絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的電泳制備

項(xiàng)目四、SHMT的電泳制備任務(wù)一、SHMT的電泳制備方案的制定樊貝貝第二組生藥111120114231051、概念中文簡(jiǎn)稱(chēng)：“絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶”英文名稱(chēng)：Serinehydroxymethyltransferase簡(jiǎn)介：它是酶促制備L-絲氨酸的關(guān)鍵酶，在四氫葉酸(THFA)、甲醛及磷酸吡哆醛(PLP)存在下催化甘氨酸生成L-絲氨酸。它的生理學(xué)功能是催化絲氨酸和甘氨酸之間可逆的互換。一、知識(shí)鏈接2、電泳方法根據(jù)支持物的不同，可以分為紙電泳，薄層電泳、薄膜電泳、凝膠電泳、等電聚焦電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳等。3、酶工程領(lǐng)域中采用較多的聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）4、影響電泳的因素：電泳介質(zhì)的PH值，

緩沖液的離子強(qiáng)度，

電場(chǎng)強(qiáng)度，

電滲現(xiàn)象。5、SHMT在光合組織中的生理作用（1）光合作用組織中線粒體GDC／SHMT系統(tǒng)在Gly和Ser分解中起著重要作用（2）SHMT在非光合組織中的生理作用（3)SHMT在根瘤碳流動(dòng)中的作用（4）光呼吸SHMT影響植物對(duì)生物和非生物脅迫的抵抗能力6、SHMT的分離制備的方法電泳法（如：聚丙烯酰胺凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳)定義：利用溶液中帶有不同量的電荷的陽(yáng)離子或陰離子，在外加電場(chǎng)中以不同的遷移速度向電極移動(dòng)，而達(dá)到分離目的的分析方法7、電泳作用：用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸。作用原理：聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。8、電泳形式：（1）非變性聚丙烯酰胺凝膠（2）SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS）非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過(guò)程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開(kāi)。

垂直板電泳槽示意圖加樣聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠為載體的一種區(qū)帶電泳。該凝膠由丙烯酰胺Acr和交聯(lián)劑N，N—甲叉雙丙烯聚酰胺Bis聚合而成。聚丙烯酰胺凝膠電泳利用電泳和分子篩的雙重作用分離物質(zhì)。Acr和Bis單獨(dú)存在或混合在一起時(shí)是穩(wěn)定的，但在具有自由基團(tuán)體系時(shí)就能聚合。引發(fā)自由基團(tuán)的方法有化學(xué)法和光化學(xué)法兩種。二、實(shí)訓(xùn)原理化學(xué)法的引發(fā)劑是過(guò)硫酸胺Ap催化劑是四甲基乙二胺（TEMED）；光化學(xué)法是以光敏感物核黃素來(lái)代替過(guò)硫酸胺，在紫外光照射下引發(fā)自由基團(tuán)。采用不同濃度的Acr、Bis、Ap、TEMED使之聚合，產(chǎn)生不同孔徑的凝膠。因此可按分離物質(zhì)的大小，形狀來(lái)選擇凝膠濃度。1、試劑

分離膠緩沖液（Tris-HCL緩沖液PH8.9）:取1mol/L鹽酸48mL，Tris36.3g,用無(wú)離子水溶解后定容至100mL。濃縮膠緩沖液（Tris-HCl緩沖液PH6.7）:取1mol/L鹽酸48mL,Tris5.98g,用無(wú)離子水溶解后定容至100mL。電泳緩沖液（Tris-甘氨酸緩沖液PH8.3）:稱(chēng)取Tris6g,甘氨酸28.8g,用無(wú)離子水溶解后定容至1L。用時(shí)稀釋10倍。

30％Acr－Bis貯存液：30gAcr,0.8gBis,用無(wú)離子水溶解后定容至100mL,不溶物過(guò)濾去除后置棕色瓶貯于冰箱。TEM10%過(guò)硫酸銨（新鮮配制）；25%蔗糖溶液；0.05%溴酚藍(lán)溶液；7%冰乙酸溶液。染色液：稱(chēng)取考馬斯亮藍(lán)R2502.5g，冰乙酸92ml，甲醇454ml，加去離子水454ml使其完全溶解，過(guò)濾ED；后置棕色瓶保存。脫色液：取甲醇50ml，冰乙酸75ml，加蒸餾水至1000ml。2、材料

SHMT標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)3、器材：

垂直板型電泳槽、天平、

直流穩(wěn)壓電源、

50或100μl微量注射器、

玻璃板、水浴鍋、

染色槽、

燒杯、吸量管膠頭滴管1、安裝垂直板電泳槽（1）