酶組織化學(xué)總論-

酶的組織化學(xué)Enzymehistochemistry一.概述酶是生物體內(nèi)具有催化作用的特殊蛋白質(zhì)高效性103-106倍專一性低反應(yīng)條件易變性失活降低生化反應(yīng)的反應(yīng)活化能酶活性的檢測(cè)方法廣義上說，任何一種可以測(cè)定反應(yīng)物變化速度的分析技術(shù)，都可用來測(cè)定酶活性容量法（量氣法）比色法與分光光度法熒光法與同位素法離子選擇電極法，旋光法分子生物學(xué)，免疫化學(xué)法等酶的組織化學(xué)

利用細(xì)胞內(nèi)的酶具有催化底物的特性，并通過顯色反應(yīng)在切片或涂片上顯示組織或細(xì)胞中內(nèi)源性酶的活性及其定位的方法酶組織化學(xué)發(fā)展歷史1868年Klebs

組化1939年Takamatsu、Gomori

堿性磷酸酶1940-1960年電鏡酶組織化學(xué)1955年Scheldon

酸性磷酸酶免疫酶組織化學(xué)1970年Sternberger

酶標(biāo)抗體法目前，用酶組織化學(xué)方法能顯示的酶已達(dá)100余種酶的種類1.氧化還原酶2.轉(zhuǎn)移酶3.水解酶4.裂解酶5.異構(gòu)酶6.合成酶二.酶組織化學(xué)反應(yīng)的基本知識(shí)酶的特性酶的定位酶組織化學(xué)的基本原理（一）酶的特性水溶性，易擴(kuò)散，難溶或不溶于有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑不同程度降低酶的活性易受溫度影響，對(duì)熱耐受性弱對(duì)干燥耐受性強(qiáng)（二）酶的定位酶在細(xì)胞內(nèi)或超微結(jié)構(gòu)中存在的特定部位5‘-核苷酸酶——漿膜

ATPase——肌球蛋白細(xì)胞膜線粒體(三）酶組化的基本條件同時(shí)保存結(jié)構(gòu)和酶的活性保存酶的定位，防止酶的擴(kuò)散或移位保證反應(yīng)產(chǎn)物的特異性*影響酶活性的因素：溫度PH值抑制劑激活劑（四）原理及一般原則1.基本原理細(xì)胞內(nèi)的酶催化分解合適的底物，生成中間產(chǎn)物（即初級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物）然后其中之一再與輔助物（或捕捉劑）反應(yīng)，生成有色不溶性的終反應(yīng)產(chǎn)物該反應(yīng)產(chǎn)物沉積在原位，以顯示酶的存在第一反應(yīng)：酶促反應(yīng)

底物初級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物（PRP）第二反應(yīng)：捕捉反應(yīng)

PRP+捕捉劑終反應(yīng)產(chǎn)物（FRP）酶*PRP彌散：1.底物在酶催化下水解的速度2.PRP在緩沖液中的彌散系數(shù)3.PRP與輔助物反應(yīng)的速度應(yīng)選擇合適的底物和輔助物,減少彌散捕捉劑的濃度（<1mg/ml）2.一般原則對(duì)組織處理,制片過程不能影響酶的活性及分布所選底物和輔助物必須迅速,同步穿透入組織和細(xì)胞中所選底物最好只能被一種酶催化分解所選輔助物不影響細(xì)胞內(nèi)酶的活性,不影響其他反應(yīng)試劑的穿透性PRP必須迅速與輔助物反應(yīng),FRP為水不溶性的有色穩(wěn)定產(chǎn)物所有參與反應(yīng)的試劑均不能與其他成分吸附或結(jié)合(五)酶組織化學(xué)的主要步驟1.酶的固定（fixation）2.酶的特異性反應(yīng)（specificreaction）3.在最適條件下,酶反應(yīng)產(chǎn)物的沉著（precipitation）4.使沉著物具有可見性（visualization）組織/細(xì)胞制作切片酶反應(yīng)（孵育）顯色封片鏡檢（六）各步驟注意問題檢測(cè)方法的選擇酶的保存與固定

一般新鮮組織快速冷凍,冰凍切片-70℃長期保存固定劑1-4%多聚甲醛,福爾馬林,戊二醛固定時(shí)間固定方法:浸泡固定灌流固定固定溫度:0—4℃（六）各步驟注意問題3.切片制作:切片厚度<40um4.緩沖液選擇緩沖液用于A.配置固定液

B.漂洗液

C.配置酶反應(yīng)孵育液選擇緩沖液應(yīng)注意

A.不能減弱目標(biāo)酶的活性B.不能含有與捕捉機(jī)制相同的物質(zhì)

C.注意漂洗用緩沖液的滲透壓

D.漂洗用緩沖液原則上與固定液配置的緩沖液相同（六）各步驟注意問題5.孵育反應(yīng)A.孵育液配置

B.孵育的溫度和時(shí)間:37℃15-30minC.切片孵育法-切片孵育-漂浮孵育（六）各步驟注意問題6.酶特異性對(duì)照實(shí)驗(yàn)用酶活性抑制劑采用無底物的孵育液過固定或加熱用針對(duì)目標(biāo)酶的激活劑改變孵育液底物選擇最適PH酶細(xì)胞內(nèi)的定位差異（六）各步驟注意問題7.孵育后操作光鏡:

酶孵育后進(jìn)行后固定脫水封片,鏡檢電鏡:

孵育后,后固定脫水超薄切片后染色