臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件

基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用劉敬忠首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院北京基因診斷實(shí)驗(yàn)室

北京朝陽醫(yī)院法醫(yī)物證司法鑒定所基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用劉敬忠臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件中心法則

復(fù)轉(zhuǎn)錄翻譯

DNARNA蛋白質(zhì)

蛋白

制

反轉(zhuǎn)錄

糖蛋白脂蛋白酶類激素細(xì)胞因子

中心法則復(fù)轉(zhuǎn)錄翻譯基因重組技術(shù)

基因探針技術(shù)

基因重組藥物基因診斷基因治療

PKU

尿毒癥（口服artificialcells)基因重組技術(shù)

基因探針技術(shù)基因重組基因診斷

運(yùn)用基因探針，PCR技術(shù)等探測特定靶基因的存在與否，或是否有基因突變等缺陷，從而對疾病或病原體感染作出診斷叫基因診斷。

基因型表型基臨血生細(xì)影病因床清化菌像理診學(xué)學(xué)學(xué)學(xué)學(xué)斷診診診診診診斷斷斷斷斷斷基因診斷運(yùn)用基因探針，PCR技術(shù)等探測特基因診斷的特點(diǎn)靈敏度高（早期）特異性強(qiáng)操作簡便取材大多不受組織器官限制可進(jìn)行早期診斷，癥狀前診斷及產(chǎn)前診斷檢測細(xì)菌內(nèi)病毒等微生物時(shí)不需培養(yǎng)基因診斷的特點(diǎn)靈敏度高（早期）聚合酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChainReaction（PCR）KaryB.Mullis1984年問世,成為分子生物學(xué)和生命科學(xué)發(fā)展史上的里程碑1993榮獲諾貝爾獎

Mendocin128號公路附近一棵七葉樹下的突發(fā)奇想專利官司之戰(zhàn):DuPont與Cetus對薄公堂聚合酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChainReacti

PCR原理示意圖PCR原理示意圖PCR技術(shù)的應(yīng)用一、在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用二、遺傳病的基因診斷和產(chǎn)前基因診斷：血友病、地中海貧血、DMD、PKU等等三、細(xì)菌、支原體、衣原體、立克次體等四、病毒五、白血病、腫瘤六、骨髓移植、器官移植供體配型選擇七、法醫(yī)學(xué)八、動植物學(xué)九、古人類學(xué)、古生物學(xué)

PCR技術(shù)的應(yīng)用一、在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件PCR原理示意圖PCR熱變性：從外周血白細(xì)胞或絨毛、羊水細(xì)胞提取的DNA約1ug，在含有適當(dāng)緩沖液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反應(yīng)混合物中，在94℃下熱變性4分鐘，使之解為單鏈。

熱變性：從外周血白細(xì)胞或絨毛、羊水細(xì)胞提取的DNA約1ug，退火：然后置反應(yīng)混合物于55℃，使引物與解為單鏈的DNA上互補(bǔ)序列雜交在一起，稱之為退火。并迅速加入2單位耐熱的TaqDNA聚合酶，混勻、離心10秒鐘。為防止在整個(gè)PCR過程中，水份的蒸發(fā)影響PCR效果，通常加入35ul石蠟油封蓋液面。退火：然后置反應(yīng)混合物于55℃，使引物與解為單鏈的DNA上互引物延伸：置上述反應(yīng)混合物于70℃水浴中1-2分鐘，在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs為原料（底物），從引物的3’端A開始,沿著5’→3’的方向，合成每條模板的互補(bǔ)鏈，此稱引物延伸。結(jié)果，DNA拷貝數(shù)增加了一倍。引物延伸：置上述反應(yīng)混合物于70℃水浴中1-2分鐘，在DNA接著，將上述熱變性—退火—引物延伸（稱為一個(gè)循環(huán)）反復(fù)進(jìn)行30-35次。只是熱變性的時(shí)間縮短為1分鐘左右。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，DNA拷貝數(shù)便增加一倍（×2）。因此，如進(jìn)行n次循環(huán)，則拷貝數(shù)將增加2n倍！進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，則拷貝數(shù)將增加225倍，即上百萬倍。在瓊脂糖凝膠電泳上可看到特異性長度的擴(kuò)增帶。可見PCR之所以高速擴(kuò)增的關(guān)鍵是因?yàn)槊看涡潞铣傻腄NA鏈在后來的循環(huán)中都可以作模板，猶如滾雪球，數(shù)量迅速增加。接著，將上述熱變性—退火—引物延伸（稱為一個(gè)循環(huán)）反復(fù)進(jìn)行3如果引物5’端有幾個(gè)與模板DNA不配對的堿基，仍可能與模板DNA退火、延伸，對PCR效果影響不大。這一特點(diǎn)，可使PCR產(chǎn)物兩端帶上限制酶的Linker，或造成DNA順序的缺失、插入、堿基替代等。大大增大了PCR技術(shù)的應(yīng)用范圍。如果引物5’端有幾個(gè)與模板DNA不配對的堿基，仍可能與模板D影響PCR效果的重要因素及注意事項(xiàng)：PCR技術(shù)的原理似乎非常簡單明了，PCR反應(yīng)的操作也并不復(fù)雜；但要取得好的結(jié)果和良好的可重復(fù)性并非易事。必須徹底弄通其分子生物學(xué)的奧妙之處，并把握其各種影響因素，規(guī)范操作。以下列出影響PCR擴(kuò)增效果的主要因素影響PCR效果的重要因素及注意事項(xiàng)：引物設(shè)計(jì)一定要科學(xué)合理，序列的特異性要高。長度一般在18-25個(gè)堿基，Tm值可按公式（G+C總數(shù)x4）+（A+T總數(shù)x2）（℃）估算。盡可能避開4個(gè)以上G或C等相同堿基串聯(lián)重復(fù)。盡可能避免引物內(nèi)部形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物之間形成二聚體（Dimer）的可能性。G、C與A、T的比例盡可能1:1左右。同一反應(yīng)管中的引物（甚至同一個(gè)Lab的所有引物）Tm值設(shè)計(jì)的相同。引物設(shè)計(jì)一定要科學(xué)合理，序列的特異性要高。引物在反應(yīng)體系中的濃度要經(jīng)過優(yōu)化。雙重PCR及多重PCR對各引物濃度間的比例要求更嚴(yán)?；蚪MDNA制備液純度要好。其用量也并非越多越好。各種試劑小量分裝保存，避免多次凍融。dNTP濃度要優(yōu)化。

引物在反應(yīng)體系中的濃度要經(jīng)過優(yōu)化。雙重PCR及多重PCR對各退火溫度參考Tm值進(jìn)行優(yōu)化。其對PCR的成敗，非特異產(chǎn)物的出現(xiàn)與否關(guān)系最大。TaqDNA聚合酶的廠牌、批號和用量均要合適。對擴(kuò)增難度較大的PCR，Mg2+濃度要適當(dāng)增加。操作者的手法也有影響，要在實(shí)踐中總結(jié)提高技術(shù)。

退火溫度參考Tm值進(jìn)行優(yōu)化。其對PCR的成敗，非特異產(chǎn)物的出熒光定量PCR行HLA-DrB1位點(diǎn)分型法的建立及與血清學(xué)方法的比較熒光定量PCR行HLA-DrB1位點(diǎn)分型法的建立及與血清學(xué)方HLA分型技術(shù)HLA（人類白細(xì)胞抗原）MHC區(qū)基因（主要組織相容性復(fù)合物基因區(qū)）高度多態(tài)性的基因區(qū)HLA分型技術(shù)HLA（人類白細(xì)胞抗原）HLA分型技術(shù)一、淋巴細(xì)胞微量細(xì)胞毒試驗(yàn)

1964年，PaulTerasaki,LA,USA二、DNA分型法優(yōu)點(diǎn)：

1.血樣不要求新鮮;2.白血病患者WBC表面抗原被破壞,只能用DNA分型法;3.結(jié)果更準(zhǔn)確可靠HLA分型技術(shù)一、淋巴細(xì)胞微量細(xì)胞毒試驗(yàn)HLA分型技術(shù)DNA-RPLP,1982PCR/SSOPCR/反向斑點(diǎn)雜交PCR/SSCPPCR/SSPPCR/SBTR-Q-PCR/SSPPCR/dHPLC等HLA分型技術(shù)DNA-RPLP,1982

在序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-SSP）技術(shù)基礎(chǔ)上，將熒光定量PCR（FQ-PCR）技術(shù)與SSP結(jié)合起來，建立了自動化程度更高的熒光定量PCR-HLA分型技術(shù)，完成了46例尸腎供受者的HLA-DBR1分型。FQ-PCR不需走電泳，減少了污染的機(jī)會，提高了自動化程度。同時(shí)又開展了以DNA測序?yàn)榛A(chǔ)的HLA分型（SBT）技術(shù)。在序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-SSP三、主要方法：

1、HLA血清學(xué)分型。

2、常規(guī)PCR-SSP反應(yīng)。

3、SBT分型法：

(1)PCR擴(kuò)增DRB1片段。

(2)用ABI-373型自動測序儀測序。

(3)測序數(shù)據(jù)分析及分型。

三、主要方法：

結(jié)果和討論一、進(jìn)行PCR-SSP法HLA-DRB1位點(diǎn)分型：結(jié)果和討論一、進(jìn)行PCR-SSP法HLA-D臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件4、熒光定量PCR技術(shù)原理：

4、熒光定量PCR技術(shù)原理：圖3、熒光定量PCR中反應(yīng)前的模板濃度與Ct值成反比圖3、熒光定量PCR中反應(yīng)前的模板濃度與Ct值成反比圖4、15R-II號樣本熒光定量分型結(jié)果圖4、15R-II號樣本熒光定量分型結(jié)果圖5、SSP分型結(jié)果與上述一致圖5、SSP分型結(jié)果與上述一致FQ-PCR分型的優(yōu)點(diǎn)：

(1)熒光定量分型法省去了電泳分析、UVP成像的操作，簡化步驟，提高自動化程度，減少了工作量。

(2)判讀結(jié)果與擴(kuò)增由儀器同時(shí)完成，節(jié)省了PCR后處理的時(shí)間，結(jié)果更客觀。

(3)將引物的特異性和探針的特異性結(jié)合，提高了準(zhǔn)確性。FQ-PCR分型的優(yōu)點(diǎn)：

(4)只需在反應(yīng)前打開離心管一次，即可完成所有的操作，減少了污染的機(jī)會，進(jìn)一步提高了特異性和靈敏性。(5)本FQ-PCRHLADRB1配型較常規(guī)FQ-PCR減少了合成的熒光探針數(shù)量。(6)可得出起始模板拷貝數(shù)定量結(jié)果。(4)只需在反應(yīng)前打開離心管一次，即可完成所有的操作，減少了基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用特點(diǎn)：PCR技術(shù)一問世，首先就應(yīng)用于β—珠蛋白生成障礙性貧血等遺傳病的基因診斷。不但要查特定基因是否存在，而且要查出相應(yīng)功能基因的缺陷：突變？缺失？插入？倒位？等等。采用的技術(shù)更復(fù)雜、多樣，與檢測病毒、細(xì)菌的要求不完全相同。實(shí)驗(yàn)室的驗(yàn)收?；驍U(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用特點(diǎn)：基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用技術(shù)：PCR/凝膠電泳

PCR/RFLPPCR/SSCPPCR/ASO(Allile-specificoligoprobe)PCR/sequencingASA(Allile-specificAmplification)m-PCR(multiplexPCR)F-Q-PCR(Real-TimePCR)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用技術(shù)：PCR/凝膠電泳

血友病甲基因診斷劉敬忠，梁燕，王立榮，肖白，朱章菱，周艷，劉亮，張晶首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院北京基因診斷實(shí)驗(yàn)室北京朝陽醫(yī)院法醫(yī)物證司法鑒定所血友病甲基因診斷劉敬忠，梁燕，王立榮，肖白，甲型血友病Ⅷ因子基因倒位的研究及檢測新技術(shù)：

血友病甲（HA）是常見的X-連鎖遺傳性出血性疾病，是由于凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因缺陷所致。約半數(shù)重型HA的患者，是由于FⅧ基因第22內(nèi)含子（IVS22）發(fā)生基因倒位所致。迄今，國際上檢測這種基因倒位都是用Southern印跡雜交技術(shù)。雖然這種技術(shù)能夠準(zhǔn)確的查出這種基因倒位，但操作步驟多，流程長，出結(jié)果慢，難度大，需要DNA樣品量大以及操作放射性同位素標(biāo)記的探針等。我們從1996年開始在國際上率先研究利用長距離DNA擴(kuò)增技術(shù)（LD-PCR），替代Southern雜交進(jìn)行FⅧ基因倒位的診斷。經(jīng)過近二年的努力終獲成功，并進(jìn)行了推廣應(yīng)用。主要完成了以下幾方面工作：甲型血友病Ⅷ因子基因倒位的研究及檢測新技術(shù)：血友病甲臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件自行設(shè)計(jì)合成了長距離PCR的四個(gè)引物P、Q、A、B。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度P/Q為12Kb，A/B為10Kb，P/B及A/Q為11Kb。

自行設(shè)計(jì)合成了長距離PCR的四個(gè)引物P、Q、A、B。預(yù)期擴(kuò)增

四引物及三引物L(fēng)D-PCR體系的比較四引物及三引物L(fēng)D-PCR體系的比較

系統(tǒng)優(yōu)化了引物濃度，酶用量，deaza-dGTP的比例，DMSO濃度，基因組DNA的質(zhì)量和用量，退火及延伸溫度、時(shí)間，低濃度瓊脂糖凝膠電泳條件及操作方法等。使10-12KbDNA擴(kuò)增及檢測倒位終獲成功。這充分體現(xiàn)了該成果的科學(xué)性和先進(jìn)性系統(tǒng)優(yōu)化了引物濃度，酶用量，deaza-dGTP不同量模板DNA對LD-PCR的影響

1--5號的DNA量分別為0.25，0.5，0.75，1.0，1.25μg不同量模板DNA對LD-PCR的影響

1--5號的DNA量不同量deaza-dNTP對LD-PCR的影響

1--5號dNTP濃度分別為200，300，400，500，

600μM不同量deaza-dNTP對LD-PCR的影響

1--5號d

53份重型HA患者及家系成員DNA標(biāo)本，分別用經(jīng)典的Southern印跡雜交和本LD-PCR技術(shù)在雙盲條件下進(jìn)行FⅧ基因倒位檢測。兩者得出的診斷結(jié)論完全一致。表明用LD-PCR技術(shù)診斷該基因倒位，檢出攜帶者的特異性和靈敏度均達(dá)到百分之百。而且具有操作步驟較簡便，需DNA量少，出結(jié)果快，不需操作放射性同位素標(biāo)記探針，在無法取得先癥者患兒血樣的情況下，也可直接查攜帶者是否攜帶倒位基因，如果是可直接做產(chǎn)前診斷等優(yōu)點(diǎn)。53份重型HA患者及家系成員DNA標(biāo)本，分別用經(jīng)典的雙盲實(shí)驗(yàn)（53份DNA）結(jié)果證明：LD-PCR可獨(dú)立用于重型HA基因倒位的檢測雙盲實(shí)驗(yàn)（53份DNA）結(jié)果證明：LD-PCR可獨(dú)立用于重型應(yīng)用實(shí)驗(yàn)成功的LD-PCR技術(shù)，對來自北京、天津、江蘇、湖北、廣西、四川、山東、福建等省市的108個(gè)重型HA患者及數(shù)目不等的家系成員進(jìn)行了檢測，共查出FⅧ基因倒位47例，占44%，與國際上用Southern雜交技術(shù)查出的基因倒位引起的HA約占重型HA的40-50%一致。另外，檢出30余位倒位基因攜帶者，為將來開展產(chǎn)前基因診斷，杜絕新的HA患兒出生打下了基礎(chǔ)，對優(yōu)生、提高人口素質(zhì)有重要意義。應(yīng)用實(shí)驗(yàn)成功的LD-PCR技術(shù)，對來自北京、天津、江蘇、湖北臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件14個(gè)DNA標(biāo)本LD-PCR電泳結(jié)果

M：λDNA/HindⅢ酶解產(chǎn)物，三條帶分別為23.1kb，9.4kb，6.6kb14個(gè)DNA標(biāo)本LD-PCR電泳結(jié)果

M：λDNA/Hind臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件美國Steve.S.Sommer去年與我們同期發(fā)表了一篇類似技術(shù)方法的摘要文章。但我們較他們有兩個(gè)顯著不同特點(diǎn)：一是我們強(qiáng)調(diào)了運(yùn)用P、Q和B這三個(gè)引物就完全可以滿足診斷的需要，省去一個(gè)引物A，減少一條10Kb擴(kuò)增帶。這條10Kb帶是多余的，且使11Kb及12Kb帶出現(xiàn)的難度增大。二是我們研究成功方法后，立即迅速應(yīng)用于患者及其家系的診斷和攜帶者檢出，現(xiàn)已達(dá)一百余家系，產(chǎn)生了很大社會效益和一定的經(jīng)濟(jì)效益，并開始向兄弟單位推廣應(yīng)用。美國Steve.S.Sommer去年與我們同期發(fā)表了一篇類似

HA8家系PCR/BclⅠ酶解分析結(jié)果

M:pBR322/MspⅠ；0:Ⅱ-2（酶解前）擴(kuò)增帶長374bp，圖中211bp和163bp為酶解后產(chǎn)物

MⅡ3Ⅰ1Ⅰ2Ⅱ1Ⅱ20

HA8家系PCR/BclⅠ酶解分析結(jié)果

M:pBR32

HA15家系St14位點(diǎn)VNTR多態(tài)基因連鎖分析結(jié)果

M:ΦX174/HaeⅢ

MⅡ1Ⅱ2Ⅱ3Ⅰ2Ⅰ1HA15家系St14位點(diǎn)VNTR多態(tài)基因連鎖分析結(jié)果

MHA18家系內(nèi)含子13（A）和內(nèi)含子22（B）可變串聯(lián)重復(fù)數(shù)目多態(tài)性分析結(jié)果

A為內(nèi)含子13中（CA）重復(fù)分型結(jié)果：Ⅰ-1為21/-，Ⅱ-2為21/20，Ⅰ-2為22/20，Ⅱ-1為21/-，Ⅲ-1為21/21，她是攜帶者；B為內(nèi)含子22中（GT）（AG）重復(fù)分型結(jié)果：Ⅰ-1為26/-，Ⅱ-2為26/26，Ⅰ-2為27/26，Ⅲ-1為26/25，Ⅱ-1為25/-

Ⅰ1Ⅱ2Ⅰ2Ⅲ1Ⅱ1HA18家系內(nèi)含子13（A）和內(nèi)含子22（B）可變串聯(lián)重復(fù)數(shù)血友病乙的基因診斷，攜帶者檢出和產(chǎn)前診斷劉敬忠首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院北京基因診斷實(shí)驗(yàn)室北京朝陽醫(yī)院法醫(yī)物證司法鑒定所血友病乙的基因診斷，攜帶者檢出和產(chǎn)前診斷劉敬忠血友病乙的基因診斷，攜帶者檢出和產(chǎn)前診斷血友病乙的基因診斷，攜帶者檢出和產(chǎn)前診斷缺失型α-地中海貧血基因診斷技術(shù)的改進(jìn)劉敬忠，周桔，王立榮，周艷首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院北京基因診斷實(shí)驗(yàn)室北京朝陽醫(yī)院法醫(yī)物證司法鑒定所缺失型α-地中海貧血基因診斷技術(shù)的改進(jìn)劉敬忠，周桔，王立榮，臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班課件臨床診斷Bart’s（--/--）基因型臨床分型靜止型（-

/

）--SEA-

3.7-

4.2

標(biāo)準(zhǔn)型（--/

）HbH病（--/-

）臨床診斷Bart’s基因型臨床分型靜止型標(biāo)準(zhǔn)型HbH病

問題：PCR技術(shù)可重復(fù)性差,難度大，

結(jié)果判斷復(fù)雜，

引物設(shè)計(jì)有待改進(jìn)

措施：1、重新設(shè)計(jì)引物

2、改進(jìn)和優(yōu)化PCR反應(yīng)體系

酶、deaza-dGTP、DMSO、

退火溫度、gradientgel等

問題：PCR技術(shù)可重復(fù)性差,難度大，

A’B’C’A’B’C’G’ES1S2S3M1123456M2789M2101112M31.2%/2.0%濃度梯度瓊脂糖凝膠1，4，正常（αα/αα）；2，5，-3.7/αα；3，6，-3.7/--SEA；7，αα/αα；8，-4.2/αα；9，12，-4.2/--SEA；10，αα/αα；11，--SEA/--SEA；12，9，-4.2/--SEA1.58Kb287bp173bp1.9Kb1.7Kb

A’B’C’A’B’C根據(jù)本試劑盒三個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖譜作出基因診斷根據(jù)本試劑盒三個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖譜作出基因診斷單管四重PCR試劑盒檢測α-珠蛋白的基因三種缺失類型及引物設(shè)計(jì)示意圖

單管四重PCR試劑盒檢測α-珠蛋白的基因10種DNA的四重PCR圖譜10種DNA的四重PCR圖譜25個(gè)海南黎族人DNA的擴(kuò)增圖譜25個(gè)海南黎族人DNA的擴(kuò)增圖譜

20個(gè)廣西、廣東α-地貧68標(biāo)本的多重PCR擴(kuò)增圖20個(gè)廣西、廣東α-地貧68標(biāo)本的多重PCR擴(kuò)增圖根據(jù)圖譜作出診斷

擴(kuò)增帶電電泳圖

及診斷序號0.8Kb1.6Kb1.9Kb1.5Kb診斷1--+-正常(αα/αα);但不排除αα/αTα的可能性2-++--α3.7攜帶者(-α3.7/αα)3--++-α4.2攜帶者(-α4.2/αα)

4-+---α3.7純合子(-α3.7/-α3.7)

5---+-α4.2純合子(-α4.2/-α4.2)6-+-+-α3.7/-α4.2雙重雜合子

7+-----SEA/--SEA巴氏水腫胎兒

8++----SEA/-α3.7(缺失型HbH病)

9+--+--SEA/-α4.2(缺失型HbH病)

10+-+---SEA/αα（--SEA攜帶者）--SEA/αTα(非缺失型HbH病)

11----PCR失敗,查找原因,重復(fù)作

根據(jù)圖譜作出診斷擴(kuò)增帶電0.8Kb1.6Kb1.DNA的提取方法：鹽析法酚-氯仿抽提法

Chelex快速法DNA的提取方法：0.8kb質(zhì)粒靈敏度檢測0.8kb質(zhì)粒靈敏度檢測0.8kb穩(wěn)定性結(jié)果:1#-a3.7/--2#-a4.2/--3#aa/--4#-a3.7/-a4.25#aa/--0小時(shí)48小時(shí)72小時(shí)96小時(shí)0.8kb穩(wěn)定性結(jié)果:1#-a3.7/--2#31例陽性標(biāo)本29例陽性標(biāo)本60例陰性標(biāo)本31例陽性標(biāo)本B7B12，E8B11B7,B11,B12:-a3.7/--

1#1.0ul2#2.0ul3#3.0ul4例可疑標(biāo)本的鑒定B7B12，E8B11B7,B11,B12:-a3.206bp替代109bp10-8=33拷貝靈敏度206bp替代109bp10-8=33206bp標(biāo)準(zhǔn)曲線206bp標(biāo)準(zhǔn)曲線靈敏度靈敏度靈敏度436bp試劑盒檢測結(jié)果0.2ug0.1ug0.05ug0.02ug0.01ug

靈敏度436bp試劑盒檢測結(jié)果0.2ug平行性平