基因克隆的基本理論及實驗技術

基因克隆的基本原理及實驗技術龍躍生2010年3月30日課時及內容安排第一課時:基因克隆的基本概念及理論知識第二課時:基因克隆的操作過程及注意事項第三課時:實驗操作過程演示(錄像)第一課

基因克隆的基本概念及理論知識基因克隆的定義：

1.工具書上：

插入有同一個基因或DNA片段的重組質粒的一個群體，這個群體是由一個重組質粒增殖而來，通過基因克隆技術可獲得某個基因或DNA片段的克隆。2.學術文獻上：基因克隆是指在體外對DNA按照即定目的和方案進行人工重組,將重組DNA進行擴增以獲得目的基因的大量拷貝。它是將DNA或基因組的DNA片段嵌入克隆載體，再將載體植入培養(yǎng)的宿主細胞?？茖W家將這一過程稱為基因克?。夯虮磉_需有調節(jié)的DNA片斷控制，要使克隆到的基因能表達、發(fā)揮作用，必須將其與調節(jié)單位連接起來。什么是基因？1、基因是存在于細胞內有自體繁殖能力的遺傳單位。2、基因是一個具有遺傳功能的特定核苷酸序列的DNA片段。3、編碼一個RNA或一條多肽鏈的DNA片段稱為一個基因。4、基因是生物體遺傳的基本單位，存在于細胞的染色體上，作直線排列。5、基因通過指導蛋白質的合成來傳遞遺傳信息，從而控制生物的性狀。染色體、DNA與基因之間的關系基因的結構及其表達蛋白的過程翻譯蛋白質轉錄初級轉錄本（hnRNA）加工成熟mRNA加帽加poly（A）基因（DNA）轉錄起始調控區(qū)轉錄終止信號轉錄起始點外顯子內含子轉錄終止點5’非翻譯區(qū)3’非翻譯區(qū)

RT-PCR雙鏈cDNART-PCR擴增基因的編碼區(qū)序列mRNA5’AAAAAAAAAAAAAAAAA3’3’TTTTTTTTTTTT5’RT反應TTTTTTTTTTTT5’單鏈cDNA3’PCR擴增3’3’5’5’轉錄起始調控區(qū)（啟動子區(qū)）的擴增基因（DNA）轉錄起始調控區(qū)轉錄終止信號轉錄起始點外顯子內含子轉錄終止點PCR擴增3’3’5’5’啟動子區(qū)序列基因的編碼區(qū)及啟動子區(qū)序列必須通過連接到質粒上構建成重組表達載體，然后進行目的片段擴增及功能研究。什么是質粒（Plasmid）？質粒是染色體外能夠進行自主復制的遺傳單位，包括真核生物的細胞器和細菌細胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子?，F(xiàn)在習慣上用來專指細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質粒常被用做基因的載體。許多細菌除了染色體外，還有大量很小的環(huán)狀DNA分子，這就是質粒(plasmid)。質粒的重要特征（1）是染色質外的環(huán)形雙鏈DNA分子；（2）能自主復制，是能獨立復制的復制子；（3）質粒對宿主生存并不是必需的；（4）質粒上常帶有耐抗生素基因；

（5）質粒DNA上有多個酶切位點。限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶（restrictionendonuclease）:是從細菌中分離出來的一種識別并切割特異的雙鏈DNA序列的內切核酸酶。目前已從多種細菌中分離出超過400種，識別各自不同的核苷酸順序。GAATTCCTTGGAAAGCTTTTCGAAEcoRIGCTTGGAATTCAHindIIIATTCGAAGCTTA限制性核酸內切酶的命名法則限制性核酸內切酶的命名：一般是以微生物屬名的第一個字母和種名的前兩個字母組成，第四個字母表示菌株(品系)。例如：EcoRI是從大腸桿菌EscherichiacoliRY13中第一個發(fā)現(xiàn)的內切酶I。EEscherichia(屬)cocoli(種)RRY13(品系)I首先發(fā)現(xiàn)在此類細菌中發(fā)現(xiàn)的順序DNA連接酶是1967年在三個實驗室同時發(fā)現(xiàn)的，最初是在大腸桿菌細胞中發(fā)現(xiàn)的。它是一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5’-PO4與另一DNA鏈的3’-OH生成磷酸二酯鍵將兩條緊鄰DNA鏈連接起來。DNA連接酶GAATTCCTTGGA連接酶GCTTGGAATTCA連接酶CTGGACATTTAACTGATTGACTAA內切酶和連接酶是基因克隆實驗中兩種重要的工具酶，它們如同分子生物學家剪刀和針線，可以任意地將感興趣的基因片段進行切割和連接，實現(xiàn)DNA序列的重組。質粒(plasmid)和載體(vector)有什么區(qū)別？質粒是指細菌細胞質中的小型環(huán)狀DNA分子，是天然存在的，主要控制細菌的次級代謝。載體是指在基因工程中用以協(xié)載目的基因的小型環(huán)狀DNA分子，載體一般是經(jīng)過改造的質粒，還包括病毒，部分高等生物細胞中的DNA。載體的種類克隆載體：一般是只用來在大腸桿菌中擴增基因序列的拷貝數(shù)。表達載體：除了能擴增基因序列的拷貝數(shù)之外，還能在原核或真核細胞中表達目的蛋白，也可用鑒定基因表達調控元件的功能。根據(jù)表達目的蛋白所使用啟動子不同分為原核表達載體（原核啟動子）和真核表達載體（真核啟動子）。TA克隆載體TTAA酶切位點定向克隆的克隆載體EcoRI+HindIII切EcoRIHindIIIEcoRIHindIIIEcoRIHindIIIEcoRIHindIIIAAEcoRI+HindIII切PCR擴增EcoRIHindIII表達載體根據(jù)表達目的蛋白所使用啟動子不同分為：原核表達載體（原核啟動子）真核表達載體（真核啟動子）原核表達載體真核表達載體目的蛋白表達載體中的表達盒啟動子（Promoter）基因編碼蛋白序列（CDS）轉錄終止信號區(qū)（CDS）基因克隆是將DNA或基因組的DNA片段嵌入克隆載體，再將載體植入培養(yǎng)的宿主細胞，進行載體擴增或表達蛋白。大腸桿菌大腸桿菌（Escherichiacoli，E.coli）革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能運動，無芽孢。能發(fā)酵多種糖類產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，是人和動物腸道中的正常棲居菌，嬰兒出生后即隨哺乳進入腸道，與人終身相伴，其代謝活動能抑制腸道內分解蛋白質的微生物生長，減少蛋白質分解產(chǎn)物對人體的危害，還能合成維生素B和K，以及有殺菌作用的大腸桿菌素。正常棲居條件下不致病。大腸桿菌在生物技術中的應用大腸桿菌作為外源基因表達的宿主,遺傳背景清楚,技術操作簡單,培養(yǎng)條件簡單,大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟,倍受遺傳工程專家的重視.目前大腸桿菌是應用最廣泛,最成功的表達體系,常做高效表達的首選體系。生物安全性生物工程用的菌株是在不斷篩選后被挑選出的菌株。這些菌株由于失去的細胞壁的重要組分，所以在自然條件下已無法生長。甚至普通的清潔劑都可以輕易地殺滅這類菌株。這樣，即便由于操作不慎導致活菌從實驗室流出，也不易導致生化危機。此外，生物工程用的菌株基因組都被優(yōu)化過，使之帶有不同基因型（例如β半乳糖甘酶缺陷型），可以更好的用于分子克隆實驗?；蚩寺〉膶嶒灣Ｓ镁?：DH5a

常用于質粒克隆的菌株。使用pUC系列質粒載體轉化時，可與載體編碼的β－半乳糖苷酶氨基端實現(xiàn)α－互補。可用于藍白斑篩選鑒別重組菌株。2：TOP10該菌株適用于高效的DNA克隆和質粒擴增，能保證高拷貝質粒的穩(wěn)定遺傳。3：HB101該菌株遺傳性能穩(wěn)定，使用方便，適用于各種基因重組實驗。4：JM109該菌株在使用pUC系列質粒載體進行DNA轉化或用M13