基因克隆的基本理論及實(shí)驗(yàn)技術(shù)

基因克隆的基本原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)龍躍生2010年3月30日課時(shí)及內(nèi)容安排第一課時(shí):基因克隆的基本概念及理論知識第二課時(shí):基因克隆的操作過程及注意事項(xiàng)第三課時(shí):實(shí)驗(yàn)操作過程演示(錄像)第一課

基因克隆的基本概念及理論知識基因克隆的定義：

1.工具書上：

插入有同一個(gè)基因或DNA片段的重組質(zhì)粒的一個(gè)群體，這個(gè)群體是由一個(gè)重組質(zhì)粒增殖而來，通過基因克隆技術(shù)可獲得某個(gè)基因或DNA片段的克隆。2.學(xué)術(shù)文獻(xiàn)上：基因克隆是指在體外對DNA按照即定目的和方案進(jìn)行人工重組,將重組DNA進(jìn)行擴(kuò)增以獲得目的基因的大量拷貝。它是將DNA或基因組的DNA片段嵌入克隆載體，再將載體植入培養(yǎng)的宿主細(xì)胞?？茖W(xué)家將這一過程稱為基因克隆：基因表達(dá)需有調(diào)節(jié)的DNA片斷控制，要使克隆到的基因能表達(dá)、發(fā)揮作用，必須將其與調(diào)節(jié)單位連接起來。什么是基因？1、基因是存在于細(xì)胞內(nèi)有自體繁殖能力的遺傳單位。2、基因是一個(gè)具有遺傳功能的特定核苷酸序列的DNA片段。3、編碼一個(gè)RNA或一條多肽鏈的DNA片段稱為一個(gè)基因。4、基因是生物體遺傳的基本單位，存在于細(xì)胞的染色體上，作直線排列。5、基因通過指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成來傳遞遺傳信息，從而控制生物的性狀。染色體、DNA與基因之間的關(guān)系基因的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)蛋白的過程翻譯蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄初級轉(zhuǎn)錄本（hnRNA）加工成熟mRNA加帽加poly（A）基因（DNA）轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄終止信號轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)5’非翻譯區(qū)3’非翻譯區(qū)

RT-PCR雙鏈cDNART-PCR擴(kuò)增基因的編碼區(qū)序列mRNA5’AAAAAAAAAAAAAAAAA3’3’TTTTTTTTTTTT5’RT反應(yīng)TTTTTTTTTTTT5’單鏈cDNA3’PCR擴(kuò)增3’3’5’5’轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)（啟動子區(qū)）的擴(kuò)增基因（DNA）轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄終止信號轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)外顯子內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)PCR擴(kuò)增3’3’5’5’啟動子區(qū)序列基因的編碼區(qū)及啟動子區(qū)序列必須通過連接到質(zhì)粒上構(gòu)建成重組表達(dá)載體，然后進(jìn)行目的片段擴(kuò)增及功能研究。什么是質(zhì)粒（Plasmid）？質(zhì)粒是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。許多細(xì)菌除了染色體外，還有大量很小的環(huán)狀DNA分子，這就是質(zhì)粒(plasmid)。質(zhì)粒的重要特征（1）是染色質(zhì)外的環(huán)形雙鏈DNA分子；（2）能自主復(fù)制，是能獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子；（3）質(zhì)粒對宿主生存并不是必需的；（4）質(zhì)粒上常帶有耐抗生素基因；

（5）質(zhì)粒DNA上有多個(gè)酶切位點(diǎn)。限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）:是從細(xì)菌中分離出來的一種識別并切割特異的雙鏈DNA序列的內(nèi)切核酸酶。目前已從多種細(xì)菌中分離出超過400種，識別各自不同的核苷酸順序。GAATTCCTTGGAAAGCTTTTCGAAEcoRIGCTTGGAATTCAHindIIIATTCGAAGCTTA限制性核酸內(nèi)切酶的命名法則限制性核酸內(nèi)切酶的命名：一般是以微生物屬名的第一個(gè)字母和種名的前兩個(gè)字母組成，第四個(gè)字母表示菌株(品系)。例如：EcoRI是從大腸桿菌EscherichiacoliRY13中第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的內(nèi)切酶I。EEscherichia(屬)cocoli(種)RRY13(品系)I首先發(fā)現(xiàn)在此類細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的順序DNA連接酶是1967年在三個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn)的，最初是在大腸桿菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。它是一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5’-PO4與另一DNA鏈的3’-OH生成磷酸二酯鍵將兩條緊鄰DNA鏈連接起來。DNA連接酶GAATTCCTTGGA連接酶GCTTGGAATTCA連接酶CTGGACATTTAACTGATTGACTAA內(nèi)切酶和連接酶是基因克隆實(shí)驗(yàn)中兩種重要的工具酶，它們?nèi)缤肿由飳W(xué)家剪刀和針線，可以任意地將感興趣的基因片段進(jìn)行切割和連接，實(shí)現(xiàn)DNA序列的重組。質(zhì)粒(plasmid)和載體(vector)有什么區(qū)別？質(zhì)粒是指細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中的小型環(huán)狀DNA分子，是天然存在的，主要控制細(xì)菌的次級代謝。載體是指在基因工程中用以協(xié)載目的基因的小型環(huán)狀DNA分子，載體一般是經(jīng)過改造的質(zhì)粒，還包括病毒，部分高等生物細(xì)胞中的DNA。載體的種類克隆載體：一般是只用來在大腸桿菌中擴(kuò)增基因序列的拷貝數(shù)。表達(dá)載體：除了能擴(kuò)增基因序列的拷貝數(shù)之外，還能在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白，也可用鑒定基因表達(dá)調(diào)控元件的功能。根據(jù)表達(dá)目的蛋白所使用啟動子不同分為原核表達(dá)載體（原核啟動子）和真核表達(dá)載體（真核啟動子）。TA克隆載體TTAA酶切位點(diǎn)定向克隆的克隆載體EcoRI+HindIII切EcoRIHindIIIEcoRIHindIIIEcoRIHindIIIEcoRIHindIIIAAEcoRI+HindIII切PCR擴(kuò)增EcoRIHindIII表達(dá)載體根據(jù)表達(dá)目的蛋白所使用啟動子不同分為：原核表達(dá)載體（原核啟動子）真核表達(dá)載體（真核啟動子）原核表達(dá)載體真核表達(dá)載體目的蛋白表達(dá)載體中的表達(dá)盒啟動子（Promoter）基因編碼蛋白序列（CDS）轉(zhuǎn)錄終止信號區(qū)（CDS）基因克隆是將DNA或基因組的DNA片段嵌入克隆載體，再將載體植入培養(yǎng)的宿主細(xì)胞，進(jìn)行載體擴(kuò)增或表達(dá)蛋白。大腸桿菌大腸桿菌（Escherichiacoli，E.coli）革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能運(yùn)動，無芽孢。能發(fā)酵多種糖類產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，是人和動物腸道中的正常棲居菌，嬰兒出生后即隨哺乳進(jìn)入腸道，與人終身相伴，其代謝活動能抑制腸道內(nèi)分解蛋白質(zhì)的微生物生長，減少蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物對人體的危害，還能合成維生素B和K，以及有殺菌作用的大腸桿菌素。正常棲居條件下不致病。大腸桿菌在生物技術(shù)中的應(yīng)用大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主,遺傳背景清楚,技術(shù)操作簡單,培養(yǎng)條件簡單,大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì),倍受遺傳工程專家的重視.目前大腸桿菌是應(yīng)用最廣泛,最成功的表達(dá)體系,常做高效表達(dá)的首選體系。生物安全性生物工程用的菌株是在不斷篩選后被挑選出的菌株。這些菌株由于失去的細(xì)胞壁的重要組分，所以在自然條件下已無法生長。甚至普通的清潔劑都可以輕易地殺滅這類菌株。這樣，即便由于操作不慎導(dǎo)致活菌從實(shí)驗(yàn)室流出，也不易導(dǎo)致生化危機(jī)。此外，生物工程用的菌株基因組都被優(yōu)化過，使之帶有不同基因型（例如β半乳糖甘酶缺陷型），可以更好的用于分子克隆實(shí)驗(yàn)。基因克隆的實(shí)驗(yàn)常用菌株1：DH5a

常用于質(zhì)粒克隆的菌株。使用pUC系列質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化時(shí)，可與載體編碼的β－半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)α－互補(bǔ)。可用于藍(lán)白斑篩選鑒別重組菌株。2：TOP10該菌株適用于高效的DNA克隆和質(zhì)粒擴(kuò)增，能保證高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳。3：HB101該菌株遺傳性能穩(wěn)定，使用方便，適用于各種基因重組實(shí)驗(yàn)。4：JM109該菌株在使用pUC系列質(zhì)粒載體進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化或用M13