微生物和基因工程

第十章微生物和基因工程基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒(méi)有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)。

淡綠、橘黃、淺紅、金黃……用這些天然彩色蠶繭絲無(wú)需染色而織成色彩斑斕的綢緞，兼具華美外觀和環(huán)保內(nèi)質(zhì)。通過(guò)基因重組法選育高產(chǎn)彩色繭蠶品種獲成功。

玫瑰的栽培歷史可以追溯到5000年前，但通過(guò)色素呈現(xiàn)出藍(lán)色的玫瑰卻從來(lái)沒(méi)有過(guò)。從藍(lán)色三葉草中提取制造藍(lán)色色素的基因，然后注入到玫瑰中，并成功地讓翠雀花素單獨(dú)顯色。

自從分子生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)所有生物的遺傳信息都是由DNA分子攜帶并發(fā)現(xiàn)了基因的密碼后，人們就一直致力于將分子生物學(xué)的這一劃時(shí)代成果用于微生物細(xì)胞的改造，使微生物細(xì)胞能夠積累更多的目標(biāo)產(chǎn)物、合成新的代謝產(chǎn)物及轉(zhuǎn)化原本不能轉(zhuǎn)化的底物或有毒物質(zhì)。通過(guò)科學(xué)家們的不斷努力，基因工程已經(jīng)成了工業(yè)微生物菌種選育的重要手段，正在發(fā)酵工業(yè)中發(fā)揮愈來(lái)愈大的作用?？梢哉f(shuō)工業(yè)微生物遺傳育種取得的重要進(jìn)展是基因工程發(fā)展的基礎(chǔ)之一，現(xiàn)在又為工業(yè)微生物的育種提供了新的、有力的工具。兩者始終存在著十分密切的依賴關(guān)系。基因工程細(xì)胞培養(yǎng)得到的部分蛋白質(zhì)產(chǎn)物A、激素和多肽類產(chǎn)物豬生長(zhǎng)激素增加豬肉產(chǎn)量人胰島素糖尿病促紅細(xì)胞生成素貧血、慢性腎病因子VIII-C血友病人表皮生長(zhǎng)因子創(chuàng)傷愈合、化妝品人生長(zhǎng)激素生長(zhǎng)缺陷心房肽急性阻塞型心臟病牛生長(zhǎng)激素增加牛奶和牛肉產(chǎn)量干擾素-β癌癥、細(xì)菌感染干擾素-γ癌癥、性病、傳染病B、Enzyme(酶)

組織血纖維蛋白溶酶原活化因子急性心肌炎尿激酶心臟病超氧化物歧酶重灌注損傷、腎移植凝乳酶原制造奶酪C疫苗B型肝炎病毒B型肝炎AIDS病毒AIDS口蹄疫病毒口蹄疫白喉病毒白喉瘧疾病毒瘧疾D、Monoclonalantibodies(單克隆抗體)

用于診斷用于腎移植排斥用于骨髓移植排斥用于心臟移植排斥用于肝臟移植排斥用于肺癌和卵巢癌用于敗血病用于結(jié)腸癌基因工程微生物的構(gòu)建包括以下基本步驟：用限制性內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒的特定位點(diǎn)進(jìn)行切割，形成粘性末端；用同樣的限制性內(nèi)切酶對(duì)含有目標(biāo)基因的外源DNA分子進(jìn)行切割，兩端形成與質(zhì)粒上的粘性末端相互補(bǔ)的單鏈；將切割好的質(zhì)粒和基因片段混合并通過(guò)DNA連接酶鍵合在一起完成基因重組并重新成為環(huán)狀分子；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到微生物細(xì)胞內(nèi)。Generalprocessofgeneengineering1.從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNA分子。3.將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。4.從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。

目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩總體技術(shù)路線限制性內(nèi)切酶識(shí)別并在特定位點(diǎn)切開(kāi)DNADNA連接酶 通過(guò)磷酸二酯鍵把兩個(gè)或多個(gè)DNA片段連接成一個(gè)DNA分子分子克隆的載體----具備自主復(fù)制能力的DNA分子（vector），如病毒、噬菌體和質(zhì)粒等小分子量復(fù)制子都可以作為基因?qū)氲妮d體。1973-Boyer,Cohen&ChangTransformE.coliwithrecombinantplasmidStanleyCohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycinresistancegenePlasmidpSC101TetracyclineresistancegeneE.colitransformedwithrecombinantplasmidTransformedcellsplatedontomediumwithkanamycinandtetracyclineOnlycellswithrecombinantplasmidsurvivetoproducecolonies

現(xiàn)代基因工程的創(chuàng)始人P·伯格（美國(guó),1926－）在1960年以敏銳的科學(xué)預(yù)見(jiàn)力提出一個(gè)大膽的設(shè)想：是否可以創(chuàng)造出一種人工方法，把外界的遺傳基因引入動(dòng)物體內(nèi)，以達(dá)到改變遺傳性狀和治療某些疾病的需要呢？1972年，伯格把兩種病毒的DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割后，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來(lái)，于是產(chǎn)生了一種新的重組DNA分子，首次實(shí)現(xiàn)兩種不同生物的DNA體外連接，獲得了第一批重組DNA分子，這標(biāo)志著基因工程技術(shù)的誕生。伯格因此獲得了1980年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1973年，美國(guó)斯坦福大學(xué)教授S·科恩和加州大學(xué)舊金山分校教授H·W·博耶將兩個(gè)不同的質(zhì)粒（一個(gè)是抗四環(huán)素質(zhì)粒，另一個(gè)是抗鏈霉素質(zhì)粒）拼接在一起，組成嵌合質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入大腸桿菌，當(dāng)該重組質(zhì)粒進(jìn)入大腸桿菌體內(nèi)后，這些大腸桿菌能抵抗兩種藥物，而且這種大腸桿菌的后代都具有雙重抗藥性。這表明“雜合質(zhì)?！痹诖竽c桿菌的細(xì)胞分裂時(shí)也能自我復(fù)制。

科恩隨后以DNA重組技術(shù)發(fā)明人的身份向美國(guó)專利局申報(bào)了世界上第一個(gè)基因工程的技術(shù)專利。這標(biāo)志著自然界不同物種間在億萬(wàn)年中形成的天然屏障被打破了，人類可以根據(jù)自己的意愿定向地改造生物的遺傳特性，甚至創(chuàng)造新的生命類型。1977年，吉爾伯特（W·Gilbert）分別將編碼胰島素和干擾素的DNA經(jīng)過(guò)體外重新拼接后，導(dǎo)入大腸桿菌中，分別使大腸桿菌合成了胰島素和干擾素。

基因工程問(wèn)世后的短短30年間，不僅催生了一個(gè)又一個(gè)基因工程的新成果，也催生了一個(gè)源于DNA研究的新興產(chǎn)業(yè)，導(dǎo)致眾多的生命科學(xué)高技術(shù)企業(yè)應(yīng)運(yùn)而生。到2001年年初，美國(guó)生物技術(shù)公司已有1400家，而這一數(shù)字還不包括為數(shù)更多的相關(guān)技術(shù)公司和傳統(tǒng)制藥公司，2000年底美國(guó)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的收入達(dá)到250億美元?？梢院敛豢鋸埖卣f(shuō)，基因工程對(duì)生物、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都產(chǎn)生了革命性的影響，它對(duì)人們生活影響的深度和廣度早已超出了人們的想象。

基因載體的結(jié)構(gòu)和功能生物學(xué)來(lái)源細(xì)菌質(zhì)粒噬菌體病毒其它多個(gè)不同來(lái)源獨(dú)立的元件，包括高等生物的一些基因組元件結(jié)合使用，從而產(chǎn)生了一系列新的基因載體

質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)和功能

大部分為雙鏈閉環(huán)超螺旋DNA分子，也有線性質(zhì)粒，質(zhì)粒的分子規(guī)模從2kb到1mb。質(zhì)粒主要見(jiàn)于細(xì)菌，也見(jiàn)于古細(xì)菌和酵母菌。質(zhì)粒編碼的性狀一般包括抗性特點(diǎn)，如抗生素抵抗，不利環(huán)境抵抗（重金屬抗性），產(chǎn)毒特性和抗毒特性等。從質(zhì)粒本身的特性來(lái)看，質(zhì)粒具備復(fù)制特性，分離特性，判別特性和進(jìn)化特性。基本特性復(fù)制子遺傳標(biāo)記多克隆位點(diǎn)其它許多元件往往只在一定的生物宿主環(huán)境下才表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)的生物學(xué)特點(diǎn)

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plasmidhostSizekbgeometrynumberpUB110Bsubtilis2.3circular20-50ColE1Ecoli6.6c10-30lp25Bburgdorferi24.2linear1-2pNOB8Ssp41.2c2-40FEcoli99.2c1-2SCP1Scoelicolor350l4pSymASmeliloti1354.2c2-3遺傳篩選標(biāo)記

抗生素抗性標(biāo)記抗突變標(biāo)記人工插入失活和α互補(bǔ)標(biāo)記抗生素標(biāo)記

氨芐青霉素抗性（ampr）基因編碼β-內(nèi)酰胺環(huán)水解酶，分泌到細(xì)菌膜周隙水解氨芐青霉素?？敲顾乜剐曰颍╧anr）其決定質(zhì)粒對(duì)氨基糖苷類抗生素的抵抗。在質(zhì)粒在大腸桿菌使用，也用于真核生物體系，作為G418的篩選基因。其基本原理是基因產(chǎn)物氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶對(duì)抗生素的磷酸化滅活。四環(huán)素抗性基因（tetr）編碼一個(gè)300氨基酸的膜蛋白可以妨礙四環(huán)素