生物化學(xué)教學(xué)課件：胰蛋白酶(trpsin ) 米氏常數(shù)的測(cè)定

胰蛋白酶(trpsin)米氏常數(shù)的測(cè)定

胰蛋白酶系自牛、羊或豬胰中提取的一種蛋白水解酶。由牛、羊、豬胰臟提取而得的一種肽鏈內(nèi)切酶，只斷裂賴(lài)氨酸或精氨酸的羧基參與形成的肽鍵。白色或米黃色結(jié)晶性粉末。溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。分子量24000，pI～10.8，最適pH值7.8～8.5左右。在pH為3時(shí)最穩(wěn)定，pH>9.0不可逆失活。Ca2+對(duì)酶活性有穩(wěn)定作用；重金屬離子、有機(jī)磷化合物、天然胰蛋白酶抑制劑對(duì)其活性有強(qiáng)烈抑制。臨床用于抗炎消腫，工業(yè)上用于皮革制造、生絲處理、食品加工等。酶促反應(yīng)速度：酶促反應(yīng)體系復(fù)雜，影響酶促反應(yīng)速度的因素很多，包括底物濃度、酶濃度、產(chǎn)物濃度、pH、溫度、抑制劑和激活劑等影響因素。酶促反應(yīng)速度通常用在一定條件下，以單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來(lái)表示，用產(chǎn)物濃度對(duì)反應(yīng)時(shí)間作圖，得到酶促反應(yīng)速度曲線(xiàn)。

酶活力的測(cè)定酶活力的測(cè)定一般是通過(guò)測(cè)定酶促反應(yīng)的速度而確定，而酶催化的反應(yīng)速度可用單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的增加量或底物的減少量來(lái)表示。測(cè)定方法主要是根據(jù)產(chǎn)物或底物的物理化學(xué)特性來(lái)決定具體的測(cè)定方法，分光光度法具有操作簡(jiǎn)便，時(shí)間短，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，是一種最重要的酶活力的測(cè)定方法。本實(shí)驗(yàn)采用L-BAPA(苯甲酰-L-精氨酸-對(duì)硝基苯胺）作為酶的底物，分光光度法記錄酶促反應(yīng)生成產(chǎn)物對(duì)硝基苯胺引起的光吸收增加值，通過(guò)在410nm連續(xù)測(cè)定反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)物光吸收值的變化，做出光吸收—時(shí)間曲線(xiàn)，從而計(jì)算出酶促反應(yīng)速度。

底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)的影響在酶濃度，pH，溫度等條件不變的情況下研究底物濃度和反應(yīng)速度的關(guān)系。如右圖所示：在低底物濃度時(shí),反應(yīng)速度與底物濃度成正比，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)特征。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值，幾乎所有的酶都與底物結(jié)合后，反應(yīng)速度達(dá)到最大值（Vmax），此時(shí)再增加底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。1）米氏方程1913年，德國(guó)化學(xué)家Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)對(duì)酶促反映的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，推導(dǎo)出了表示整個(gè)反應(yīng)中底物濃度和反應(yīng)速度關(guān)系的著名公式，稱(chēng)為米氏方程。Km—

米氏常數(shù)Vmax—

最大反應(yīng)速度2）米氏常數(shù)的意義:由米氏方程可知，當(dāng)反應(yīng)速度等于最大反應(yīng)速度一半時(shí),即V=1/2Vmax,Km=[S]

上式表示,米氏常數(shù)是反應(yīng)速度為最大值的一半時(shí)的底物濃度。因此,米氏常數(shù)的單位為mol/L。不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個(gè)重要的特征物理常數(shù)。Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測(cè)定的，不同條件下具有不同的Km值。Km值表示酶與底物之間的親和程度：Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。測(cè)定Km和V的方法很多，最常用的是Lineweaver–Burk的作圖法—

雙倒數(shù)作圖法。

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax取米氏方程式的倒數(shù)形式：1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km3）米氏常數(shù)求法實(shí)驗(yàn)步驟測(cè)活體系：室溫條件下測(cè)定.調(diào)好分光光度計(jì)，取兩個(gè)10mm比色杯,測(cè)定波長(zhǎng)為410nM。加入測(cè)活緩沖液50mMTris-HCl

10mMCaCl2(pH8.2)，加入不同濃度的底物，最后加入100ultrpsin使終體積為3mL?？瞻讓?duì)照除不加酶，其它都相同?；靹蚝?，立刻計(jì)時(shí)，并測(cè)定A410nm,每個(gè)底物濃度至少記錄6個(gè)時(shí)間點(diǎn)。即5個(gè)?A410nm/min,作圖，斜率即為該底物濃度下的反應(yīng)初速率。

共六個(gè)實(shí)驗(yàn)組，即六個(gè)不同底物濃度，分別測(cè)定