淺析HPLC法測定梅花點舌丹中華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量

淺析HPLC法測定梅花點舌丹中華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量【摘要】目的建立梅花點舌丹中藥材蟾酥中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量測定方法。方法采用HPLC法,色譜柱為HypersilODS(250nm×nm)；流動相：乙腈-水(∶)；柱溫：室溫；流速：mL/min；檢測波長為296nm；進樣量20μL。結(jié)果華蟾酥毒基和脂蟾毒配基在～μg/mL、～μg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分值呈現(xiàn)良好線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r分別為8和7,平均回收率分別為%、%,RSD分別為%、%(n=6)。結(jié)論該方法準確、重復(fù)性好,可有效控制該產(chǎn)品的質(zhì)量。

【關(guān)鍵詞】梅花點舌丹；華蟾酥毒基；脂蟾毒配基；高效液相色譜法

HPLCDeterminationofPaeoniflorininHuachanshudujiandZhichadupeijiofMeihuadiansheDanSUFu-liShanxiMedicalCollegeforContinuingEducation,Taiyuan030012,ChinaAbstractObjectiveToestablishHPLCmethodfordeterminationofHuachanshudujiandZhichadupeijiintheChinesedrugChansuofMeihuadianshedan.MethodHPLCsystemincludesODScolumn,×250mm,Themobilephasewasacetonitrile-water(∶).Theflowratewas/min.Thedetectionwavelengthwas296nm.Theamountofinjectionwas20μLResultsthecalibrationcurvesofHuachanshudujiandZhichadupeijiwerelinearintherangeof～μg/mL、～μg/mL(r=8、7).Theaveragerecoveries(n=6)concentrationaddedinsampleswere%、%.Thedeviationwas%、%.ConclusionThemethodisrapid,accurateandreliable.Keywords：MeihuadiansheDan；Huachanshuduji；Zhichadupeiji；HPLC梅花點舌丹是由牛黃、麝香、雄黃、蟾酥、朱砂等21味藥材組成的成藥方劑,具有清熱解毒、消腫止痛的作用。用于瘡瘍初起、無名腫毒、疔瘡發(fā)背、乳癰腫痛。該成藥原屬地方標準,只收載了薄層色譜鑒別,無含量測定指標。該成藥中含有藥材蟾酥,2005版《中國藥典》(一部)是以華蟾酥毒基、脂蟾毒配基為含量測定指標。為此,我們選擇蟾酥中華蟾酥毒基、脂蟾毒配基作為本藥含量測定指標,并對測定方法進行了研究。

1儀器與試藥

日立L-2130高效液相色譜儀；日立L-2420紫外檢測器；大連依利特Echrom型色譜工作站；島津2401紫外分光光度計；超聲波清洗器SK252H型(上海產(chǎn))；分析天平(上海良平精密儀器有限公司,Max100g,D=1g)。華蟾酥毒基(批號110803-200504)和脂蟾毒配基(批號110718-200507)對照品購自中國藥品生物制品檢定所,供含量測定用。乙腈、甲醇(天津四友)為色譜純,其他試劑均為分析純。水為重蒸水。

2溶液的配制

供試品溶液的配制取重量差異項下的本品,研細,約g,精密稱定,置錐形瓶中,精密加入甲醇25mL,稱定重量,超聲處理(功率250W,頻率59kHz)30min,放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,即得。

陰性樣品溶液的制備

取缺蟾酥陰性樣品,按“”項下方法操作,即得。

對照品溶液的制備

取華蟾酥毒基對照品mg,精密稱定,取脂蟾毒配基對照品18mg,精密稱定,分別置25mL量瓶中,用甲醇溶解(必要時超聲)并稀釋至刻度,搖勻,分別精密量取各1mL,分別置10mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得對照品溶液(每1mL含華蟾酥毒基μg、脂蟾毒配基μg)。

3色譜條件

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑：乙腈-水(∶)為流動相；柱溫：室溫；流速：mL/min；檢測波長為296nm；進樣量：20μL。理論板數(shù)按華蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰計算不低于2700。色譜圖見圖1。

4方法學(xué)驗證

線性關(guān)系

取華蟾酥毒基和脂蟾毒配基對照品,精密稱定,用甲醇稀釋制成華蟾酥毒基為、、、、μg/mL和脂蟾毒配基為、、、、μg/mL的系列。取上述溶液20μL,注入液相色譜儀,測定。結(jié)果華蟾酥毒基線性方程為Y=+,相關(guān)系數(shù)r=8；脂蟾毒配基線性方程為Y=,相關(guān)系數(shù)r=7。結(jié)果表明,華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對照品分別在～μg/mL、～μg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分值呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

專屬性

取陰性樣品溶液,注入液相色譜儀,測定。結(jié)果在與對照品主峰保留時間相同位置無色譜峰出現(xiàn)(見圖1),證明此方法具有一定的專屬性。

精密度試驗

取同一供試品,分別按“”項下方法制備供試品溶液。精密吸取20μL,注入液相色譜儀,依法連續(xù)進樣6次。結(jié)果華蟾酥毒基RSD=%,脂蟾毒配基RSD=%；表明精密度良好。

穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液,在0、2、4、6、8、10、24h不同時間內(nèi),分別精密吸取20μL,注入液相色譜儀,進行測定。結(jié)果華蟾酥毒基RSD=%,脂蟾毒配基RSD=%；表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗

精密稱取本品約g,共6份,分別按“”項下方法制備供試品溶液,于上述色譜條件下連續(xù)測定,分別計算華蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量(n=6),RSD分別為%和%。

回收率試驗

精密稱取同一供試品,共6份,分別精密加入華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對照品,分別按“”項下方法制備供試品溶液,于上述色譜條件下連續(xù)測定,計算各樣品中華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量,并計算回收率。結(jié)果見表1。表1華蟾酥毒基、脂蟾毒配基回收率實驗結(jié)果

樣品含量測定

取本品各批約g,精密稱定,分別按“”項下同法操作制備供試品溶液,于上述色譜條件下連續(xù)測定,計算各樣品中華蟾酥毒基、脂蟾毒配基的含量。結(jié)果見表2。表2樣品測定結(jié)果

5討論

供試品溶液制備方法的選擇

本品為中藥復(fù)方制劑,組分復(fù)雜,經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn),樣品的提取及前處理對華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量測定及各組分的分離影響較大,故對樣品的提取及前處理條件進行了篩選。為確定用何種溶劑提取、溶劑的用量、超聲處理的時間,我們參考2005年版《中國藥典》(一部)梅花點舌丸、麝香保心丸及蟾酥藥材等項下的含量測定方法[1],采用正交設(shè)計方法安排實驗(見表3)。實驗結(jié)果表明,提取液用甲醇,溶液劑量25mL,超聲處理30min,可得到滿意的結(jié)果。表3三因素三水平正交試驗

吸收波長的選擇

取上述對照品溶液適量,用紫外可見分光光度計于200～800nm波長處掃描,結(jié)果在296nm處有最大吸收,參考有關(guān)文獻及蟾酥藥材的質(zhì)量標準,決定采用296nm作為檢測波長。

流動相的選擇

我們參考2005年版《中國藥典》(一部)蟾酥的質(zhì)量標準,以及成藥中華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量測定方法[1],比較了不同流動相配比,最終選擇了乙腈-水(∶)為流