‘鴨梨’和‘杜梨’nacp基因克隆及表達分析

‘鴨梨’和‘杜梨’nacp基因克隆及表達分析

0在葉片和植物間的mtna表達方面的應用[研究意義]在果實的生產(chǎn)過程中，被廣泛用于品種的交換、抗逆性和低生長，以獲得有利于生產(chǎn)的良好特性。相同接穗嫁接至不同砧木后,其表型、生理生化特性及基因表達都有所改變,其中許多特性與果實性狀、花期早晚有關(guān),對果樹生產(chǎn)具有一定的影響。筆者在梨中初步驗證內(nèi)源性NACP基因mRNA分子可以在植物體內(nèi)進行傳遞,為今后對mRNA傳遞機理的深入研究奠定基礎。同時可以進一步揭示砧穗互作機制,在生產(chǎn)上有目標的改良果樹砧木,進而達到調(diào)控接穗獲得某些優(yōu)良性狀的目的。【前人研究進展】目前對于砧穗互作機理的研究仍然不是很清楚,大多認為嫁接結(jié)合部控制激素的流通、同化物的運輸和水分、養(yǎng)分的吸收。迄今已在蓖麻、擬南芥、大麥、甜瓜等植物的韌皮部汁液中發(fā)現(xiàn)數(shù)百種mRNA。通過一系列的研究證明,非細胞自治的mRNA不僅可以通過嫁接口,而且可能是作為長距離信號分子在植物的生理和發(fā)育轉(zhuǎn)變方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。NAC結(jié)構(gòu)域蛋白是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。植物特異性NAC結(jié)構(gòu)域基因的特點是高度保守的N端區(qū)域和高度多態(tài)性的C-末端。保守的N端可能作為NAC的DNA結(jié)合區(qū)域,而C端則可能作為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域。NAC結(jié)構(gòu)域蛋白參與植物的許多發(fā)育過程。例如,有助于胚胎模式形成,葉片衰老,花發(fā)育,側(cè)根形成、發(fā)育和次生壁加厚。NAC結(jié)構(gòu)域蛋白也被證明參與植物非生物脅迫和防御反應。從南瓜屬(南瓜)的韌皮部汁液中分離出來一個編碼NAC的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CmNACP的mRNA。表達分析和嫁接試驗證明CmNACP基因mRNA可以通過韌皮部進行長距離運輸,并在營養(yǎng)器官、根和花分生組織中積累?！颈狙芯壳腥朦c】mRNA分子通過韌皮部傳遞并影響植物生長發(fā)育方面的研究報導較少。對此領域的研究不僅可以全面揭示砧穗間分子傳遞機制,同時可以通過其傳遞載體作用攜帶不能傳遞的性狀決定子基因長距離運輸,實現(xiàn)定點改良砧木,達到調(diào)控接穗某些性狀的目的?！緮M解決的關(guān)鍵問題】克隆‘鴨梨’和杜梨中全長的NAC結(jié)構(gòu)域蛋白基因NACP,并進一步證明梨內(nèi)源性的NACP基因mRNA可以通過韌皮部進行傳遞。1材料和方法1.1植物材料和微移植1.1.1幼葉的處理與微嫁接選取杜梨(PyrusbetulaefoliaBunge)和‘鴨梨’(PyrusbretschneideriYali)組培苗幼葉,液氮處理后-80℃冰箱保存用于基因克隆。1.1.2微嫁接在無菌條件下,將擴繁30d后的杜梨組培苗去頭,留約1.5cm長莖段,沿頂部縱切;取苗高1cm的‘鴨梨’組培苗,頂端留2—3片葉,基部削成“V”型,插入砧木切口,用錫箔紙固定,嫁接苗在培養(yǎng)基MS+0.5mg·L-16-BA+0.1mg·L-1IBA中生長。1.2nacp基因克隆與序列分析1.2.1pcr擴增及測序采用CTAB法進行基因組總DNA的提取,用1%瓊脂糖凝膠進行檢測,-20℃凍存。1.2.2編碼NAC蛋白基因擴增與序列分析根據(jù)GenBank中公布的擬南芥、南瓜、蘋果‘富士’等植物NACP基因序列設計引物,上游引物:5′-TGATTTCCCGAATTTAGAGC-3′,下游引物:5′-GAGATCAATAATTCCAGAGGC-3′,由上海生工生物工程有限公司合成。以‘鴨梨’和杜梨DNA為模板進行擴增,PCR反應條件為:94℃預變性,3min;94℃變性30s,54℃退火30s,72℃延伸1min30s,30個循環(huán),延伸72℃6min,4℃保存。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,隨后利用中科瑞泰瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行切膠回收。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后,連接到pMD18-T載體上,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,藍白斑篩選后,挑取白斑搖菌進行菌落PCR鑒定,將鑒定正確的菌液送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序。1.3nac結(jié)構(gòu)區(qū)蛋白質(zhì)基因的微遺傳組織rt-pcr擴增與酶切有關(guān)1.3.1接穗‘鴨梨’莖尖、葉片、莖段韌皮、木質(zhì)部的制備植物材料RNA的提取采用CTAB法,微嫁接后1、2、3、4、5和10d,分別從同一時期各嫁接植株的接穗‘鴨梨’莖尖、葉片、莖段韌皮部,嫁接口和砧木杜梨莖段韌皮部、木質(zhì)部中取樣,提取總RNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.3.2引物的篩選與rt-pcr擴增采用酶切鑒定的方法驗證NACP基因mRNA的傳遞。利用DNAMAN與Primer5.0確定‘鴨梨’與杜梨核苷酸序列的酶切位點。通過對兩個基因酶切位點的分析,篩選出一個特異的限制性內(nèi)切酶ScrFⅠ,在其酶切位點上下游設計1對引物,上游引物:5′-AAGCCACAGGCAAAGATAAG-3′,下游引物:5′-CCAGAGGCAATCGAATTCT-3′,由上海生工生物工程有限公司合成。篩選引物時分別以‘鴨梨’和杜梨cDNA為模板進行PCR擴增,將擴增產(chǎn)物回收、純化后進行酶切。篩選出的鑒定引物PCR反應條件為:94℃預變性,3min;94℃變性30s,51℃退火30s,72℃延伸40s,30個循環(huán),延伸72℃6min,4℃保存。在嫁接后的‘鴨梨’和杜梨各組織中取樣,進行RT-PCR。將利用鑒定引物擴增得到的片段分別回收、純化后用限制性內(nèi)切酶ScrFⅠ進行酶切,酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.4pcr和探針的制備地高辛標記的cDNA探針制備。根據(jù)擴增的NACP基因設計特異性探針引物,其中上游引物:5′-CGAAGCTTAATGAGTGGGTGATTTGTAG-3′,下游引物:5′-CGTCTAGATCCTGTGGGAACTCTATTTT-3′。以提取的總RNA為模板進行PCR擴增,反應條件:94℃預變性,3min;94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,35個循環(huán),延伸72℃7min,4℃保存。擴增出1個492bp的片段。將PCR產(chǎn)物連接到pMD18T-Simple載體,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中擴增。將擴增產(chǎn)物測序,所得擴增產(chǎn)物與所登錄GenBank的已知相應基因片段進行序列比對,與預期的擴增片段大小、序列一致,符合原位雜交探針要求。提取質(zhì)粒,用HindⅢ和XbaⅠ內(nèi)切酶進行雙酶切。構(gòu)建表達載體,將雙酶切產(chǎn)物連接到pSPT載體。用內(nèi)切酶HindⅢ進行單酶切,使質(zhì)粒線性化,之后進行體外轉(zhuǎn)錄合成探針。取杜梨莖段,用4%多聚甲醛4℃過夜進行固定,用梯度酒精在室溫條件下對材料進行脫水,然后將材料包埋在石蠟中,切片。雜交探針的雜交及免疫學檢測遵循Drews等的方法。用光學顯微鏡進行信號觀察和記錄。2結(jié)果2.1“雅梨”和“雅梨”nac基因的克隆與生物信息的分析2.1.1pcr擴增及電泳檢測根據(jù)GenBank中公布的擬南芥、南瓜、蘋果‘富士’等植物NACP基因序列設計引物,以‘鴨梨’和杜梨總DNA為模板進行PCR擴增,經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測,得到兩條大小相同的條帶(圖1)。分別將條帶進行回收轉(zhuǎn)化,克隆到pMD-18T載體后測序,兩條目的片段均為1377bp,編碼350個氨基酸,包含兩個內(nèi)含子,大小分別為111、96bp。2.1.2植物nacp氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹在NCBI上BLAST比對結(jié)果顯示,‘鴨梨’和杜梨NACP基因與多種植物的NACP氨基酸序列具有較高的相似性,其中與蘋果‘富士’的相似性最高(98%)?！喞妗投爬鍺ACP基因編碼的氨基酸序列與已知的其它植物NACP基因含有相同的保守結(jié)構(gòu)域(圖2)。將其分別命名為YL-NACP和DL-NACP。通過DNAMAN構(gòu)建YL-NACP、DL-NACP等16種植物NACP基因氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹。該進化樹顯示,獲得的氨基酸序列與蘋果‘富士’MdNACP親緣關(guān)系最近,與南瓜CmNACP、擬南芥CUC1、CUC2、CUC3和矮牽牛PhNAM親緣關(guān)系較近,而與擬南芥ATAF1、ATAF2、馬鈴薯StNAC,油菜BnNAC14、BnNAC18和水稻OsNAC5及煙草TERN、毛果楊PtNAC的親緣關(guān)系相對較遠(圖3)。2.2梨nac基因mrna的遺傳特性的測定2.2.1pcr擴增及產(chǎn)物的制備YL-NACP與DL-NACP基因核苷酸序列相似性高達99%,特異性引物很難設計,利用RT-PCR的方法鑒定不可行。因此,采用酶切鑒定的方法驗證NACP基因mRNA的傳遞。通過對兩個基因酶切位點的分析,找到了DL-NACP基因相對YL-NACP基因特異的酶切位點,在此酶切位點的上下游分別設計引物。分別以‘鴨梨’和杜梨的cDNA為模板,利用設計的同一對引物進行PCR擴增,均得到1個長度為752bp的片段。將擴增得到的片段分別回收、純化后用限制性內(nèi)切酶ScrFⅠ進行酶切,酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。發(fā)現(xiàn)杜梨的PCR產(chǎn)物可以被酶切成42、301、409bp3個條帶,‘鴨梨’的PCR產(chǎn)物可以被酶切成42、710bp兩個條帶,結(jié)果與預期的酶切圖譜一致。由此可見,所設計的引物及限制性內(nèi)切酶ScrFⅠ可被用于鑒定梨中NACP基因mRNA的傳遞(圖4)。2.2.2scrf對rt-pcr產(chǎn)物的酶切鑒定微嫁接后1、2、3、4、5和10d,分別從同一時期各嫁接植株的接穗‘鴨梨’莖尖、葉片、莖段韌皮部,嫁接口和砧木杜梨莖段韌皮部、木質(zhì)部中取樣,提取總RNA(圖5),進行RT-PCR(圖6)。對RT-PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶ScrFⅠ進行酶切鑒定(圖7),結(jié)果表明,在嫁接后的前2d,砧木和接穗各組織都表現(xiàn)為各自的特異性酶切條帶,但從第3天開始,可以看到除了杜梨莖段木質(zhì)部外,其余各組織都有新的酶切條帶出現(xiàn),即接穗‘鴨梨’各部位除了含有自身特異性酶切條帶之外,同時還增加了砧木杜梨的特異性酶切條帶;而砧木杜梨的莖段韌皮部除了含有自身特異性酶切條帶之外,同時也增加了接穗‘鴨梨’的特異性酶切條帶。但到第10天時,接穗‘鴨梨’的莖尖、葉片、莖段韌皮部中并沒有檢測到砧木杜梨的特異性酶切條帶。對照組中的‘鴨梨’和杜梨自身嫁接苗并未發(fā)現(xiàn)有新的特異性酶切條帶。2.3dl-nacp基因mrna的表達為了確定NACP基因表達的確切位置,在杜梨莖段橫切面進行原位雜交。利用反義探針檢測到DL-NACP基因mRNA在韌皮部中表達,在木質(zhì)部中沒有表達(圖8-A,B),當使用正義探針時并沒有觀察到DL-NACP基因mRNA表達信號(圖8-C)。這一結(jié)果說明梨NACP基因表達定位在韌皮部,與之前報道的CmNACP基因的定位結(jié)果一致。3nacp基因mrna在株中的傳遞韌皮部是植物體養(yǎng)分和信息轉(zhuǎn)運的長距離運輸系統(tǒng),RNA轉(zhuǎn)錄本和小RNA在其中出現(xiàn)、轉(zhuǎn)運并可以作為信息分子發(fā)揮功能。由于成熟的韌皮部SE不具備轉(zhuǎn)錄和翻譯功能,內(nèi)源性mRNA可以作為系統(tǒng)的長距離信號,影響目標組織中基因的表達,從而控制植物發(fā)育和形態(tài)發(fā)生進程。試驗證明在馬鈴薯中,BEL1-like轉(zhuǎn)錄因子的超表達導致單株塊莖顯著增加,這種現(xiàn)象是可嫁接傳遞的。此外GIBBERELLICACIDINSENSITIVE(GAI)基因mRNA也被證實可以傳遞并影響葉片形態(tài)發(fā)育。番茄中導入筍瓜Cmgaip和擬南芥DeltaDELLA-gai基因作為砧木,兩種gaimRNA均可以通過嫁接口長距離運輸至接穗,并導致莖節(jié)間縮短及接穗葉片表型的改變。本試驗分別從‘鴨梨’和杜梨中克隆得到了NACP基因,通過氨基酸序列同源性比對分析,結(jié)果證明與多種植物的氨基酸序列具有較高的相似性。對擬南芥數(shù)據(jù)庫的分析表明,NAC結(jié)構(gòu)域編碼基因構(gòu)成一個龐大的基因家族。類似情況可能存在于梨中,YL-NACP、DL-NACP可能是一個龐大的基因家族中的成員。與BEL1-like及GAI等試驗在轉(zhuǎn)基因植株中驗證傳遞不同,本試驗首次在梨中驗證了內(nèi)源NACP基因mRNA分子的傳遞,并且證實這種傳遞是雙向的:砧木NACPmRNA可傳遞至接穗,接穗NACPmRNA可傳遞至砧木,這一發(fā)現(xiàn)對完善砧穗互作機理具有重要價值。嫁接10d,傳遞能力減弱,推測NCAPmRNA長距離的傳遞可能只在嫁接初期的特殊階段啟動,不具有長期效應。利用原位雜交技術(shù)進行基因定位,發(fā)現(xiàn)NACP基因mRNA定位于韌皮部,與之前報道的CmNACP研究結(jié)果一致,并為NACPmRNA在韌皮部中傳遞提供了進一步的證據(jù)?，F(xiàn)代果樹生產(chǎn)過程中已廣泛應用嫁接來進行無性繁殖,由于砧木可以賦予接穗諸如早熟、改善果實品質(zhì),提高抗病性等一些優(yōu)良的性狀,其分子機理可