谷氨酸脫羧酶67-綠色熒光蛋白基因敲入小鼠異丙酚后誘導(dǎo)ga-ba能神經(jīng)元活化的研究

谷氨酸脫羧酶67-綠色熒光蛋白基因敲入小鼠異丙酚后誘導(dǎo)ga-ba能神經(jīng)元活化的研究

異丙醇是一種廣泛使用的靜脈全身麻醉劑。其主要理氣效果之一是意識的消失，但也是對其中心功能位置和機(jī)制的研究的階段。GABA能神經(jīng)元傳遞是腦內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)傳遞之一,對意識活動的調(diào)節(jié)有著關(guān)鍵作用。有大量研究表明異丙酚等多種全麻藥物對突觸后膜上的GABAA受體敏感,通過增強(qiáng)其活性達(dá)到增強(qiáng)抑制性突觸后傳遞,這可能是全身麻醉藥的主要作用位點(diǎn)之一。然而異丙酚是否也對突觸前的GABA能神經(jīng)元產(chǎn)生直接作用,目前尚不明確。材料和方法1.只,男性,體重成年GAD67-GFP基因敲入小鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部解剖學(xué)教研室提供)20只,雌雄不拘,體重18～20g。實(shí)驗(yàn)組(n=15)小鼠腹腔注射異丙酚130mg/kg,分別在注射后5min,30min,1h進(jìn)行行為學(xué)評分和形態(tài)學(xué)觀察,對照組(n=5)腹腔注射相等體積量的生理鹽水。2.行為觀察小鼠按上述分組分別腹腔注射異丙酚和生理鹽水,在注射后5min,30min和1h時按表1的評分細(xì)則逐一評分并計算總分。3.小鼠免疫總免疫后抗體fosg-b-trs-4-臨床行為學(xué)觀察后用0.4%戊巴比妥鈉深麻小鼠,打開胸腔,插管至左心室,先以20ml生理鹽水沖洗血液,再用100ml含4%多聚甲醛和0.2%苦味酸的0.1mol/L磷酸緩沖液(PB,pH7.4)灌注固定。灌畢立即取腦,置于上述新鮮固定液中后固定4～6h,再移入含30%蔗糖的PB中至組織塊沉底(4℃)。將全腦用恒冷箱作連續(xù)冠狀切片,片厚30μm,隔5張取一張,分4套收集。從每只實(shí)驗(yàn)小鼠全腦切片中挑選一套進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。具體步驟如下:(1)切片放入小鼠抗FosIgG(1∶1000,Abcam)4℃過夜;(2)切片放入生物素化的驢抗小鼠IgG(1∶500)室溫孵育6～8h;(3)入A,B復(fù)合液(A液,B液以1∶200加入0.05mol/LPBS,反應(yīng)30min)反應(yīng)2h;(4)入DAB液(5mgDAB,40ml0.05mol/LTris-HCl,反應(yīng)5min)反應(yīng)5min;(5)逐滴加入0.03%H2O2,直至鏡下見Fos表達(dá),背底不深為宜;(6)蒸餾水洗片,終止反應(yīng);(7)裱片后脫水,脫色,中性樹膠封片,顯微鏡(Olympus)下觀片,參照Paxinos小鼠腦片圖譜光鏡下觀察并采集圖像。上述抗體和復(fù)合物的稀釋液均用含0.3%的TritonX-100和0.5%正常羊血清的PBS,各步驟之間均用PBS徹底清洗切片。4.小鼠與兔血清pbs的制備取第二套切片進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)組織化學(xué)染色。具體過程簡述如下:(1)切片放入小鼠抗Fos(1∶1000)和兔抗GFP(0.5μg/ml抗體,4℃過夜;(2)切片放入生物素化的驢抗小鼠IgG(1∶500)和Alexas488標(biāo)記的驢抗兔IgG(1∶500),室溫孵育4～6h;(3)入avidin標(biāo)記的Alexas594(1∶1000)室溫孵育1～3h。上述抗體和復(fù)合物的稀釋液均用含0.3%的TritonX-100和0.5%正常羊血清的PBS,各步驟之間均用PBS徹底清洗片子。最后裱片,避光干燥,封片,熒光顯微鏡(BX51;Olympus)觀察攝片。5.陽性細(xì)胞計數(shù)在保證各組間各核團(tuán)計數(shù)平面相同的情況下,使用Image2ProPlus6.0分析軟件對10×20倍光鏡所采集圖像進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù),每個部位記錄4～5個平面后取平均值。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)(xˉ±s)表示,通過SPSS12.0對組間均數(shù)進(jìn)行單因素方差分析(onewayANOVA),P<0.05視為有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果1.不規(guī)律物理檢驗(yàn)腹腔注射生理鹽水后,小鼠意識清醒,活動沒有受限。與此相比在腹腔注射異丙酚5min后,小鼠即以意識消失,無有意識的活動,對外界刺激的反應(yīng)降低,通常伴有不規(guī)律的抽搐。30min時,狀態(tài)更為平穩(wěn),對外界刺激的反應(yīng)更低,肌肉張力低,很少見到抽搐。1h時,仍處于無意識狀態(tài),但肌張力有一定恢復(fù),?？梢姴灰?guī)律抽搐,對刺激的反應(yīng)增高。各組行為學(xué)評分結(jié)果如表2。2.fos陽性細(xì)胞的表達(dá)Fos免疫組織化學(xué)染色顯微鏡照片顯示如Fig.1和各腦區(qū)Fos免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性的細(xì)胞數(shù)的差異經(jīng)t檢驗(yàn)如表3所示。我們發(fā)現(xiàn)Fos陽性的細(xì)胞主要出現(xiàn)在以下5個區(qū)域:海馬CA1區(qū)、丘腦室旁核(PV)、下丘腦室旁核(PaV)、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核(VMH)、杏仁核(MeA)。此外在額頂皮質(zhì)、嗅球外叢狀層(EPI)、齒狀回(DG)、導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PaG)也有表達(dá)。各腦區(qū)Fos-IL的細(xì)胞數(shù)(個/mm2)如表4。3.gfp/fos共存隨后我們對Fos陽性的各腦區(qū)進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)的染色,來研究GABA與Fos的共存情況如表4所示。在下丘腦腹內(nèi)側(cè)核(VMH)我們發(fā)現(xiàn)有大量的GFP與Fos共存,如Fig.2。其共存率(共存率=GABA-Fos-IL數(shù)/Fos-IL數(shù))為:5min:80.3%,30min:89.7%,1h:91.6%,C:24.9%。此外,在下丘腦室旁核也可見GABA與Fos共存,共存率為:5min:19.6%,30min:39.7%,1h:41.6%,C:8.6%。異丙酚對gaba能神經(jīng)元胞體的激活作用我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在小鼠腹腔給予大劑量異丙酚后,在行為學(xué)方面對小鼠的運(yùn)動(反正反射、姿勢調(diào)節(jié))和感覺(夾足,夾尾反應(yīng))都受到了明顯的抑制,處于中度或深度麻醉狀態(tài)。此時,全腦的Fos表達(dá)主要出現(xiàn)在海馬CA1區(qū)、丘腦室旁核(PV)、下丘腦室旁核(PaV),下丘腦腹內(nèi)側(cè)核(VMH)、杏仁核(MeA)。免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示,在下丘腦腹內(nèi)側(cè)核有大量的GABA能神經(jīng)元與Fos共存,此外在下丘腦室旁核也有較高的共存率。以往的研究表明,全身麻醉藥物主要作用于中樞突觸密集的區(qū)域。其中包括突觸前機(jī)制和突觸后機(jī)制。盡管目前還沒有證據(jù)顯示異丙酚的特異性中樞作用靶位,但人們的觀點(diǎn)還是主要集中在皮層、海馬、丘腦等一些麻醉藥物敏感區(qū)域。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,異丙酚對突觸后膜的GABAA受體有直接的作用,增強(qiáng)Cl-電流,從而增強(qiáng)GABA誘導(dǎo)的抑制性突觸后電流(IPSC),由此產(chǎn)生超極化作用。Hara等應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察分離的大鼠海馬錐形神經(jīng)元細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)給予GABA可誘發(fā)錐形神經(jīng)元內(nèi)向電流(細(xì)胞超極化),而給予丙泊酚(10μmol/L)增大這一內(nèi)向電流并使GABA的濃度-反應(yīng)曲線左移,說明臨床濃度的丙泊酚增強(qiáng)了哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制性GABAA受體調(diào)節(jié)的反應(yīng)。這種增強(qiáng)作用可導(dǎo)致神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)興奮性的降低,有助于臨床麻醉。但很少有對異丙酚在突觸前的GABA能神經(jīng)元形態(tài)學(xué)方面的研究,主要是因?yàn)镚ABA能神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)染色比較困難,其遞質(zhì)GABA在胞體產(chǎn)生后很短的時間內(nèi)就被轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)終末,胞體內(nèi)含量極低。我們所運(yùn)用的GAD67-GFP基因敲入小鼠,正是利用了GABA合成所需的限速酶-谷氨酸脫羧酶67,結(jié)合綠色熒光蛋白,特異的將GABA能神經(jīng)元胞體呈現(xiàn)綠色熒光。我們既往應(yīng)用PET技術(shù)觀察到,健康志愿者在靜脈持續(xù)輸注異丙酚達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)時,丘腦、大腦皮層、海馬和小腦等區(qū)域葡萄糖能量代謝均受到明顯抑制,其中以丘腦抑制最為顯著,表明丘腦可能是異丙酚致意識消失的關(guān)鍵靶位,這些區(qū)域?qū)σ庾R的覺醒與消失起決定作用。我們的結(jié)果中所顯示的活化區(qū)域與這些區(qū)域都有特異或非特異的映射關(guān)系。而我們發(fā)現(xiàn)在這些活化的神經(jīng)元中有很高比例是GABA能神經(jīng)元,表明這些神經(jīng)元的活化對意識起關(guān)鍵作用的這些腦區(qū)起到了一定的抑制作用。Shirasaka通過膜片鉗技術(shù)研究了異丙酚對大鼠下丘腦室旁核神經(jīng)元(PVN)的作用。研究者指出,異丙酚可以在中樞水平加強(qiáng)GABAA受體介導(dǎo)的電流并抑制電壓門控Ca2+通道,可能影響了心血管和交感神經(jīng)系統(tǒng),至少部分與全麻所導(dǎo)致的低血壓有關(guān)。下丘腦腹內(nèi)側(cè)核與發(fā)作性睡眠強(qiáng)食征有關(guān),表現(xiàn)為不可控制地發(fā)作性睡眠,每次睡眠持續(xù)數(shù)小時甚至數(shù)天,醒后暴飲暴食,食量增加,多伴有肥胖。根據(jù)我們的結(jié)果再注射異丙酚后下丘腦腹內(nèi)側(cè)核中有91.6%的活化神經(jīng)元為GABA能神經(jīng)元,我們可以推斷其導(dǎo)致的發(fā)作性睡眠與其中大量的GABA能神經(jīng)元的活動有相當(dāng)?shù)年P(guān)系。還有研究表明下丘腦腹內(nèi)側(cè)核是杏仁核中樞升壓機(jī)制的一部分。上述研究表明異丙酚可能通過作用于這些區(qū)域的相應(yīng)的神經(jīng)元,大多數(shù)為GABA能神經(jīng)元,以達(dá)到降低血壓和意識消失的作用。而在丘腦室旁核也有大量活化的神經(jīng)元,但這些神經(jīng)元均不是GABA能神經(jīng)元,