PCR技術(shù)及其應(yīng)用-1

PCR技術(shù)及其應(yīng)用PCR技術(shù)原理5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

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TemplateDNA5

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一、基本工作原理目錄Cycle35

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25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。目錄模板DNA

特異性引物耐熱DNA聚合酶

dNTPsMg2+

二、PCR體系基本組成成分三、PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C實驗儀器電泳儀瓊脂糖凝膠電泳槽電泳技術(shù)（２）鑒定DNA分子量(3)膠回收純化DNAlow-meltagarosePCR儀PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點實驗結(jié)果PCR結(jié)果。1、對照(無模板)；2－6、PCR產(chǎn)物（5ul樣品）凝膠成像系統(tǒng)PCR的類型㈠巢式PCR㈦原位PCR㈡多重PCR㈧定量PCR㈢不對稱PCR㈨差異顯示PCR㈣共享引物PCR㈩重組PCR㈤錨定PCR(十一)RT-PCR㈥彩色PCR

(十二)RAPD----------

多重PCR:是指在一個單一反應(yīng)中同時擴增多個序列的反應(yīng)過程，能夠節(jié)省時間和精力。定量PCR技術(shù)是指以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn),通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測,進行PCR起始模板量的定量。用于擴增已知一端序列的目的DNA

錨定PCR：使用一條錨定引物就一條特異性引物擴增已知一端序列的目的DNA。

基本概念增效PCR（boosterPCR）當(dāng)擴增少于1000拷貝的模板DNA時會遇到兩個問題：一是形成引物二聚體，一是非特異擴增，消耗了引物和酶，而特異擴增片段產(chǎn)量降低。對于這種情況，可設(shè)置二步PCR，先用較低濃度的引物進行初級PCR，此時由于引物少，形成引物二聚體的可能減少，但它并不影響靶序列的擴增，只是由于引物少產(chǎn)量不高。約經(jīng)15～20個循環(huán)后補充產(chǎn)物量，以初級PCR產(chǎn)物為模板進行擴增，靶序列的產(chǎn)量將相應(yīng)增加。在同一PCR體系中加入數(shù)對PCR引物，如果這些引物的退火溫度相近，并且所覆蓋的區(qū)域不重疊，這樣的反應(yīng)體系可同時擴增多個DNA片段。多重PCR常用來檢測同一基因的多個外顯子的缺失，或在檢測缺失設(shè)置內(nèi)對照。多重PCR

巢式PCR：利用兩套PCR引物對進行兩輪PCR擴增反應(yīng)組成，在第一輪擴增中，外引物用以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在在內(nèi)引物的存在下進行第二輪擴增。差別顯示ＰＣＲ：是根據(jù)絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）結(jié)構(gòu)，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。不對稱PCR目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。用途：制備核酸序列測定的模板制備雜交探針基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究

高濃度引物低濃度引物PCR技術(shù)應(yīng)用研究基因克隆，DNA測序，分析突變(

制備雜交探針)遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測序，表達(dá)圖譜診斷遺傳疾病腫瘤感染性疾病，傳染性流行病判斷個體疾病易感性器官移植組織配型法醫(yī)學(xué)中個體識別、親子鑒定,

犯罪現(xiàn)場標(biāo)本分析大腸桿菌胰島素重組體+胰島素基因基因工程產(chǎn)品×MstⅡ酶切位點(GCTNAGG)5′3′正常基因5′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析RLFP分析法PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正?；蚝妥儺惢虻倪w移位置不同，借此可分析確定致病基因的存在。

PCR-SSCP過程：

---------------------------primer---------------------------↓32P-dNTP摻入PCR擴增產(chǎn)物

↓

變性↓

單鏈DNA↓中性聚丙烯酰胺凝膠電泳

↓12345自顯影↓1.為正常結(jié)果分析2、4、5純合患者3.為雜合子

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解鏈構(gòu)像DAN原理過程DMD：人類肌營養(yǎng)不良基因A：無外顯子8,12,17,19對應(yīng)條帶,說明病人外顯子8～19缺失B：病人A中未擴增外顯子帶的強度為C的一半,提示為區(qū)域缺失攜帶者C：正常人DMD基因外顯子的一般擴增形式多重PCR檢測DMD基因缺失不對稱PCR目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。用途：制備核酸序列測定的模板制備雜交探針基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究

高濃度引物低濃度引物反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)基因mRNA蛋白質(zhì)多肽鏈逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增TargetAmplificationNo.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon常規(guī)PCR方法的局限性分析：無法對起始模板準(zhǔn)確定量,只能對終產(chǎn)物進行分析必須在擴增后用電泳方法分