一氧化氮合酶和雌激素受體在下丘腦諸核團(tuán)的分布及共存

一氧化氮合酶和雌激素受體在下丘腦諸核團(tuán)的分布及共存

腦癱是神經(jīng)分泌物的中心。雌激素的分泌和合成直接受腦癱和垂體-腺體軸的直接控制。雌激素通過(guò)與其受體結(jié)合介導(dǎo)了下丘腦內(nèi)重要功能,如對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控以及下丘腦內(nèi)神經(jīng)肽的表達(dá)和調(diào)控,還可通過(guò)影響多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放進(jìn)一步影響神經(jīng)元的功能。一氧化氮(NO)是一種氣體信息遞質(zhì),由一氧化氮合酶(NOS)合成,參與和介導(dǎo)了下丘腦的許多重要功能。如NO介導(dǎo)和調(diào)控催產(chǎn)素(OT)和加壓素(VP)、促性腺激素釋放激素(GnRh)的釋放,以及其他神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,并參與突觸可塑性的形成。以往的研究表明NOS、雌激素受體(ER)陽(yáng)性神經(jīng)元在下丘腦分布廣泛,有諸多共同分布區(qū)域,兩者在功能上還有聯(lián)系,本實(shí)驗(yàn)對(duì)下丘腦視上核內(nèi)NOS和ER共存進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察和研究,以期為進(jìn)一步探討NO與雌激素之間的內(nèi)在聯(lián)系提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1飼養(yǎng)的動(dòng)物環(huán)境采用SD雌性大鼠30只(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體質(zhì)量220～260g,將動(dòng)物置于溫暖、安靜、避強(qiáng)光環(huán)境下飼養(yǎng),使之適應(yīng)周圍環(huán)境。1.2酶抑制劑bbtER購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;硝基四氮唑藍(lán)(NBT)購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;還原型輔酶Ⅱ-黃遞酶(NADPH-d)由華美生物工程公司提供;SABC試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。1.3灌注pbs液大鼠麻醉后,經(jīng)左心室升主動(dòng)脈依次灌入生理鹽水、4%多聚甲醛磷酸緩沖液(PBS,pH7.4)、10%的蔗糖PBS液,灌注后取腦,入4%的多聚甲醛液后固定3h,然后入20%的蔗糖PBS液(4℃)冰箱過(guò)夜。待腦組織浸泡沉底后取出,截取下丘腦部分腦組織,在冰凍切片機(jī)上做冠狀面的連續(xù)切片,隔3取1,片厚約40μm。1.4染色將切片分成3套,一套行NADPH-d組織化學(xué)染色,一套行ER免疫組化顯色,另一套行NADPH-d/ER雙重染色。1.4.1羊抗兔igg片設(shè)計(jì)將經(jīng)山羊血清孵育過(guò)的切片放入濃縮型兔抗ER血清(1∶100PBS稀釋)中37℃恒溫箱孵育3h,后置4℃冰箱過(guò)夜,入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG液(即用型)中,37℃恒溫箱孵育0.5h,入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素37℃恒溫箱孵育0.5h,PBS液漂洗3次,DAB顯色后裱片制片。1.4.2-u-100,ml-nadph-d,0.5mg/ml-nadph-d-1.3%-1.3的合成將切片在0.01mol/L的PBS液漂洗3次后,入孵育液(孵育液組成:0.3%TritonX-100,1mg/mlβ-NADPH-d,0.5mg/mlNBT的PBS緩沖液)中37℃恒溫箱孵育1.5h,用PBS緩沖液(pH7.4)終止反應(yīng),裱片制片。1.4.3正?；笜?biāo)在NADPH-d染色的基礎(chǔ)上再行ER免疫組化顯色,用0.01mol/L的PBS液(pH7.4),漂洗3次,入正常山羊血清37℃孵育1h;以后步驟同ER免疫組化顯色程序。1.5比較試驗(yàn)另取1只鼠腦冠狀連續(xù)切片分4組,分別作以下反應(yīng):1.5.1抗感染試驗(yàn)空白試驗(yàn):分別省去兩套染色中的NADPH-d、兔抗ER血清,分別孵育切片。置換試驗(yàn):用正常兔血清代替兔抗ER血清。1.5.2er免疫組化顯色在行NADPH-d組織化學(xué)染色后,切片經(jīng)PBS液漂洗,直接進(jìn)行ER免疫組化顯色中的DAB/雙氧水呈色步驟,證實(shí)是否有殘余的NADPH-d、NBT與DAB反應(yīng)而導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物混雜。1.6osol析pge毒片先于明視野顯微鏡下對(duì)各切片逐一觀察,后用OlympusC-5050ZOOM數(shù)碼相機(jī)在OlympusBH2顯微鏡下攝片。每只動(dòng)物選片5張,每張切片測(cè)4個(gè)視野,在捷達(dá)801形態(tài)圖像分析系統(tǒng)下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),分別計(jì)數(shù)下丘腦各核團(tuán)內(nèi)NOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目,ER陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目及NOS/ER雙染神經(jīng)元數(shù)目,并計(jì)算出雙染神經(jīng)元數(shù)占所有神經(jīng)元的百分比。2結(jié)果2.1nos陽(yáng)性神經(jīng)元對(duì)細(xì)胞的分布NOS陽(yáng)性神經(jīng)元呈藍(lán)色,細(xì)胞核不著色,胞體上的突起清晰可見(jiàn)。其中視上核、室旁核、下丘腦外側(cè)區(qū)NOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量較多,表達(dá)較強(qiáng)。在室旁核,NOS陽(yáng)性神經(jīng)元多分布在小細(xì)胞部,此處的NOS陽(yáng)性神經(jīng)元多呈卵圓形和梭形,胞體突起較長(zhǎng),多伸向第三腦室腔,有些突起呈“串珠”樣外觀(圖1A)。小細(xì)胞部的NOS陽(yáng)性神經(jīng)元多集中分布在小細(xì)胞部的腹內(nèi)側(cè)區(qū),在細(xì)胞分布密集處可見(jiàn)突起互相交織呈網(wǎng)狀。大細(xì)胞部有散在NOS陽(yáng)性神經(jīng)元。在視上核,NOS陽(yáng)性神經(jīng)元密集成簇,以梭形細(xì)胞多見(jiàn),胞體較大,胞質(zhì)著色較深,胞核透亮,可見(jiàn)到突起交織成叢和“串珠”樣外觀(圖1B)。在下丘腦外側(cè)區(qū),NOS陽(yáng)性神經(jīng)元多呈梭形,細(xì)胞突起較多且長(zhǎng),末端可見(jiàn)分叉現(xiàn)象,相鄰細(xì)胞與細(xì)胞間突起密集交織成網(wǎng)狀(圖1C)。在室周核(圖1D),NOS陽(yáng)性神經(jīng)元散在分布,呈卵圓形,突起清晰可見(jiàn),有伸向第三腦室的“觸液神經(jīng)元”。2.2er陽(yáng)性神經(jīng)元ER陽(yáng)性神經(jīng)元在下丘腦諸核團(tuán)的表達(dá)不及NOS陽(yáng)性神經(jīng)元廣泛,主要分布在下丘腦視上核,室旁核和下丘腦外側(cè)區(qū),此外在室周核和大腦皮質(zhì)也見(jiàn)到少量散在分布的ER陽(yáng)性神經(jīng)元。ER陽(yáng)性神經(jīng)元呈棕黃色,胞核著色,胞質(zhì)不著色。視上核的ER陽(yáng)性神經(jīng)元多呈卵圓形,突起不明顯,偶可見(jiàn)較短突起。少數(shù)細(xì)胞著色較深,絕大多數(shù)著色較淺,但細(xì)胞輪廓清晰,分布較密集(圖2)。室旁核內(nèi)的ER陽(yáng)性神經(jīng)元也有較強(qiáng)的表達(dá)與分布。細(xì)胞分布均勻,著色淺,輪廓清晰。在小細(xì)胞部,ER陽(yáng)性神經(jīng)元呈梭形或卵圓形,細(xì)胞突起不明顯。此外,在下丘腦外側(cè)區(qū)以及大腦皮質(zhì)有少數(shù)ER陽(yáng)性神經(jīng)元,其中大腦皮質(zhì)處ER陽(yáng)性神經(jīng)元呈錐形,突起明顯,著色較深。下丘腦外側(cè)區(qū)ER陽(yáng)性神經(jīng)元多呈卵圓形,突起明顯,著色較深。2.3雙染神經(jīng)元胞體及形態(tài)NOS與ER雙染神經(jīng)元主要分布在下丘腦的室旁核、視上核、下丘腦外側(cè)區(qū)及室周核。其他區(qū)域可見(jiàn)到散在分布的雙染神經(jīng)元。在視上核,低倍鏡下可見(jiàn)藍(lán)染的NOS陽(yáng)性神經(jīng)元和散在其中的淡染的呈棕黃色的ER陽(yáng)性神經(jīng)元以及大量的雙染陽(yáng)性神經(jīng)元。NOS和ER雙染神經(jīng)元胞質(zhì)呈藍(lán)色,胞核呈棕黃色。高倍鏡下,NOS神經(jīng)元著色深,呈藍(lán)或藍(lán)黑色,密集成簇,胞體上發(fā)出的突起清晰可見(jiàn)。少數(shù)細(xì)胞突起較長(zhǎng),直徑較粗,多伸向視交叉腹側(cè),與遠(yuǎn)端的雙染神經(jīng)元突起交織在一起,可見(jiàn)明顯的“串珠”樣外觀(圖3A)。ER神經(jīng)元著色淡,多散在分布,胞體多呈梭形或橢圓形,可見(jiàn)到有突起發(fā)出,但數(shù)目不多,偶可見(jiàn)到突起相互交織。雙染神經(jīng)元胞核呈棕黃色,有的透亮,胞質(zhì)藍(lán)染,細(xì)胞多呈梭形或橢圓形,突起明顯,呈“串珠”樣外觀。在少數(shù)雙染的陽(yáng)性神經(jīng)元中,還可見(jiàn)到胞核內(nèi)深染的核仁(圖3B)。視上核雙染神經(jīng)元胞體較大,直徑達(dá)20μm左右,多為大細(xì)胞型神經(jīng)元。NOS及ER雙染陽(yáng)性神經(jīng)元多位于視上核的背外側(cè)和背內(nèi)側(cè)部。在視上核內(nèi)雙染神經(jīng)元占70%～80%。在室旁核,雙染神經(jīng)元在小細(xì)胞部腹內(nèi)側(cè)區(qū)分布較密集,在大細(xì)胞部后外側(cè)區(qū)呈散在分布。雙染神經(jīng)元胞質(zhì)染成深藍(lán)色,胞核呈棕黃色,也有少數(shù)細(xì)胞胞質(zhì)著色淺,胞核顯得較大。神經(jīng)元突起較視上核短粗,分支較多,在一些區(qū)域可見(jiàn)突起交織成叢,也可見(jiàn)到“串珠”樣外觀(圖3C)。在小細(xì)胞部腹內(nèi)側(cè)區(qū)雙染神經(jīng)元突起多和鄰近的細(xì)胞突起交織在一起,不易分辨。細(xì)胞呈卵圓形或梭形。在小細(xì)胞處密集的雙染神經(jīng)元間,可見(jiàn)散在分布ER神經(jīng)元,細(xì)胞輪廓清晰,呈卵圓形或橢圓形,突起不明顯,胞體截面與視上核相似或略小。NOS陽(yáng)性神經(jīng)元突起明顯且長(zhǎng),也多與鄰近細(xì)胞交織在一起。它們的突起多伸向第三腦室。也可見(jiàn)到“串珠”樣外觀。小細(xì)胞部雙染神經(jīng)元占80%～90%以上。在大細(xì)胞部后外側(cè)區(qū)見(jiàn)到少數(shù)散在的雙染神經(jīng)元,胞體直徑較大,胞核與胞質(zhì)之比大于小細(xì)胞部,胞核內(nèi)可見(jiàn)濃染的核仁,細(xì)胞的截面呈橢圓形,突起不明顯。在下丘腦外側(cè)區(qū),NOS與ER雙染神經(jīng)元表達(dá)較強(qiáng),且分布較廣。細(xì)胞形態(tài)多為橢圓形或卵圓形,突起明顯,雙染神經(jīng)元突起多,伸向遠(yuǎn)處,胞核較大呈棕黃色,核仁清晰可見(jiàn),核/質(zhì)比大(圖3D)。ER陽(yáng)性神經(jīng)元的胞體較大,多呈梭形,胞核著色深,無(wú)明顯突起。NOS陽(yáng)性神經(jīng)元多散在分布,在視上核、室旁核和下丘腦外側(cè)區(qū)3個(gè)核團(tuán)中所占比例最少,但突起較長(zhǎng)。在室周核,可見(jiàn)零散分布的雙染神經(jīng)元,多為卵圓形,胞核偏于一側(cè),棕黃色淡染,胞質(zhì)著色深,突起伸向遠(yuǎn)端,多與遠(yuǎn)側(cè)NOS神經(jīng)元交錯(cuò)。3討論3.1采用20d細(xì)胞體外培養(yǎng)國(guó)內(nèi)外資料顯示,雌激素在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)有一個(gè)廣泛的生理學(xué)效應(yīng),這些效應(yīng)是通過(guò)NO介導(dǎo)和影響的。資料表明,NO在雌激素對(duì)神經(jīng)組織的作用上是一個(gè)很重要的介質(zhì)。研究進(jìn)一步顯示,在人的SK-N-SH細(xì)胞體外培養(yǎng)中顯示雌二醇(E2)能誘導(dǎo)NO產(chǎn)生,并且E2是通過(guò)活化原發(fā)性一氧化氮合酶(cNOS)而產(chǎn)生NO的,這個(gè)過(guò)程受細(xì)胞內(nèi)外Ca2+調(diào)控。NO是雌激素作用ER后,產(chǎn)生的第二信使,從而介導(dǎo)和完成了雌激素的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在下丘腦室旁核、室上核、室周核、下丘腦外側(cè)區(qū)均可見(jiàn)NOS與ER雙染神經(jīng)元,為NO介導(dǎo)雌激素受體的作用提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。3.2nos與er神經(jīng)元的調(diào)節(jié)室旁核的神經(jīng)元可分為大細(xì)胞和小細(xì)胞兩種分泌神經(jīng)元。大細(xì)胞分泌OT和VP。視上核主要含有大細(xì)胞分泌神經(jīng)元,主要分泌的也是OT和VP。國(guó)外研究表明NOS與VP和OT神經(jīng)元分布有共存。在成年大鼠下丘腦神經(jīng)垂體系統(tǒng)中NADPH-d可與OT及VP共存,NO能調(diào)節(jié)VP和OT的釋放。在等滲、有效循環(huán)血量正常時(shí),NO抑制OT和VP的分泌;當(dāng)失血、脫水、血容量減少時(shí),NO對(duì)VP神經(jīng)元抑制作用減弱,而對(duì)OT神經(jīng)元抑制卻加強(qiáng)了。其作用機(jī)制是優(yōu)先釋放VP,對(duì)抗或代償身體水分的失衡。在去勢(shì)大鼠,45%～98%的OT與88%～99%的VP神經(jīng)元含有ERβ受體,ERβ和VP神經(jīng)元共存于視上核背外側(cè)部、室旁核大細(xì)胞部后外側(cè)區(qū)。ERβ與OT神經(jīng)元主要分布于室旁核內(nèi)。在高滲狀態(tài)下ERβmRNA表達(dá)下降,同時(shí)ERβ也下降,表明ERβ對(duì)滲透壓改變呈負(fù)相關(guān)?？梢钥闯?NO和ER對(duì)OT和VP的分泌都起到了調(diào)控的作用,兩者對(duì)VP的調(diào)節(jié)都呈負(fù)向的調(diào)節(jié)。有報(bào)道表明,睪酮、雙氫睪酮、皮質(zhì)醇同樣可以抑制因滲透壓改變引起的VP釋放,類固醇激素對(duì)因滲透壓改變引起的VP釋放的抑制作用很可能是通過(guò)興奮性氨基酸(谷氨酸)來(lái)介導(dǎo)完成的。NOS與谷氨酸受體在下丘腦神經(jīng)垂體軸及室周器分布廣泛,γ-氨基丁酸對(duì)大細(xì)胞型神經(jīng)分泌細(xì)胞的神經(jīng)支配在此處也較廣。其機(jī)制為谷氨酸通過(guò)與N-methyl-D-aspartate(NMDA)型谷氨酸受體結(jié)合后使NO釋放,進(jìn)而使γ-氨基丁酸能神經(jīng)元活性增加,抑制大細(xì)胞型神經(jīng)分泌細(xì)胞分泌OT和VP。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,NOS與ER神經(jīng)元在室旁核和視上核共存,主要分布在視上核的背內(nèi)側(cè)、背外側(cè)部,室旁核的大細(xì)胞部后外側(cè)區(qū),此處的大細(xì)胞正是分泌OT和VP神經(jīng)元處。我們推測(cè)ER對(duì)OT和VP的調(diào)節(jié)是通過(guò)NO來(lái)實(shí)現(xiàn)的。3.3no、er雙染神經(jīng)元/gnrh表達(dá)GnRh神經(jīng)元在下丘腦內(nèi)分布較分散,主要分布在室周核、弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核、室旁核小細(xì)胞部腹內(nèi)側(cè)區(qū)、視上核等。雌激素對(duì)GnRh釋放神經(jīng)元除了有負(fù)反饋調(diào)節(jié)外,也展示了一個(gè)積極的正反饋調(diào)節(jié),進(jìn)而促使LH釋放和排卵作用。國(guó)外研究資料表明GnRh上有ERβ受體,在GnRh神經(jīng)元中有g(shù)alanin蛋白表達(dá),galanin是促GnRh釋放因子。雌激素可通過(guò)與其受體結(jié)合促進(jìn)galanin蛋白表達(dá)進(jìn)而調(diào)控GnRh釋放,而galanin與NOS共存,提示兩者在促GnRh釋放上聯(lián)系緊密。NO在應(yīng)激和神經(jīng)內(nèi)分泌中有重要作用,NO參與了性行為和GnRh/LH的釋放。在去勢(shì)鼠給予雌激素治療后,腹內(nèi)側(cè)核的腹外側(cè)區(qū)NADPH-d(NOS)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目增多,可見(jiàn),NO參與和介導(dǎo)了雌激素對(duì)GnRh作用。本實(shí)驗(yàn)觀測(cè)到:NOS與ER雙染神經(jīng)元存在于室周核及室旁核小細(xì)胞部腹內(nèi)側(cè)區(qū),正是GnRh神經(jīng)元分布所在部位。ERβ和NOS共存于一個(gè)細(xì)胞,從形態(tài)學(xué)上顯示雌激素對(duì)GnRh釋放的調(diào)控是通過(guò)NO介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。有學(xué)者通過(guò)下丘腦基底內(nèi)側(cè)核體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明,用E2治療后促使GnRh的釋放是由NO介