鄰苯三酚自氧化法測(cè)定超氧化物歧化酶活性

鄰苯三酚自氧化法測(cè)定超氧化物歧化酶活性的研究摘要：目前超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定結(jié)果混亂，為提高測(cè)定結(jié)果的可比性，對(duì)鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD活性的方法進(jìn)行了研究，就該活力測(cè)定體系中緩沖溶液的介質(zhì)組成、濃度、pH及所含的EDTA量等因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響進(jìn)行了探討，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提出了新的改良方法.超氧化物歧化酶(SOD)是一種特殊的金屬酶，它能催化超氧陰離子自由基(02—)發(fā)生歧化反應(yīng)，從而能有效清除機(jī)體內(nèi)超氧陰離子自由基(02—),是生物體重要的細(xì)胞防御系統(tǒng)之一，具有防御氧毒、抗輻射、防衰老以及防治腫瘤和抗炎等藥用功效［1］，超氧化物歧化酶(SOD)這一獨(dú)特的生理功能使其在醫(yī)藥領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景，激起了人們廣泛的研究熱情.自1969年McCord等首次發(fā)現(xiàn)具有活性的超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase簡(jiǎn)稱SOD)以來，眾多測(cè)定SOD的方法已逐步建立起來，其中以化學(xué)法最為常用.經(jīng)典的鄰苯三酚法是Marklund等［2］于1974年發(fā)表的一種通過比色測(cè)定SOD的簡(jiǎn)便方法?此后，鄰苯三酚法在國(guó)內(nèi)外得以廣泛應(yīng)用.與其他方法相比，鄰苯三酚自氧化法具有操作簡(jiǎn)便，快速，試劑便宜且用量小，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)；但文獻(xiàn)報(bào)道的鄰苯三酚自氧化法測(cè)定超氧化物歧化酶活性的測(cè)定條件各不相同，這就造成了測(cè)定結(jié)果的混亂和缺乏可比性.為此我們對(duì)鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD活性的方法進(jìn)行了研究，就該測(cè)活體系中緩沖溶液的介質(zhì)組成、濃度、pH及所含的EDTA量等因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響進(jìn)行了探討.1原理在堿性條件下，鄰苯三酚迅速氧化釋放出超氧化物陰離子，生成有色中間產(chǎn)物，吸光度隨之增加，使吸光度值與反應(yīng)時(shí)間呈良好的線性關(guān)系.SOD加入鄰苯三酚自氧化反應(yīng)體系后，催化超氧化物陰離子生成過氧化氫，使有色中間產(chǎn)物的生成受阻，導(dǎo)致吸光值下降，鄰苯三酚自氧化速率降低，可作為測(cè)定SOD活性的理論依據(jù).2材料與方法(1)2.1試劑和主要儀器試劑0.1mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.2，內(nèi)含2mmol/LEDTA)：0.2mol/LTris(內(nèi)含4mmol/LEDTA)100ml與0.2mol/LHCl44.76ml混合，加雙蒸水至200ml，調(diào)pH8.2±0.01;鄰苯三酚(45mmol/L)：以10mmol/LHCl配制成6mmol/L溶液，存放于冰箱備用；所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為自制雙蒸水；二、 儀器：721型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)操作方法2.2方法2.2.1鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定在試管中按表1加入緩沖液和雙蒸水，于25°C恒溫20min后加入25°C預(yù)熱過的鄰苯三酚(對(duì)照管用10mmol/L鹽酸代替)，迅速搖勻，立即傾入比色杯中，在波長(zhǎng)325nm處每30s測(cè)定一次吸光值A(chǔ)0裘：鄰無三斷白瓦化謖率測(cè)宦加樣表D-lmolAiTrij-HCllDnunQl/LHCl總?cè)阜e如】對(duì)照i:4.?4.20.3—S.04,54.2一荒終液川.，?0一一2一雄fniHurx .H/ilj-t-H2.2.2SOD活力的測(cè)定SOD活性測(cè)定法按上述表1操作，加入鄰苯三酚前，先加入一定量SOD，并減少同體積雙蒸水，其它操作均與上述2.2.1相同，所測(cè)吸光度為-一訐=(A,,- .|：.}/Ah\方法2：、試劑及其配制:1.pH8.2,100mM三羥甲基氨基甲烷一二甲胂酸鈉緩沖液（內(nèi)含2mM二乙基三氮基五乙酸）。以加200mM三羥甲基氨甲烷-二甲胂酸鈉50ml（內(nèi)含4mM二乙基三氮基五乙酸）加200mN鹽酸22.38ml，然后用雙蒸水稀釋至100ml。2.10mN鹽酸3?6mM鄰苯三酚，用10mN鹽酸配制，4°C保存。4?實(shí)驗(yàn)用水均應(yīng)用玻璃雙蒸水二、儀器：721型分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）操作方法1?鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定:在試管中按表l加入緩沖液和雙蒸水，25C保溫勸分鐘，然后加入25C預(yù)溫的鄰苯三酚（對(duì)照管用10mMHCI代替），迅速搖勻，倒入比色杯中，在4加nm的分光光度計(jì)中，每隔半分鐘測(cè)一次OD值，要求自氧化速率控制在0.060OD/分。表1鄰苯三酎自氧化速率測(cè)定加持表試 劑加樣屋（皿?殻燼濃豉50.pHS-2和血~pH$.2100mM:脛甲基貫基甲垸匸甲腫戯詁綾沖液供舍岔二乙基三氨基五乙1雙蕪水+.2030.292.SOD或粗醉抽提液的活性瀏定：測(cè)定時(shí)按表2加樣，測(cè)定步驟與測(cè)鄰苯三酚的自氧化速率同。表2皐OQ或粗亟抽提液活力測(cè)定加樣表加祥量g）f赧絡(luò)浹度「I■坯」1OUrriAtr匚於甲毘氨XE甲丈彳二尸腳濮鈉績(jī)4鍛〔旳在曲餾-:乙皋三頭華五乙酸[4.ft?_..50,pfia.21m.W—乙華酸）3D或相胸冊(cè)提液O,1--4.1EniAf郛茶三齡幣液0.：30.2總注積 ]-■"-―■■ n—--酶活力單位定義:在1ml反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá) 50%時(shí)的酶量定為一個(gè)活力單位，即420nm0.030D/分為一個(gè)活力單位。若自氧化速率在36~65%，通常可按比例計(jì)算，不在此范圍內(nèi)的數(shù)值應(yīng)增減樣液量。⑴單位沾力和険潔戈/的計(jì)算0.060-單位活力——nx反應(yīng)液總體積* 讐霧琴畫敎總活力=單位活力W/F訂〉乂驚液總體積（巧蛋口濃度（mg/ml）和總蛋片的計(jì)算SO1?或粗酶抽提液，經(jīng)380run紫外比色測(cè)定后「查牛血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線」由此算岀每ml含“g蛋白的量，蛋白濃度=噸蛋白門rdx巒液稀釋倍數(shù)xlO-^mg蛋白金1總?白=mg馥白/mix原液總體積=皿號(hào)蛋白<3>比活C^/rng蛋白〕的計(jì)算扌注— 單位適力Cn/ml'）比淪 蛋白說愛&請(qǐng)靈百7云巧'逸適戈L_/恵蠶百-"&螢白鄰苯三酚自氧化的機(jī)理極為復(fù)雜，從實(shí)驗(yàn)來看，鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出o易一，生成帶色的中間產(chǎn)物。反應(yīng)開始后溶液先變成黃棕色，幾分鐘后遂轉(zhuǎn)綠，幾小時(shí)后又轉(zhuǎn)變成黃色，這是因?yàn)樯傻闹虚g物不斷氧化的結(jié)果。我們測(cè)定的是鄰苯三酚自氧化過程中的初始階段，在這階段，中間物的積累在滯后30~45秒后，就與時(shí)間成線性關(guān)系，一般線性時(shí)間維持在4,~411511。中間產(chǎn)物在4幼nm時(shí)有強(qiáng)烈的光吸收，在有超氧物岐化酶存在時(shí)由于它能催化O玉一與H十結(jié)合生成0:和HZO:,從而阻止了中間產(chǎn)物的積累，因此通過計(jì)算就可求出SOD的活性。鄰苯三酚自氧化結(jié)果見圖1.°。迦昉■町冋〔牯IE2°。迦昉■町冋〔牯IE2陽對(duì)自塑也潼竄腎筋m姦gph雲(yún)靳總惓機(jī)為曲山鄰苯三酚為罠皿鳴卯匕總體機(jī)為9咄：鄒苯三靜為山2血乩~n三莪甲基範(fàn)基甲烷匸甲解嚴(yán)鈉盪禪液為聞甲基竝甲整二甲牌卿訓(xùn)溉（內(nèi)（為含二乙基三気基五乙轉(zhuǎn)）， 余：此苛一乙廉_肖斥￡工劉，鄰苯三酚在堿性條件下能迅速自氧化，而在酸性環(huán)境中卻相當(dāng)穩(wěn)定。為了盡可能使緩沖液的pH維持恒定，要求加樣量盡可能少些，因?yàn)镻H變化對(duì)自氧化速率有較大的影響，見圖2實(shí)驗(yàn)表明:不同pH對(duì)滯后時(shí)間和線性維持時(shí)間影響不大，而對(duì)線性速率影響很大。實(shí)驗(yàn)還表明，降低pH要比升高pH對(duì)速率影響更大。測(cè)定時(shí)，要求將反應(yīng)液pH嚴(yán)格控制在8.2，誤差不得超過士0.01。二、不同的鄰苯三酚濃度對(duì)自氧化速率的影響:圖3和圖4都表明:不同的鄰苯三酚濃度對(duì)自氧化速率有影響。在一定的范圍內(nèi)，線性速率隨鄰苯三酚濃度的增加而增加，見圖3,這是本法的優(yōu)點(diǎn)之一。這樣，我們就可在較大范圍內(nèi)選用鄰苯三酚的濃度，以便更顯著地

觀察鄰苯三酚被SOD抑制的情況。根據(jù)圖4的關(guān)系表明在溫度和pH不變情況下，可以靈敏地檢測(cè)貯存的鄰苯三酚溶液的自氧化程度，以便決定要否新鮮配制。三、溫度對(duì)鄰苯三酚自氧化的影響實(shí)驗(yàn)表明，溫度對(duì)鄰苯三酚自氧化速率的影響遠(yuǎn)比pH要小得多。特別在25一27.5°C時(shí)，其影響差別小于4%,基本上不變化。這對(duì)測(cè)定帶來方便。本法測(cè)定的靈敏度與經(jīng)典的黃嗓吟氧化酶法基本相同。3不同鄰苯三酣敢度下的自軌化曲線懸*鄰菸三前氓度與目竄化速率關(guān)柬曲線25弋；,囲甘靳總體積為PrnJ：三宛甲慕氮基甲烷r邪叱*屈乩盍總休積為9ml：三