異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離篩選及硝化性能研究

異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離篩選及硝化性能研究

廢水生物脫氮是目前水處理領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。對(duì)異硝化及其菌屬的研究是對(duì)傳統(tǒng)硝化理論的豐富和進(jìn)步。與一種誘導(dǎo)的異硝化菌相比，某些異桿菌的分解率很低，但由于環(huán)境中的數(shù)量和生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過自桿菌，因此在某些環(huán)境中，異桿菌的貢獻(xiàn)可以達(dá)到與自桿菌競(jìng)爭(zhēng)的水平。關(guān)于異硝化的異構(gòu)化，許多機(jī)制沒有得到解釋，一些現(xiàn)象的解釋是不完整和不完整的，但異桿化的作用的重要性越來越受到關(guān)注。本文在膜生物反應(yīng)器(MembraneBioreactor,MBR)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定高效同步硝化反硝化(SimultaneousNitrificationandDenitrification,SND)效果的基礎(chǔ)上,采用將傳統(tǒng)微生物學(xué)方法與現(xiàn)代分子生物學(xué)手段相結(jié)合的新型異養(yǎng)硝化細(xì)菌分離篩選方法,對(duì)系統(tǒng)中異養(yǎng)硝化細(xì)菌進(jìn)行了分離篩選,通過生理生化實(shí)驗(yàn)、16SrDNA序列分析,對(duì)分離篩選獲得菌株進(jìn)行了分析.同時(shí)采取批式實(shí)驗(yàn)對(duì)分離菌株的異養(yǎng)硝化性能進(jìn)行了進(jìn)一步的試驗(yàn)研究,為開發(fā)設(shè)計(jì)新的脫氮工藝,提高脫氮效率,提供一定理論及技術(shù)基礎(chǔ).1材料和方法1.1該菌株的來源取自運(yùn)行穩(wěn)定且具有80.1%SND效果的MBR系統(tǒng).1.2異醇硝化細(xì)菌的分離與篩選1.2.1隔離電池牛肉膏-蛋白胨固體培養(yǎng)基,其配方為:牛肉膏10g·L-1,蛋白胨10g·L-1,NaCl5g·L-1,瓊脂15~20g·L-1.1.2.2調(diào)控棉田花粉的制備吸取MBR中活性污泥20mL加入到盛有180mL的無菌蒸餾水和玻璃珠(分散用)的500mL三角瓶中,塞上滅菌的棉花塞,于恒溫振蕩器上以100r·min-1轉(zhuǎn)速30℃下振蕩10h,而后進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋至10-10.1.2.3菌種的培養(yǎng)、三種方法在制備好的牛肉膏-蛋白胨固體培養(yǎng)基上,從各個(gè)稀釋度的稀釋液里均取0.1mL分別稀釋涂布至固體平板上(每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)),于生化培養(yǎng)箱30℃下培養(yǎng).在形成菌落的平板內(nèi),挑選出大約100個(gè)單菌落的平板.將單菌落用接種環(huán)挑出,劃線分離.待形成菌落后,再用接種環(huán)移植到固體培養(yǎng)基上,30℃條件下培養(yǎng),然后挑取一接種環(huán)的細(xì)菌菌苔放到無菌水中,充分振蕩.用此細(xì)菌懸液,按照活菌數(shù)測(cè)定方法在平板上涂布,使其在培養(yǎng)皿上形成30~50個(gè)單菌落,而后把單菌落按照上述方法再挑菌一次,反復(fù)2~3次.并以不接菌的平板做空白對(duì)照.1.2.4硝化活性鑒定將牛肉膏-蛋白胨固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的純菌菌苔用接種環(huán)挑取適量接種于氨氧化能力鑒定培養(yǎng)基:葡萄糖5g·L-1,(NH4)2SO40.5g·L-1,NaCl0.3g·L-1,K2HPO41.0g·L-1,MgSO4·7H2O0.3g·L-1,FeSO4·7H2O0.03g·L-1,CaCO37.5g·L-1,30℃條件下振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)期間每隔3d取2mL培養(yǎng)液至潔凈試管,將格利斯試劑1~2滴直接點(diǎn)滴入試管中進(jìn)行硝化活性確認(rèn),并以不接純化菌株的氨氧化能力鑒定培養(yǎng)基作空白對(duì)照.如現(xiàn)紅色乃至褐色,則說明由于硝化作用而積蓄了亞硝酸鹽.2~3min后再在未顯色的試管中加入鋅粉少許,靜置,觀察是否呈現(xiàn)紅色.如加入鋅粉后顯紅色,則說明培養(yǎng)液中的產(chǎn)生了硝酸鹽.即菌株也具有硝化活性,初步確認(rèn)為硝化活性菌.1.3gtga檢測(cè)本文根據(jù)自養(yǎng)硝化細(xì)菌16SrRNA序列設(shè)計(jì)的探針Nso1225(CGCCATTGTATTACGTGTGA)為變形細(xì)菌β-proteobacteria類的通用探針;探針NIT3(CCTGTGCTCCATGCTCCG)可檢測(cè)出Nitrobacter類的硝化桿菌.使用的探針EUB338(GCTGCCTCCCGTAGGAGT)為樣品總菌數(shù)的檢測(cè),以確保樣品中有足夠檢出量的rRNA.具體檢測(cè)過程如下.1.3.1含分離菌回復(fù)突變液的制備在60℃水浴中向3×PBS溶液中加入多聚甲醛,0.2μm濾頭的針筒過濾.將含分離菌的混合培養(yǎng)液0.5mL加入到1.0mL以上固定液中.在4℃下15000r·min-1離心10min,棄上清液,PBS洗滌2次,離心.準(zhǔn)確加入1mLPBS與99.5%的乙醇(體積分?jǐn)?shù)1∶1)溶液.1.3.2熒光共焦激光掃描顯微觀察樣品用超聲波儀清洗后,取上清液置于1.5mL的離心管,用PBS稀釋一定倍數(shù)振動(dòng)后將適量菌液滴加到涂有明膠的載玻片上,用吹風(fēng)機(jī)(冷檔)吹干.依次用50%、80%、98%的乙醇水溶液脫水,在冰浴中用溶菌酶溶液處理,再用乙醇水溶液脫水,空氣中干燥.將探針加入雜交緩沖液中,46℃下雜交2h,然后用洗滌緩沖液洗滌,空氣中風(fēng)干.將風(fēng)干后的樣品立即用熒光共焦激光掃描顯微鏡(TCS4D;LeicaLasertechnik,Germany)進(jìn)行觀察,并將觀察的圖片拍攝(樣品送至日本國(guó)立環(huán)境研究所完成檢測(cè)).1.4分離菌種的篩選為了研究分離篩選的純化菌株在好氧條件下的硝化能力,進(jìn)行了氮軌跡跟蹤試驗(yàn).實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用培養(yǎng)基的具體配比見表1.首先在無菌條件下取30mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)菌液以4000r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10min,去除上清液,用無菌水沖洗后再離心,反復(fù)3次,最后用無菌水配成5mL的菌懸液.將此菌懸液加入上述不同碳源和氮源的培養(yǎng)基中,于35℃±2℃回旋式氣浴恒溫振蕩器上振蕩培養(yǎng),恒定轉(zhuǎn)速110r·min-1.每隔一定時(shí)間取出一定量的溶液,經(jīng)過濾預(yù)處理后,測(cè)定濾過液COD、NH+4-N、NO-2-N、NO-3-N、TN等指標(biāo)的變化,實(shí)驗(yàn)期間pH值用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至8.0左右.所有結(jié)果均以不接種細(xì)菌的經(jīng)滅菌的混合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基作對(duì)照,以了解分離菌株的異養(yǎng)硝化效果.在實(shí)驗(yàn)過程中,為了確定實(shí)驗(yàn)混合液是否被雜菌污染,每周培養(yǎng)后將培養(yǎng)菌在平板上涂布以確定其是否純化.另外,為了將D600值與混合液中細(xì)菌數(shù)量相對(duì)應(yīng),用血小板計(jì)數(shù)法對(duì)一系列不同D600值的細(xì)菌數(shù)目進(jìn)行了兩者之間關(guān)系的擬合,得到D600值與血小板計(jì)數(shù)結(jié)果之間的關(guān)系.2結(jié)果與討論2.1革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)初始由MBR系統(tǒng)混合菌群中分離得到281株細(xì)菌,在對(duì)其硝化性能驗(yàn)證后從中篩選出能夠產(chǎn)生NO-x-N的菌株39株,截止目前對(duì)其中2株菌株進(jìn)行了硝化性能實(shí)驗(yàn)研究,分別編號(hào)為B1及B2,并分別進(jìn)行了相關(guān)的細(xì)菌學(xué)鑒定以及生理生化試驗(yàn)研究,結(jié)果如下.菌株B1在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)1~2d后形成的菌落呈乳白色,不透明,革蘭氏陽性芽孢桿菌,細(xì)菌大小為(0.5~0.6)μm×(1.6~2.6)μm(見圖1),具球桿變化周期,60℃不生長(zhǎng),不具抗酸性.接觸酶陽性,V-P試驗(yàn)陰性,淀粉水解陰性,厭氧洋菜不生長(zhǎng),葡萄糖不產(chǎn)酸,除個(gè)別生理生化特征(可利用葡萄糖做有機(jī)碳源等)外,其主要特征與Bacillusmacroides基本一致.菌株B2在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)1d后形成的菌落呈乳白色偏灰,不透明,細(xì)菌大小為(0.4~0.6)μm×(1.2~2.1)μm(見圖2),具球桿變化周期.革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)中,菌株在培養(yǎng)初期為呈陽性的芽孢桿菌,但革蘭氏染色不穩(wěn)定,在生長(zhǎng)至7d左右染色卻呈陰性,且菌落變至褐色.60℃不生長(zhǎng),不具抗酸性.接觸酶陽性,V-P試驗(yàn)陽性,淀粉水解陰性,厭氧洋菜不生長(zhǎng),葡萄糖產(chǎn)酸,除個(gè)別生理生化特征(不具抗酸性,不在銨態(tài)氮上生長(zhǎng))外,其主要特征與短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)基本一致.2.2探針的選擇從樣品的熒光原位雜交結(jié)果來看,在樣品中有足夠檢出量的rRNA的條件下(見用探針EUB338的結(jié)果,圖3及圖4所示),用針對(duì)變形細(xì)菌β-proteobacteria類的通用探針Nso1225(CGCCATTGTATTACGTGTGA)及檢測(cè)Nitrobacter類的硝化桿菌探針NIT3(CCTGTGCTCCATGCTCCG)均未有自養(yǎng)硝化細(xì)菌檢出.探針的選擇依據(jù):自養(yǎng)型氨氧化細(xì)菌分布在5個(gè)屬中,其中除了Nitrosococcus屬的一部分菌株外,均屬于β-proteobacteria,根據(jù)所分離細(xì)菌的形態(tài)學(xué)分析,菌株B1及B2屬于桿菌屬,形態(tài)與Nitrosococcus屬(球狀至橢球狀)相差較大,因此選用針對(duì)β-proteobacteria的特異探針Nso1225;自養(yǎng)型亞硝酸氧化細(xì)菌分別在4個(gè)屬中,其中Nitrobacter屬及Nitrospira屬均可異養(yǎng)生長(zhǎng),根據(jù)所分離細(xì)菌的形態(tài)學(xué)分析,菌株B1及B2呈桿狀,與Nitrospira屬(疏松螺旋狀)相差較大,因此選取針對(duì)Nitrobacter屬的NIT3探針進(jìn)行檢驗(yàn).試驗(yàn)結(jié)果顯示,在應(yīng)用上述探針進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)中,并沒有檢測(cè)出目標(biāo)菌株的存在,此試驗(yàn)結(jié)果排除了所分離細(xì)菌為自養(yǎng)硝化細(xì)菌的可能,此類研究在國(guó)內(nèi)外的報(bào)道甚少,本文后續(xù)對(duì)分離的純化菌株進(jìn)行了16SrDNA序列分析.2.31bacillussp.ly和brevibacillussp.ly的16srrna擴(kuò)增和鑒定菌株B116SrRNA基因序列與Bacillussp.ZYM16SribosomalRNAgene相似性最高,達(dá)到為99.7%,與另外4株菌株:BacillusfusiformisstrainZ1,BacillusmacroidesstrainLMG18474,Bacillussp.TUT1008以及BacillusfusiformisstrainS10的相似性也在99%以上.菌株B1在GenBank中名稱為Bacillussp.LY,其16SrRNA基因序列的登錄號(hào)為AY787805.菌株B216SrRNA基因序列與BrevibacillusinvocatusstrainLMG1816716SribosomalRNAgene相似性最高,達(dá)到99.7%,與另外4株菌株:Brevibacillussp.R-6774,Brevibacillusinvocatusgene,BrevibacillusinvocatusstrainLMG18962以及Brevibacillussp.R-7745的相似性分別為99.6%,99.1%,98.9%及98.9%.菌株B2在GenBank中名稱為Brevibacillussp.LY,其16SrRNA基因序列的登錄號(hào)為AY873841.上述菌株均未見有關(guān)異養(yǎng)硝化方面的研究與報(bào)道,本研究中分離的菌株Bacillussp.LY及Brevibacillussp.LY屬于新分離得到的新型異養(yǎng)硝化細(xì)菌2.4菌株的脫氮及硝化作用在采用葡萄糖-氯化銨做碳源及氮源檢驗(yàn)微生物硝化性能時(shí),經(jīng)過24d的好氧培養(yǎng),系統(tǒng)中Bacillussp.LY及Brevibacillussp.LY2株細(xì)菌對(duì)COD,TN及NH+4-N的平均去除率的去除率如表2所示.表2數(shù)據(jù)顯示,經(jīng)過24d好氧培養(yǎng),在Bacillussp.LY及Brevibacillussp.LY的作用下,COD及總氮(TN)濃度均呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì),證實(shí)了這2株細(xì)菌具有可利用有機(jī)物及良好的脫氮性能,系統(tǒng)中Bacillussp.LY及Brevibacillussp.LY2株細(xì)菌對(duì)COD的去除率分別為:71.7%和52.6%,說明Bacillussp.LY和Brevibacillussp.LY可利用有機(jī)物進(jìn)行異化分解和同化合成,具有異養(yǎng)生物的性質(zhì),可以充分利用有機(jī)碳源合成生命體.Bacillussp.LY及Brevibacillussp.LY對(duì)TN的去除率分別為:69.2%和35.6%,結(jié)合表3中2菌株在培養(yǎng)后期COD濃度、菌體數(shù)目、菌體含氮量及反映混合液中細(xì)菌體密度的D600值的變化分析了純化菌株的硝化性能.表3中結(jié)果顯示,在培養(yǎng)的后期,Bacillussp.LY的菌體含氮量由第2d的20.57mg·L-1下降至第24d的8.65mg·L-1,Bacillussp.LY及Brevibacillussp.LY2個(gè)培養(yǎng)上清液中NH+4-N濃度也出現(xiàn)了下降,分別降低了17.21mg·L-1及8.09mg·L-1,因此濾過液中的氨氮濃度的下降顯然不是由于同化合成作用造成的,而是由去除氨氮的另外一個(gè)途徑,硝化作用所引起的.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Bacillussp.LY及Brevibacillussp.LY同化合成作用結(jié)束之后發(fā)生的硝化作用使氨氮的去除效率為63.5%及28.9%.3菌株特征比較(1)采用傳統(tǒng)微生物學(xué)方法與現(xiàn)代分子生物學(xué)手段相結(jié)合的新型異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離篩選方法可以分離篩選獲得異養(yǎng)硝化細(xì)菌.(2)分離篩選得到菌株B1主要特征與Bacillusmacroides基本一致;菌株B2主要特征與(Brevibacillus)基本一致.與分離菌株B1相似性最