苷酸),主要是通過(guò)胞飲作用(endocytosis)(endocytosis),將復(fù)合物包封于有衣小泡(coatedvesicle)內(nèi)。進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后,有衣小泡形成內(nèi)吞小泡(endosome),與其它細(xì)胞內(nèi)囊泡融合,又將內(nèi)吞物轉(zhuǎn)送到溶酶體〔lysome〕內(nèi),實(shí)現(xiàn)內(nèi)吞作用介導(dǎo)的脂質(zhì)體與細(xì)胞的融合。還有一種假說(shuō)是融合理論：陽(yáng)性脂質(zhì)體與細(xì)胞結(jié)合后,脂質(zhì)體膜和細(xì)胞膜外表重合局部發(fā)生融合,DNAWrobelG2(HepG2)和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞為靶細(xì)胞,爭(zhēng)論了脂質(zhì)體與細(xì)胞的融合過(guò)程,證明內(nèi)吞作用是融合的關(guān)鍵。在三磷酸腺苷(ATP)耗竭劑和高滲介質(zhì)等抑制內(nèi)吞作用的物質(zhì)存在下,脂質(zhì)體只能與細(xì)胞外表結(jié)合,不能實(shí)現(xiàn)內(nèi)吞作用，而此時(shí)轉(zhuǎn)染效率較無(wú)抑制劑的比照Leventis等覺(jué)察陽(yáng)離子脂質(zhì)體與細(xì)胞融合活性和轉(zhuǎn)染率不全都,證明融合機(jī)制不是其轉(zhuǎn)運(yùn)的主要渠道。所以，人們認(rèn)為細(xì)胞對(duì)陽(yáng)性脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物的攝取主要通過(guò)內(nèi)吞作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。陽(yáng)性脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物〔Lipoplex〕在細(xì)胞內(nèi)釋放DNA的機(jī)制Hopkins等指出陽(yáng)離脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與溶酶體(lysome)膜融合，主要分布于核周高度有序的管狀構(gòu)造中,如核內(nèi)體(endosome)中,含有陽(yáng)離子脂質(zhì)體–DNA復(fù)合物的核內(nèi)體膜極不穩(wěn)定,可以釋放出復(fù)合物。Farhood等在爭(zhēng)論中也DNA向細(xì)胞的傳遞過(guò)程,因此,認(rèn)為脂質(zhì)體的主要功能是使內(nèi)吞小泡去穩(wěn)定化,DNA釋放到細(xì)胞中。影響陽(yáng)性脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染效率的因素DNA的電荷比例Huebner等應(yīng)用冷凍蝕刻電鏡技術(shù)〔cryoandfreeze-fractureelectronicmicroscopy〕覺(jué)察，陽(yáng)性脂質(zhì)體與DNA的電荷比例打算了復(fù)合物的構(gòu)造和大小，電荷比例有0.2的差距，其復(fù)合物的構(gòu)造、大小都有很大差異。不加DNA的狀況下，脂質(zhì)體是單層囊泡〔unilamellarvesicles〕形式存在，其直徑為65nm〔±18nm〕。當(dāng)DNA的比例較少時(shí)，復(fù)合物多以多層囊泡聚合物〔multilamellarcomplex〕形式存在，其直徑較單層囊泡要大的多。當(dāng)DNA的比例較高時(shí)，復(fù)合物多以DNA包被的單層囊泡〔DNA-coated,andfusedDNA-coated,unilamellarvesicles〕構(gòu)造存在也有少量寡聚復(fù)合〔clusterofDNA-coated vesicle〕，其大小較多層囊泡聚合物小的多不同類(lèi)型的細(xì)胞其吸取大小各異顆粒的力量也不盡一樣。依據(jù)具體狀況預(yù)備適宜的脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物對(duì)于轉(zhuǎn)染效率是很重要的。細(xì)胞的狀態(tài)〔passage〕，1：31：5的比例分瓶，具體的傳代間隔時(shí)間以細(xì)胞的生長(zhǎng)周期來(lái)打算。同時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)機(jī)的把握也很重50％～70％為宜，留意在轉(zhuǎn)染時(shí)培育瓶?jī)?nèi)細(xì)胞不能長(zhǎng)滿。血清血清中的載脂蛋白與脂質(zhì)體的相互作用會(huì)導(dǎo)致脂肪酸鏈運(yùn)動(dòng)的自由度降低,雙分子層積存特性轉(zhuǎn)變和脂質(zhì)從脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移到載脂蛋白上,使脂質(zhì)體膜的通透性增加,最終裂開(kāi)。其次血清白蛋白、抗磷脂抗體和可溶性脂交換蛋白也可引起脂質(zhì)體膜的不穩(wěn)定。DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物同細(xì)胞通常是在無(wú)血清環(huán)境下作用的,假設(shè)局部轉(zhuǎn)染要在肯定百分比的血清濃度下才能完成,但脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物仍必需-DNA復(fù)合物形成過(guò)程中血清存在的話將會(huì)降低轉(zhuǎn)染的表達(dá)活力,這可能是由于復(fù)合物同帶負(fù)電荷的血清蛋白結(jié)合,電荷被中和的原因,但當(dāng)脂質(zhì)體-DNA復(fù)合一旦形成,影響就不那么明顯。載體在實(shí)施轉(zhuǎn)染的過(guò)程中,選擇適合的轉(zhuǎn)染載體如同選擇恰當(dāng)?shù)募?xì)胞株和培育條,有時(shí)也包括病毒序列。完成轉(zhuǎn)染過(guò)程后,一些基因挨次允許載體在細(xì)菌(如一般的大腸桿菌)DNA;另外的一些序列則是在真核細(xì)胞中克隆化,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡,它們只能用于臨時(shí)性的表達(dá);另一類(lèi)不在真核細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的載體可同時(shí)應(yīng),在真核細(xì)胞中允許非指數(shù)復(fù)制,這就可能不通過(guò)整合作用而得到穩(wěn)定的表達(dá)。陽(yáng)性脂質(zhì)體的陽(yáng)性成分很多爭(zhēng)論說(shuō)明,陽(yáng)性脂質(zhì)體的陽(yáng)性成分對(duì)于基因的轉(zhuǎn)染率有很大影響。Claire等以幾種不同的陽(yáng)性脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒DNApSV-CAT轉(zhuǎn)染3T3脂肪細(xì)胞,以氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)活性代表轉(zhuǎn)染率,結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)染率依次為:LipofectAMI>>Cheng-DNA-轉(zhuǎn)鐵蛋白半乳糖苷酶基因轉(zhuǎn)染人宮頸癌上皮細(xì)胞(Hela)DC-Chol>LipofectAMINEPinnaduwageDTAB,TTAB,CTAB介導(dǎo)Lipofectin。4. 陽(yáng)性脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法的優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用前景陽(yáng)性脂質(zhì)體作為一種高效的基因傳遞載體,具有以下優(yōu)點(diǎn):①可防止核酸被體可生物降解。③易于制備,使用便利,可將大的DNA片斷轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中。④基因轉(zhuǎn)染率高,離體細(xì)胞可以瞬間表達(dá)外源基因。目前，陽(yáng)性脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染技術(shù)在基因治療領(lǐng)域中將發(fā)揮其無(wú)窮的潛力。制作方法一二：LipidsandlipidvesiclesEgg-phosphatidyl-choline(egg-PC),dipalmitoyl-phosphatidyl-choline(DPPC),dimyristoyl-phosphatidyl-choline(DMPC)andcholesterol(Chol)wereobtainedfromAvantiPolarLipids,Inc.(Alabaster,AL)andstoredinchloroform.Alllipidswereusedwithoutfurtherpurification.HighgradedmicawaspurchasedfromTedPella,Inc.(Redding,CA).PurewaterwasobtainedwithaMilliQsystem(Millipore,Beford,MA).Oneofmethodsforpreparingsupportedbilayersisbyfusionofvesicles.Largeunilamellarvesicles(LUV)werepreparedbythefreeze-thawextrusionmethod.Thelipids,dissolvedincholoform,weredriedtoathinfilm underastreamof rogen,and weredriedovernightin vacuumforthesolventtocompletelyevaporate.Thelipidfilmwasthenhydratedandmixedby vortex.Aftersixfreeze-thawcyclesthesuspensionwaspassedthroughtheloresofapolycarbonatedmembrane(200nm,AvantiPolarLipids Inc.)withtheaidofalipidextruder(AvantiPolarLipids Inc.).Vesiclesolutionsweremadeinaqueoussolutionandthendilutedtothedesiredconcentrationina10mMMgCl2solution.ILSMethodAnothermethodforpreparingsupportedbilayersintheexperimentisbydepositingtwomonolayersontomicasubstrate.Thefirstmonolayerisdepositedbyinverse-LSmethod6.Mica,whichhavea hydrophilicsurface,wassubmergedjustbelow thesubphasesurfacebeforethemonolayerwasspread.Monolayerwasthenspreadandcompressedtothedesiredsurfacepressure.Thesubphasewasaspiratedout