一種抗水癌的血清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物膜的制備及性能研究

一種抗水癌的血清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物膜的制備及性能研究

傳統(tǒng)的塑料包裝雖然方便，但很難分解，導致“白色”污染。因此，安全、無害、環(huán)保的原材料膜越來越受到重視。可食用膜是指通過浸漬等形式覆蓋于食品表面的一層由可食性物質組成的薄層,它可阻止或減少水分和氣體的遷移,并對食品起到機械保護的作用。以蛋白質為基料的可食膜在20世紀90年代以后成為可食膜研究的焦點。而蛋清蛋白作為一種來源廣泛的蛋白質,富含蛋白質約40種且包含人體所必須的8種氨基酸,人體對其消化吸收率在98%之上,已經(jīng)成為可食用膜的重要原料之一。但由于蛋白質的親水性導致蛋白膜的阻水性較差,如大豆蛋白膜的阻水性較大豆蛋白-羧甲基葡甘聚糖復合膜差。因此有必要對蛋白質進行改性,蛋白質的改性主要包括物理改性、化學改性以及酶法改性等方法。而通過美拉德反應對蛋白質進行糖基化則是化學改性的一種。美拉德反應主要是指還原糖與氨基酸、蛋白質之間通過羰氨縮合生成蛋白質-糖共價化合物的反應。研究表明應用美拉德反應可以改善蛋清蛋白的凝膠性和乳化性。Matsudomi等用半乳甘露聚糖通過美拉德反應對蛋清蛋白進行改性,結果顯示美拉德反應產(chǎn)物形成的凝膠其強度、持水性、透明性均有所提高。Kato等利用6-磷酸葡萄糖與卵白蛋白發(fā)生美拉德反應,結果顯示卵白蛋白的乳化性提高了5倍。此外,美拉德反應還可以改善蛋白膜的水蒸氣透過率。張曦等用木糖通過美拉德反應對乳清蛋白進行糖基化,得到的乳清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物膜同乳清蛋白相比,水蒸氣透過率降低約24%。并且美拉德反應產(chǎn)物具有良好的抗氧化性。美拉德產(chǎn)物可以抑制果蔬中的多酚氧化酶,如葡萄糖/果糖-谷胱甘肽的美拉德反應產(chǎn)物對蘋果中多酚氧化酶有抑制作用。Lee研究發(fā)現(xiàn),甘氨酸-葡萄糖體系加熱時,其美拉德反應產(chǎn)物對多酚氧化酶的抑制力隨加熱時間的延長而增強,也隨底物濃度的增大而增強。核桃仁含有60%~70%的脂肪,其中90%是人體必需的不飽和脂肪酸。這些不飽和脂肪酸能降低人體血清中的膽固醇,防止動脈粥樣硬化,利于嬰兒大腦發(fā)育和幼兒心臟發(fā)育,促進皮膚發(fā)育。然而,油脂易受光、熱、氧等因子影響發(fā)生脂質過氧化,從而降低其營養(yǎng)價值和商品價值。王若蘭等的研究表明,噴涂面筋蛋白膜可以顯著抑制核桃仁酸價的上升。狄建兵的研究表明大豆分離蛋白膜在一定程度上可以抑制核桃仁的脂質過氧化。周柏玲等的研究表明,玉米醇溶蛋白復合膜包衣及大豆分離蛋白膜對核桃仁的脂質過氧化都有很好的抑制效果。張曦等的研究表明,乳清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物膜可以有效地抑制核桃仁的脂質過氧化。但關于蛋清蛋白-糖美拉德反應產(chǎn)物膜對核桃仁的包裹國內文獻還沒有報道。本實驗首先研究不同糖類、不同pH、不同加熱溫度以及不同糖濃度對蛋清蛋白-糖美拉德反應進程的影響,通過蛋清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物在450nm處的吸光值和十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳確定反應程度,制備蛋清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物,進一步用蛋清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物制備膜,研究其成膜性以及水蒸氣透過率。最后用蛋清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物膜對核桃仁進行包裹,考察其對核桃仁酸價的影響。1材料和方法1.1改性乳化試劑及儀器核桃:農貿市場,去殼將核桃仁取出,選取大小均一的核桃仁包膜用(直徑為2.5~3cm);蛋清蛋白(EggWhiteProtein,EWP):蛋白質含量標示為78%以上,大連綠雪蛋品發(fā)展有限公司;甘油:分析純,北京京順化學試劑有限公司;木糖(Xylose):木糖含量標示為98.5%,北京嘉康源科技發(fā)展有限公司。DHG-9245A型電熱鼓風干燥箱:上海一恒科學儀器有限公司;水蒸氣透過率測定裝置:北京市智勤七翔塑料公司;Model680型酶標儀:BioRadLaboratoriesIncorporation。1.2實驗方法1.2.1蛋白飲料的配制市售蛋清蛋白粉在較高溫度(80、90℃)下發(fā)生凝固現(xiàn)象,因此在制備美拉德反應產(chǎn)物時首先將12g/100mL的蛋清蛋白溶液于14000×g離心40min,然后將上清液轉移至干凈燒杯中,加入蒸餾水稀釋,使得最終蛋清蛋白濃度為6g/100mL,然后將燒杯置于4℃冰箱中作為蛋清蛋白工作液。(1)不同糖類對蛋清蛋白-糖美拉德反應的影響:分別稱取木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖適量溶于蛋清蛋白工作液,使糖濃度為3g/100mL。調節(jié)pH至11,水浴鍋中90℃加熱30min,取出后冷卻至室溫,用酶標儀測定其在450nm處的吸光值,每組重復3次取平均值。(2)不同pH對蛋清蛋白-木糖美拉德反應的影響:將木糖溶于蛋清蛋白工作液,使其濃度為3g/100mL。調節(jié)pH至8、9、10、11,水浴鍋中90℃加熱30min,觀察是否有凝固現(xiàn)象,對無凝固現(xiàn)象的組別,將其取出后冷卻至室溫,用酶標儀測定其在450nm處的吸光值,每組重復3次取平均值。(3)不同加熱溫度對蛋清蛋白-木糖美拉德反應的影響:將木糖溶于蛋清蛋白工作液,使其濃度為3g/100mL。調節(jié)pH至11,水浴鍋中分別于60、70、80、90℃加熱30min,取出后冷卻至室溫,用酶標儀測定其在450nm處的吸光值,每組重復3次取平均值。(4)不同木糖濃度對蛋清蛋白-木糖美拉德反應的影響:稱取適量木糖溶于蛋清蛋白工作液,使其濃度分別為0、3、6、12g/100mL。調節(jié)pH至11,水浴鍋中90℃加熱30min,取出后冷卻至室溫,用酶標儀測定其在450nm處的吸光值,每組重復3次取平均值。1.2.2血清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物的分離純化取蛋清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,參照Jing和Kitts的方法并稍作改動:在凝膠玻璃板中先加入6.5mL15%的分離膠,室溫(20℃)靜置35min使其凝固,然后加入2.0mL5%的濃縮膠,室溫(20℃)靜置1.5h使其凝固。同時取稀釋后的蛋清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物50μL與等體積樣品處理液混合后煮沸5min,取出后冷卻至室溫(20℃)。加樣時每孔加樣15μL,電泳過程中當樣品經(jīng)過濃縮膠時,電壓為80V,經(jīng)過分離膠時,電壓為120V,經(jīng)1.5h后溴酚藍指示劑到達底端,電泳結束。取出膠用考馬斯亮藍-R250染色液染色12h,最后由脫色液脫色至條帶清晰可見。1.2.3調節(jié)體系ph水浴鍋加熱按照實驗設計比例(3、6g/100mL)稱取適量木糖溶于蛋清蛋白工作液,調節(jié)體系pH至11,水浴鍋中90℃加熱30min。取出冷卻至室溫(20℃),按照實驗設計比例加入甘油(0.7、1.0、1.3mL/100mL)混勻,然后倒入平皿(6mL),室溫(20℃)條件下成膜。1.2.4wvp的測定水蒸氣透過率(Watervaporpermeability,WVP)的測定采用擬杯子法:將膜密封于裝有5g無水氯化鈣(相對濕度0%)的自制有機玻璃透濕杯(杯口直徑為50mm)封口處,置于裝有飽和KBr溶液(相對濕度為80%)的密封干燥器內。在室溫條件下測定每個有機玻璃透濕杯在4h內每隔40min的質量增加量,記錄7次測定的結果,用來表示經(jīng)過膜進入測定裝置的水蒸氣質量。WVP計算公式為:式中:Δm為一定時間內WVP測定裝置的質量增加量,g;d為膜厚度,mm;ΔP為膜兩側的水蒸氣壓差,kPa。本實驗中,膜有效測定面積A值為0.00196m2,ΔP值為1.9377kPa。1.2.5核桃仁的制備制備最佳條件下和蛋清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物成膜溶液200mL(蛋清蛋白濃度6g/100mL,木糖濃度3g/100mL,甘油濃度1.0mL/100mL,pH11,90℃加熱30min),蛋清蛋白成膜溶液作為對照(蛋清蛋白濃度6g/100mL,甘油濃度1.6mL/100mL,pH8,40℃加熱30min)。經(jīng)過加熱的成膜溶液冷卻至室溫(20℃),挑選預先剝好的大小均一的核桃仁(直徑約2.5cm)浸入到成膜液中(每組150g,共4組),用玻璃棒輕輕攪拌5min,保證所有核桃仁被成膜溶液均勻包裹。將浸泡后的核桃仁置于鐵笊籬上瀝干溶液,鋪于硫酸紙上,在自然條件下晾干(約12h)。實驗前1d將盛有飽和KBr(相對濕度80%)的干燥器放入溫度為50℃或37℃的烘箱中進行平衡。第1組核桃仁裝在干凈燒杯中,將燒杯置于實驗室里干凈的抽屜中,將第2組、第3組以及第4組核桃仁置于平衡好后的干燥器中。每隔相同時間取出30g核桃仁,在研缽中磨碎成糜狀,在150mL石油醚中浸泡12h,2800×g離心10min。取上清液在40℃條件下真空旋轉蒸發(fā),得到核桃仁油脂備用。1.2.6核桃油脂的加標實驗根據(jù)GB/T5530—2005所提供的方法測定酸價:在50mL乙醇和乙醚(體積比為1:1)中加入3g核桃油脂。以酚酞為指示劑,用0.1mol/LKOH滴定至溶液呈淺粉色,記錄所消耗體積。根據(jù)下述公式計算酸價:式中:CKOH為KOH的摩爾濃度,mol/L;1.2.7分析過程學術研究數(shù)據(jù)的顯著性差異由Minitab軟件(MinitabInc.,PA,USA)進行分析。對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(Onewayanalysisofvariance,onewayANOVA),以Tukey多重比較進行檢驗,得到各組數(shù)據(jù)間的顯著性差異(p<0.05)。2結果與討論2.1不同的麥芽糖與氨基酸不同的糖同蛋清蛋白在90℃進行加熱,其反應產(chǎn)物的吸光值為木糖>果糖>葡萄糖>蔗糖(圖1)。這與吳慧玲等人用不同的糖類同賴氨酸進行美拉德反應時得出的木糖反應最快而蔗糖沒有顯示反應活性的結論是一致的。此外,王瑩在用不同糖類同谷氨酸進行美拉德反應時也得出結論D-木糖與谷氨酸反應得到的美拉德反應產(chǎn)物顏色最深。因此,最終選擇木糖作為同蛋清蛋白進行美拉德反應的糖。2.2ph11的變化不同的pH對蛋清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物有顯著性影響,在pH8、9時蛋清蛋白-木糖體系在90℃加熱發(fā)生凝固,而在pH10、11時無凝固現(xiàn)象發(fā)生,并且蛋清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物的吸光值隨著pH的增加而顯著增大(圖2)。即反應速率顯著提高,因此最終選擇pH11為蛋清蛋白-木糖美拉德反應的最終pH。蛋清蛋白-木糖用蒸餾水配制成溶液,其pH是6.8。在pH10時,蛋清蛋白與木糖發(fā)生反應,原有條帶開始變淺,但沒有明顯的新的條帶的出現(xiàn)。pH11時,蛋清蛋白原有條帶變淺并且在濃縮膠頂端可以看到有高聚物生成,證明了蛋清蛋白與木糖發(fā)生了美拉德反應,并且生成了大分子的物質(圖3)。不同糖類之間進行比較,蛋清蛋白與木糖交聯(lián)程度最大。蛋清蛋白同果糖進行反應時,原有條帶開始變淺,濃縮膠頂端也有高聚物的生成,但其帶的顏色較蛋清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物的顏色淺。蛋清蛋白同葡萄糖進行反應時,蛋清蛋白原有條帶變淺,在濃縮膠頂端有淺色的高聚物的條帶出現(xiàn)。蛋清蛋白與蔗糖進行反應,原有蛋清蛋白條帶沒有發(fā)生明顯變化,結合之前的吸光值變化,說明不同糖類同蛋清蛋白的反應活性順序為木糖>果糖>葡萄糖。而蔗糖沒有表現(xiàn)出反應活性(圖3)。2.3血清蛋白-木糖的制備隨著加熱溫度的升高,蛋清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物的吸光值顯著增大。經(jīng)60℃加熱30min的蛋清蛋白-木糖體系的吸光值與未加熱時無顯著性差異。而在90℃加熱30min,蛋清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物的吸光值已經(jīng)達到1.50,反應速率最快。因此最終選擇90℃加熱30min為加熱條件(圖4)。2.4克氏原螯蝦血清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物的吸光值木糖濃度為6g/100mL的蛋清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物的吸光值顯著大于木糖濃度為3g/100mL的蛋清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物的吸光值,而與木糖濃度為12g/100mL的蛋清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物的吸光值在整個加熱過程中都沒有顯著性差異(圖5)。2.5血清蛋白-木糖美德反應產(chǎn)物膜的水提取物含量2.5.1膜厚度和地震反應產(chǎn)物的透氣性能在甘油濃度為1%時,不加木糖的蛋清蛋白不能形成完整的膜,故無法測定膜厚度和水蒸氣透過率。而加入木糖的蛋清蛋白通過和木糖間的美拉德反應可以形成完整的黃色透明的膜。木糖濃度6g/100mL的蛋清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物膜的膜厚度和水蒸氣透過率都顯著大于木糖濃度為3g/100mL的蛋清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物膜(表1)。據(jù)報道,乳清蛋白膜與普魯蘭糖共同成膜時,水蒸氣透過率隨著糖質量濃度的增高而增高,張曦等人在制備乳清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物膜時,水蒸氣透過率也隨著木糖濃度的增高而增高,這可能是由于木糖中含有一定數(shù)量的-OH,使其親水性有所提高,從而降低了膜對水蒸氣的阻隔。另一方面,木糖濃度的增加會增加膜的厚度這也是導致其水蒸氣透過率增加的一個原因。為了保證膜較好的阻濕性能,因此最終選擇木糖濃度為3g/100mL。2.5.2甘油濃度對乳清蛋白膜透氣性能的影響隨著甘油濃度的增高,蛋清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物膜厚度和水蒸氣透過率增高(表2)。Gennadios等的研究結果也表明,甘油濃度的增高會降低蛋清蛋白膜的水蒸氣透過率,而McHugh等的研究結果也表明增塑劑的加入會增大乳清蛋白膜水蒸氣透過率,該結果與溶液孔徑隨甘油濃度的增高而增加有關,也與成膜的厚度有一定關系。綜合考慮最終選擇的蛋清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物膜的甘油濃度為1.0mL/100mL。2.6膜包裹對核桃仁酸價的影響貯藏條件為50℃加熱8d,貯藏過程中各組核桃仁的酸價均一直上升,且在第8天達到最大。貯藏8d后,第2組經(jīng)過加熱的未包膜的核桃仁酸價上升最多,經(jīng)蛋清蛋白包和蛋清蛋白-木糖美拉德反應產(chǎn)物膜包裹的核桃仁酸價比第2組降低15%,但經(jīng)過膜包裹的2組核桃仁的酸價之間無