病理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)

病理學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)炎癥——以青蛙腸系膜觀察炎癥的血管變化、白細(xì)胞游出及血栓形成（一）目的1．通過實(shí)驗(yàn)觀察炎癥發(fā)生、發(fā)展過程中血管及血流的變化以及白細(xì)胞游出血管的現(xiàn)象。2．觀察血栓形成及形態(tài)（二）實(shí)驗(yàn)對(duì)象蟾蜍或蛙（三）實(shí)驗(yàn)藥品與器材林格溶液，0.4%組胺，蛙板，蛙類手術(shù)器械，解剖顯微鏡，（二）方法及步驟1．破壞腦脊髓：用左手握持動(dòng)物，以食指和中指夾住雙側(cè)前肢。搗毀腦和脊髓時(shí)，左手食指和中指夾持蛙或蟾蜍的頭部，右手將探針經(jīng)枕骨大孔向前刺入顱腔，左右擺動(dòng)探針搗毀腦組織。然后退回探針向后刺入椎管內(nèi)破壞脊髓。2．使蛙仰臥于蛙板上，將一側(cè)腹壁緊貼蛙板致圓孔，并將四足用大頭針固定于板上。3．剪開貼近圓孔一側(cè)的青蛙下腹壁皮膚、肌肉等（切口 1.5cm左右），輕輕地將腸系膜拉出，固定于圓孔四周，使腸系膜展開（注意不要拉得過緊，以免血液停滯及血管破裂）。4．透過圓孔，用低倍鏡觀察腸系膜血管的變化，并記錄觀察結(jié)果。辨別：動(dòng)脈、靜脈與毛細(xì)血管，紅細(xì)胞與白細(xì)胞，軸流與邊流。加0.4%組胺，然后觀察血管血流速度及血管管徑變化。暴露一段時(shí)間后觀察血流速度變化，軸流、邊流改變，白細(xì)胞靠邊、粘著和游出現(xiàn)象。5．選擇一中等大小的靜脈，用手指擠壓，使血流停止 1-2分鐘，然后在損傷處以顯微鏡觀察血栓形成及形態(tài)結(jié)構(gòu)。腎臟缺血模型的形態(tài)學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)[目的要求]熟悉實(shí)驗(yàn)方法及操作技巧，學(xué)會(huì)暴露左腎及左腎蒂，分離左腎動(dòng)脈，將動(dòng)脈夾輕輕挾住左腎動(dòng)脈。掌握腎臟缺血時(shí)的大體和微觀形態(tài)學(xué)變化。[實(shí)驗(yàn)對(duì)象]家兔[實(shí)驗(yàn)藥品與器材]25%氨基甲酸乙酯、生理鹽水，福爾馬林，二甲苯， 95%、100%乙醇，蘇木素-伊紅染色液，；兔手術(shù)臺(tái)、哺乳動(dòng)物手術(shù)器械一套、動(dòng)脈夾。小燒杯、線繩。[實(shí)驗(yàn)步驟]1．動(dòng)物稱重，耳緣靜脈注入25%氨基甲酸乙酯5ml/kg，行全身麻醉。仰臥固定。2．打開腹腔，暴露腎臟，小心分離腎動(dòng)脈。3．將左腎動(dòng)脈結(jié)扎一定時(shí)間，觀察左腎的顏色、大小及切面變化。4．取出腎臟、對(duì)切，放入福爾馬林內(nèi)固定，用于病理切片制作，鏡下觀察腎小管及間質(zhì)的變化。病理切片制作方法：病理石蠟切片的制作包括石蠟組織塊制作、切片制作和染色。其制作過程是：取材T固定T沖洗T脫水T透明T浸蠟T包埋T切片T貼片T烤片T脫蠟T復(fù)水T染色T脫水T透明T封藏。（一）石蠟組織塊制作1、 取材和固定：固定的目的在于保存組織內(nèi)細(xì)胞原有的結(jié)構(gòu)和形態(tài)，使其與生活時(shí)相似，因此要求固定的材料越新鮮越好。處死動(dòng)物后應(yīng)立即切取組織塊，組織塊的大小以厚度不超過5 mm為宜，并快速投入固定液中。固定液有 10%甲醛溶液、Bouin氏固定液、FAA固定液等。固定時(shí)間為數(shù)小時(shí)至24小時(shí)（需視組織塊的大小而定）。2、 沖洗：經(jīng)固定的材料，可根據(jù)不同的固定液，分別用水或酒精沖洗，以洗去固定液，否則固定液留在組織會(huì)有礙染色。3、 脫水：柔軟并含有多量水分的組織是不易切成薄片的，故必須增加組織的硬度。石蠟切片法就是使石蠟滲入組織，以達(dá)到支持增硬的作用。但水與石蠟是不相混合的，因此，在浸蠟、包埋前須將組織中的水分完全除去，這一步驟即為脫水。常用的脫水劑是酒精。脫水時(shí)，先從低濃度的酒精開始，然后，遞增濃度，直至無(wú)水酒精。具體方法是，將材料經(jīng)70%酒精^80%酒精^95%酒精（1）^95%酒精（n）~無(wú)水酒精（i）t無(wú)水酒精（n）,各級(jí)酒精1—2小時(shí)。脫水應(yīng)徹底，否則材料不能透明，影響石蠟的浸入，致使難以切片。4、 透明：酒精與石蠟不能混和，因此，脫水后的材料在浸蠟前，還必須經(jīng)過透明。透明劑既可替代組織中的酒精，又能溶解石蠟，以利石蠟的滲入。二甲苯是常用的一種透明劑。將脫水后的材料經(jīng)1:1無(wú)水酒精與二甲苯T二甲苯（1）7二甲苯（n）,各級(jí)時(shí)間為0 .5—2小時(shí)，務(wù)使組織達(dá)到透明為止。5、 浸蠟：將已透明的材料移入熔化的石蠟內(nèi)浸漬即為浸蠟。其目的是去除組織中的透明劑,而使石蠟滲入整個(gè)組織,獲得一定的硬度和韌度,以便切成薄的切片。先將裝有56-58C石蠟的三個(gè)蠟杯放在熔蠟箱內(nèi)熔化，并使熔蠟箱的溫度保持恒定（約58C），切勿太高或太低。然后將透明了的材料放入蠟杯（1）7蠟杯（n）^蠟杯（川）。浸蠟時(shí)間視材料大小而定,一般總的浸蠟時(shí)間為2—4小時(shí)左右。6、 包埋： 將浸蠟后的材料包埋于石蠟中，并使它凝固成蠟塊，這一過程稱為包埋。包埋常用銅制包埋框，將已熔化的石蠟倒入，隨即將已浸蠟的材料放入其中，應(yīng)注意切面朝下，位置放正。待石蠟全部凝固后，推出蠟塊。二）石蠟切片制作用切片機(jī)將石蠟包埋的組織塊（蠟塊）制成適宜厚度的切片，是目前在病理學(xué)科中最常用的一種制片方法。切片厚度為一般4-6卩m【切片前的準(zhǔn)備】1、修切蠟塊切片前應(yīng)先修塊，即切去組織周圍過多的石蠟，一般留下約 2mm寬度的蠟邊為宜。注意蠟塊不能留得太窄，在切片時(shí)易損壞組織；蠟邊不能留得太多，否則影響展片。室溫過高時(shí)，可將修好的蠟塊放到冰箱中冷卻一定時(shí)間。2、 切片用品準(zhǔn)備（1）切片刀：預(yù)先磨好切片刀備用或切片前更換新的一次性切片。（2）載物片：載物片經(jīng)清潔液、 95%乙醇處理后備用。（3）展片儀：加入溫水，接通電源，調(diào)整溫度。（4）其他用品：準(zhǔn)備好毛筆、記號(hào)筆、鑷子、冰塊等?！厩衅谱鬟^程】以使用旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)石蠟切片為例：1．將切片刀裝在刀架上，后將蠟塊裝在切片機(jī)固定裝置上。調(diào)整蠟塊與刀至合適位置（刀刃與蠟塊切面呈5°夾角）旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)切取組織，是由下向上切，為得到完整的切片，防止組織出現(xiàn)刀紋裂縫，應(yīng)將組織硬脆難切的部分放在上端（如皮膚組織，應(yīng)將表皮部分向上。而胃腸等組織，應(yīng)將漿膜面朝上）。2．左手執(zhí)手筆，右手旋轉(zhuǎn)切片機(jī)旋轉(zhuǎn)輪。先粗切標(biāo)本，直到暴露出組織最大切面（但對(duì)小標(biāo)本不要修切得太多，以免將整個(gè)組織塊修切掉）。再連續(xù)旋轉(zhuǎn)切出蠟帶，左手持毛筆將蠟片帶下端輕輕托起，右手用鑷子夾起蠟帶上端，正面向上放入展片儀水盒內(nèi)，展片溫度根據(jù)使用的石蠟熔點(diǎn)進(jìn)行調(diào)整，一般水溫為45C左右，待蠟片帶中的組織展平后，即可進(jìn)行分片和撈片。對(duì)于展片困難的切片經(jīng)30%的乙醇初展后，再用載玻片撈起蠟帶放人展片儀水盒內(nèi)可使切片更易展平。在夏季切片時(shí)可用冰塊冷卻切片刀和組織塊，減少切片刀與組織塊在切片過程中產(chǎn)生的熱時(shí)，使石蠟保持合適的硬度以利于切片。3．撈起切片后，寫上編號(hào)。撈片時(shí)注意切片的位置，一般切片的中心位于載物片右側(cè) 1/3與2/3交界處為佳，并注意整齊美觀。4?烤箱60C左右烘烤切片30min，對(duì)血凝塊和皮膚組織應(yīng)及時(shí)烤片，烤片溫度應(yīng)稍低；腦組織切片撈出后直立晾干，再烤片，否則產(chǎn)生氣泡。三）染色染色劑多為水溶液，故染色前必須先經(jīng)脫蠟、復(fù)水等步驟。染色方法較多（詳見病理學(xué)小知識(shí)之一、之二），H.E.染色法最為常見，步驟：1、 脫蠟：將烤干的切片放入二甲苯（I）t二甲苯（n）中，各為5min,以溶去切片上的石蠟。2、復(fù)水：是將脫蠟后的切片經(jīng)各級(jí)濃度酒精逐漸下降到水的過程，即將二甲苯 （n）中取出的切片移入無(wú)水酒精^95%酒精^80%酒精^70%酒精t蒸餾水，各級(jí)中停留1—5 min。3、 染色：⑴、將蒸餾水洗滌后的切片移入Harris蘇木精液中5—10min，使細(xì)胞核著色。⑵、用自來(lái)水洗去切片上殘余的染液。⑶、用1%鹽酸酒精分色數(shù)分鐘。分色時(shí)就是褪去細(xì)胞質(zhì)不應(yīng)著色部分的顏色，而使細(xì)胞核著色得清晰適度。分色時(shí)需隨時(shí)用顯微鏡檢查切片，使分色適度。（4） 、入1%氨水或自來(lái)水浸洗，使之返藍(lán)。（5） 、在蒸餾水中浸片刻。（6）、0.5%伊紅酒精溶液中染色2—5min,使細(xì)胞質(zhì)著色。4、 脫水：切片依次入95%酒精（I）t95%酒精（n）t無(wú)水酒精（I）t無(wú)水酒精（n），各級(jí)（中停留1—5