微生物學(xué)課件：第四章 非細(xì)胞微生物的形態(tài)與結(jié)構(gòu)

第四章

非細(xì)胞微生物的形態(tài)與結(jié)構(gòu)病毒與我們？HerpesSimplexVirus(HSV)郁金香碎色病煙草花葉?。═MV）甲型H1N1流感病及其病原體本章主要內(nèi)容病毒概述；病毒的形態(tài)和化學(xué)組分；病毒的繁殖方式；病毒的培養(yǎng)和純化；病毒的分類噬菌體概述；噬菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成；噬菌體的繁殖；噬菌體與發(fā)酵工業(yè)；噬菌體的其他利用亞病毒類病毒；擬病毒；朊病毒第一節(jié)病毒一、概述二、病毒的形態(tài)和化學(xué)組分三、病毒的繁殖方式四、病毒的培養(yǎng)和純化五、病毒的分類一、概述（一）病毒病的表象認(rèn)知時(shí)代1、郁金香碎色病－－植物病毒病郁金香碎色病健康郁金香一、概述（一）病毒病的表象認(rèn)知時(shí)代2、天花病16世紀(jì)，我國(guó)明代率先發(fā)明人痘接種法，預(yù)防天花，并隨后飄洋過(guò)海傳播到日本和歐洲各國(guó)。1796年，英國(guó)鄉(xiāng)村醫(yī)生EdwardJenner（1749-1823）接種牛痘預(yù)防天花試驗(yàn)成功。3、狂犬病1884年巴斯德發(fā)明了狂犬疫苗。1885年巴士德首次使用狂犬疫苗進(jìn)行治療一、概述（一）病毒病的表象認(rèn)知時(shí)代一、概述（二）有“毛病”的過(guò)濾器和病毒的發(fā)現(xiàn)1886年德國(guó)人MayerA發(fā)現(xiàn)具有傳染性的煙草花葉病，但是他指出是由細(xì)菌引起的。1892年俄國(guó)IvanovskiD發(fā)現(xiàn)煙草花葉病病原體能通過(guò)細(xì)菌濾器，還能引起煙草花葉病。認(rèn)為是由細(xì)菌產(chǎn)生的毒素造成的。1898年荷蘭細(xì)菌學(xué)家BeijerinckMW對(duì)煙草花葉病病原體進(jìn)行研究致病因子不是細(xì)菌，而是比細(xì)菌小的、具有傳染性的活的流質(zhì)－－病毒引起煙草花葉病的致病因子特點(diǎn)：能通過(guò)細(xì)菌過(guò)濾器；僅能在感染的細(xì)胞內(nèi)繁殖；在體外非生命物質(zhì)中不能生長(zhǎng)。1900年前后德國(guó)細(xì)菌學(xué)家Loeffler和Frosh發(fā)現(xiàn)引起牛口蹄疫的病原也可以通過(guò)細(xì)菌濾器，從而再次證明伊萬(wàn)諾夫斯基和貝杰林克的重大發(fā)現(xiàn)。1915年英國(guó)人Twort、1917年法國(guó)人d’Herelle分別發(fā)現(xiàn)細(xì)菌（Shigelladysenteriae）病毒-----噬菌體一、概述（三）病毒的本質(zhì)1935年，美國(guó)生物化學(xué)家WMStanley從患有花葉病的煙草的提純汁液中分析出一種蛋白晶體，將這種晶體再溶解后，保持了它的致病性，從而認(rèn)為病毒是一種蛋白質(zhì)。英國(guó)的Bawden和Pirie提出疑問(wèn)（？），因?yàn)樗麄儼l(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒的提純液及晶體中還含有相當(dāng)量的硫和磷，磷是蛋白質(zhì)沒(méi)有而核酸有的。Bawden等證明煙草花葉病毒的本質(zhì)為核蛋白電鏡的貢獻(xiàn)20世紀(jì)30年代后期電鏡的發(fā)展，可以直接觀察到病毒顆粒的形態(tài)。1940年Kausche首先用電鏡觀察到煙草花葉病毒顆粒。證明病毒顆粒的內(nèi)部是核酸，外面包裹著蛋白質(zhì)，有些病毒顆粒外邊被囊膜包裹著

TMV病毒是由蛋白質(zhì)和核酸兩個(gè)部分組成。隨后的研究又證實(shí)核酸可分為RNA和DNA兩類。1936年后經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)證明核酸是病毒感染、致病及復(fù)制的主體。施拉姆（Schramm）等研究者也證明了T噬菌體侵入細(xì)菌內(nèi)部的是其核酸DNA，而留在細(xì)菌外壁的是其蛋白質(zhì)外殼。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，有些病毒除含有核酸和蛋白質(zhì)外，還含有一定量的脂類物質(zhì)及碳水化合物。一、概述（四）病毒的定義和特點(diǎn)定義：病毒是一類比較原始的、有生命特征的、能夠自我復(fù)制和嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的非細(xì)胞生物。特點(diǎn)（初步認(rèn)識(shí)）：形態(tài)及其微小，一般能通過(guò)細(xì)菌濾器，必須在電鏡下才能觀察；有細(xì)胞構(gòu)造，主要成分僅為核酸和蛋白質(zhì)；一種病毒只含一種核酸，DNA或RNA；在離體條件下，能以無(wú)生命力的大分子狀態(tài)存在，并可長(zhǎng)期保持其侵染活力。有的病毒甚至沒(méi)有蛋白質(zhì)，只含有具有單獨(dú)侵染性的較小型的核糖核酸（RNA）分子－－－類病毒；有的病毒只含有不具備侵染性的RNA－－擬病毒；有的病毒沒(méi)有核酸而有感染性的蛋白質(zhì)顆粒－－－朊病毒。

以上統(tǒng)稱為亞病毒

病毒的基本類型名稱基本特征（真）病毒至少含有蛋白質(zhì)和核酸兩類物質(zhì)亞病毒類病毒含有具有單獨(dú)侵染性的核糖核酸（RNA）分子擬病毒只含有不具備侵染性的RNA朊病毒沒(méi)有核酸而有感染性的蛋白質(zhì)顆粒第一節(jié)病毒一、概述二、病毒的形態(tài)和化學(xué)組分三、病毒的繁殖方式四、病毒的培養(yǎng)和純化五、病毒的分類二、病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組分病毒形態(tài)病毒結(jié)構(gòu)病毒的化學(xué)組成Viralsizesandshapes-Variationsinshapesandsizesofvirusescomparedwithabacterialcell,ananimalcellandaeukaryoticribosome.

流感病毒絲狀有被膜病毒狂犬病毒子彈形病毒脊髓灰質(zhì)炎病毒球形病毒痘病毒磚形病毒埃博拉病毒線狀T4噬菌體蝌蚪形病毒病毒顆粒（病毒粒子）指成熟的、結(jié)構(gòu)完整的、具有侵染性的單個(gè)病毒個(gè)體。病毒形狀桿狀球狀蝌蚪狀絲狀線狀子彈形磚狀病毒殼體的結(jié)構(gòu)類型

及其與病毒顆粒形狀的關(guān)系病毒的殼體有三種結(jié)構(gòu)類型螺旋對(duì)稱殼體二十面對(duì)稱殼體復(fù)合對(duì)稱殼體螺旋對(duì)稱殼體亞基有規(guī)律地沿著中心軸（核酸）呈螺旋排列，進(jìn)而形成高度有序、對(duì)稱的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。病毒顆粒為直桿狀、彎曲桿狀和線狀等很多植物病毒為堅(jiān)硬的桿狀；一些植物病毒和噬菌體為軟而能彎曲的纖維狀；昆蟲(chóng)核型多角體病毒多為桿狀；二十面對(duì)稱殼體蛋白質(zhì)亞基圍繞具立方對(duì)稱的正多面體的角或邊排列，進(jìn)而形成一個(gè)封閉的蛋白質(zhì)的鞘。病毒顆粒為球狀大部分動(dòng)物病毒和少數(shù)植物病毒呈球狀。

二十面殼體結(jié)構(gòu)復(fù)合對(duì)稱殼體包裝有病毒核酸的頭部通常呈二十面體對(duì)稱，尾部呈螺旋對(duì)稱。病毒為蝌蚪狀、磚塊狀。噬菌體為蝌蚪形。某些動(dòng)物病毒呈復(fù)雜形狀，如豆病毒呈磚塊狀。二、病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組分病毒形態(tài)病毒結(jié)構(gòu)病毒的化學(xué)組成TheComponentsofaPlantVirus,

anAnimalVirusandaPhage

核殼（nucleocapsid）：蛋白質(zhì)殼體+核酸（核心），又稱核衣殼。裸露病毒顆粒僅由核衣殼構(gòu)成的病毒顆粒具包膜病毒顆粒核衣殼外具一層脂蛋白膜，由宿主細(xì)胞膜衍生而來(lái)病毒以出芽方式成熟時(shí)獲得作用：保護(hù)病毒核殼；啟動(dòng)病毒感染；病毒的附屬物－－刺突流感病毒（示刺突）腺病毒（示刺突）多角體病毒某些昆蟲(chóng)病毒核衣殼外面有很多蛋白質(zhì)晶體包被，形成多角形的包涵體，呈四面、長(zhǎng)方、六面和十二面等，所以稱為多角體病毒。棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒

油桐尺蠖核型多角體病毒昆蟲(chóng)質(zhì)型多角體病毒噬菌體的結(jié)構(gòu)（見(jiàn)下節(jié)）二、病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組分病毒形態(tài)病毒結(jié)構(gòu)病毒的化學(xué)組成毒粒（化學(xué)組成）核酸；蛋白質(zhì)；脂類；碳水化合物；基本化學(xué)組成病毒顆粒在化學(xué)上表現(xiàn)為核蛋白病毒的核酸核酸是病毒的遺傳物質(zhì)；一種病毒的毒粒只含有一種核酸：DNA或RNA病毒核酸單鏈DNA（ssDNA）；雙鏈DNA（dsDNA）；單鏈RNA（ssRNA）；雙鏈RNA（dsRNA）；不同病毒的核酸均可能具有各自不同的結(jié)構(gòu)特征病毒的蛋白質(zhì)病毒蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白非結(jié)構(gòu)蛋白病毒基因組編碼的，在病毒復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生并具有一定功能，但并不結(jié)合于毒粒中的蛋白質(zhì)構(gòu)成一個(gè)形態(tài)成熟的有感染性的病毒顆粒所必需的蛋白質(zhì)殼體蛋白；包膜蛋白；存在于毒粒中的酶；參與病毒的入侵或復(fù)制（如T4噬菌體的溶菌酶、一些病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶等）保護(hù)作用啟動(dòng)感染（決定感染的特異性）病毒的脂類許多病毒的包膜內(nèi)存在有脂類化合物（磷脂、脂肪酸、甘油三酸脂和膽固醇等）。這些脂類幾乎都是由病毒粒子在細(xì)胞內(nèi)成熟，在細(xì)胞膜處以葡生方式釋放，直接從寄主細(xì)胞膜上得到。病毒脂類存在與病毒的吸附和侵入有關(guān)。病毒的碳水化合物有的病毒還含有少量的碳水化合物有包膜病毒中碳水化合物以寡糖側(cè)鏈的形式與蛋白質(zhì)結(jié)合形成包膜糖蛋白。第一節(jié)病毒一、概述二、病毒的形態(tài)和化學(xué)組分三、病毒的繁殖方式四、病毒的培養(yǎng)和純化五、病毒的分類三、病毒的繁殖方式－－病毒的復(fù)制病毒生長(zhǎng)繁殖的特點(diǎn)：嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生物，只能在活細(xì)胞內(nèi)繁殖毒粒宿主細(xì)胞有繁殖性的病毒基因組具有感染性的毒粒消失病毒基因組復(fù)制、表達(dá)病毒核酸和蛋白質(zhì)裝配形成具有感染性的毒粒釋放至細(xì)胞外原料；能量；生物合成場(chǎng)所；病毒的復(fù)制（replication)病毒感染敏感宿主細(xì)胞后，病毒核酸進(jìn)入細(xì)胞，通過(guò)其復(fù)制與表達(dá)產(chǎn)生子代病毒基因組和新的蛋白質(zhì)，然后由這些新合成的病毒組分裝配（assembly）成子代毒粒，并以一定方式釋放到細(xì)胞外。病毒的這種特殊繁殖方式稱做復(fù)制.病毒復(fù)制過(guò)程吸附侵入脫殼生物合成裝配釋放吸附病毒吸附蛋白（virusattachmentprotein,VAP）一般由衣殼蛋白或包膜上的糖蛋白突起充當(dāng)。細(xì)胞表面受體（也稱為病毒受體，virusreceptor）則為有效結(jié)合病毒粒子的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)。大多數(shù)噬菌體的病毒受體為細(xì)菌細(xì)胞壁上的磷壁酸分子、脂多糖分子以及糖蛋白復(fù)合物；有的則位于菌毛、鞭毛或莢膜上。大部分動(dòng)物病毒的病毒受體為鑲嵌在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層中的糖蛋白，也有的是糖脂或唾液酸寡糖苷。植物病毒迄今尚未發(fā)現(xiàn)有特異性細(xì)胞受體，其進(jìn)入植物細(xì)胞的機(jī)制是通過(guò)傷口或媒介傳播。吸附吸附于大腸桿菌性毛和菌體上的噬菌體病毒的細(xì)胞受體具有種系和組織特異性，決定了病毒的宿主譜。不同種屬的病毒其細(xì)胞受體不同；同種不同型的病毒、同型不同株的病毒細(xì)胞受體不同；有些不同種屬的病毒卻有相同的細(xì)胞受體，其吸附和感染可對(duì)其它病毒的感染產(chǎn)生干擾。VAP與病毒受體的結(jié)合需要一定的溫度條件。在0-37℃內(nèi)溫度越高病毒吸附效率也越高。病毒吸附細(xì)胞的過(guò)程可在幾分鐘到幾十分鐘的時(shí)間內(nèi)完成。侵入病毒吸附后幾乎立即發(fā)生侵入侵入是依賴于能量的感染步驟不同的病毒-宿主系統(tǒng)病毒侵入機(jī)制不同病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的方式病毒直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)吞（胞吞方式）膜融合注射式侵入其它特殊的侵入方式動(dòng)物病毒侵入方式①裸露的病毒直接進(jìn)入方式；②毒粒包膜與細(xì)胞質(zhì)膜的融合：膜融合是有包膜病毒侵入過(guò)程中，病毒包膜與細(xì)胞膜融合的一種侵入方式。③細(xì)胞的內(nèi)吞功能：細(xì)胞內(nèi)吞是動(dòng)物病毒的常見(jiàn)侵入方式。經(jīng)細(xì)胞膜內(nèi)陷形成吞噬泡，使病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。動(dòng)物病毒侵入方式①裸露的病毒直接進(jìn)入方式；③細(xì)胞的內(nèi)吞功能；②

毒粒包膜與細(xì)胞質(zhì)膜的融合；吞噬泡（吞噬體）吞噬小體有尾噬菌體侵入方式注射方式將噬菌體核酸注入細(xì)胞通過(guò)尾部刺突固著于細(xì)胞；尾部的酶水解細(xì)胞壁的肽聚糖，是細(xì)胞壁產(chǎn)生小孔；尾鞘收縮，核酸通過(guò)中空的尾管壓入胞內(nèi)，蛋白質(zhì)外殼留在胞外；吸附刺突固著尾鞘收縮尾管穿入DNA注入植物病毒侵入方式通過(guò)天然的外壁孔侵入；通過(guò)植物細(xì)胞間的胞間連絲侵入細(xì)胞；通過(guò)因人為地機(jī)械損傷所形成的微傷口進(jìn)入細(xì)胞；靠攜帶有病毒的媒介，主要靠是有吮吸式口器的昆蟲(chóng)取食將病毒帶入細(xì)胞。脫殼脫殼是指病毒感染性核酸從衣殼內(nèi)釋放出來(lái)的過(guò)程。有包膜病毒脫殼包括脫包膜和脫衣殼兩個(gè)步驟；無(wú)包膜病毒只需脫衣殼，脫殼方式以內(nèi)吞方式或直接進(jìn)入細(xì)胞的病毒粒子，經(jīng)蛋白酶的降解，先后脫去包膜和衣殼。以膜融合方式侵入的病毒，其包膜在與細(xì)胞膜融合時(shí)即已脫掉，核衣殼被移至脫殼部位并在酶的作用下進(jìn)一步脫殼，病毒核酸游離并進(jìn)至細(xì)胞的一定部位進(jìn)行生物合成。注射式侵入的噬菌體和某些直接侵入的病毒可以直接在細(xì)胞膜或細(xì)胞壁表面同步完成侵入和脫殼病毒脫殼必須有酶－脫殼酶的參與，脫殼酶來(lái)自宿主細(xì)胞，有的為病毒基因編碼。生物合成病毒借助宿主細(xì)胞提供的原料、能量和場(chǎng)所合成核酸和蛋白質(zhì)，期間所需的多數(shù)酶也來(lái)自宿主細(xì)胞。在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后生物合成階段，胞漿中無(wú)病毒顆粒，稱為隱晦期（eclipse）。病毒大分子的合成病毒基因組的表達(dá)與復(fù)制存在著強(qiáng)烈的時(shí)序性病毒基因組進(jìn)入胞內(nèi)宿主細(xì)胞的代謝發(fā)生改變病毒利用宿主的生物合成機(jī)構(gòu)和場(chǎng)所，使病毒核酸表達(dá)和復(fù)制，產(chǎn)生大量的病毒蛋白質(zhì)和核酸。病毒生物合成的第一步是病毒mRNA的合成病毒復(fù)制所需要的病毒特異性酶蛋白及蛋白質(zhì)外殼的合成（5種核酸，6條途徑）裝配（成熟、形態(tài)發(fā)生）新合成的毒粒結(jié)構(gòu)組分組裝成完整的病毒顆粒，稱做病毒的裝配，亦稱成熟（maturation）或形態(tài)發(fā)生（morphogenesis）。絕大多數(shù)DNA病毒在細(xì)胞核內(nèi)組裝；RNA病毒與痘病毒類則在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)組裝。無(wú)包膜病毒組裝成核衣殼即為成熟的病毒粒子病毒的早期蛋白，即非病毒結(jié)構(gòu)成分不組裝入病毒，殘留在感染細(xì)胞中。在病毒成熟位點(diǎn)常見(jiàn)的完整毒?；蚯皻んw累積形成大量類結(jié)晶簇T4噬菌體的裝配是一個(gè)極為復(fù)雜的自我裝配的過(guò)程T4噬菌體的裝配毒粒的釋放裸露的病毒毒粒和有包膜的病毒毒粒釋放的機(jī)制有所不同:裸露病毒經(jīng)常裂解宿主細(xì)胞而被釋放有包膜病毒的包膜形成和釋放通常同時(shí)進(jìn)行，宿主細(xì)胞在一段時(shí)間可以持續(xù)釋放病毒病毒的包膜形成和釋放同時(shí)進(jìn)行病毒的釋放有包膜的動(dòng)物病毒是在從宿主細(xì)胞核芽出或細(xì)胞質(zhì)膜芽出的過(guò)程中裹上包膜而形成包膜病毒病毒的釋放有包膜病毒的裝配與釋放有時(shí)也是同時(shí)完成的大多數(shù)噬菌體都是以裂解細(xì)胞方式釋放病毒的釋放絲桿噬菌體（如M13或fd）不殺死細(xì)胞，毒粒以分泌方式不斷從受染細(xì)胞中釋放，并同時(shí)完成毒粒的組裝。病毒的釋放感染周期或復(fù)制周期從單個(gè)病毒吸附開(kāi)始至所有病毒釋放，此過(guò)程稱為感染周期或復(fù)制周期。

第一節(jié)病毒一、概述二、病毒的形態(tài)和化學(xué)組分三、病毒的繁殖方式四、病毒的培養(yǎng)和純化五、病毒的分類四、病毒的培養(yǎng)和純化病毒的培養(yǎng)－二元培養(yǎng)物法病毒的培養(yǎng)特征病毒的純化動(dòng)物病毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雞胚多種細(xì)胞培養(yǎng)1、動(dòng)物病毒培養(yǎng)方法雞胚培養(yǎng)法病毒侵染后典型癥狀－pocks動(dòng)物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)技術(shù)感染腺病毒18h后的組織培養(yǎng)的狀態(tài)病毒的致細(xì)胞病變效應(yīng)組織培養(yǎng)中正常的哺乳動(dòng)物細(xì)胞2、植物病毒培養(yǎng)方法植物組織培養(yǎng)方法植物細(xì)胞培養(yǎng)方法原生質(zhì)體培養(yǎng)方法葉片發(fā)生花葉、黃化、紅化癥狀；植株矮化、叢枝、畸形形成枯斑、壞死煙草曲葉病毒病植物病毒敏感植物葉片產(chǎn)生壞死斑，或稱枯斑植物組織培養(yǎng)方法噬菌體的培養(yǎng)方法噬菌體細(xì)菌培養(yǎng)物培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板細(xì)菌培養(yǎng)液變清亮細(xì)菌平板成為殘跡平板若是噬菌體樣經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋再接種細(xì)菌平板，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng)，在細(xì)菌菌苔上可形成圓形局部透明區(qū)域，即噬菌斑（plague）噬菌體在熒光假單胞菌菌苔上形成的噬菌斑部分大腸桿菌T系噬菌體在大腸桿菌菌苔上產(chǎn)生的噬菌斑。噬菌斑表型有顯著差別。四、病毒的培養(yǎng)和純化病毒的培養(yǎng)－二元培養(yǎng)物法病毒的培養(yǎng)特征病毒的純化病毒培養(yǎng)特征－群體特征空斑：是由動(dòng)物病毒在宿主單層細(xì)胞培養(yǎng)物上所形成的局部病損區(qū)域?？莅撸菏怯芍参锊《驹谥参锶~片上所形成的病斑。噬菌斑：是指病毒侵染細(xì)菌在細(xì)菌菌苔上所形成的負(fù)菌落（空斑）。包涵體：是病毒侵染動(dòng)植物細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)所形成的一種群體特征。也就是存在于動(dòng)植物細(xì)胞中的病毒。四、病毒的培養(yǎng)和純化病毒的培養(yǎng)－二元培養(yǎng)物法病毒的培養(yǎng)特征病毒的純化

蛋白質(zhì)提純方法（鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、凝膠層析、離子交換等）病毒的純化純化標(biāo)準(zhǔn)純化的病毒制備物應(yīng)保持其感染性病毒是有感染性的生物體病毒具有化學(xué)大分子的屬性純化的病毒制備物的理化性質(zhì)應(yīng)具有均一性

方法主要化學(xué)組成為蛋白質(zhì)具有一定的大小、形狀和密度差速離心梯度離心（超速離心）常用的病毒純化方法1、差速和密度梯度離心法（differentialanddensitygradientcentrifugation）2、病毒沉淀法（precipitationofvirus）：過(guò)飽和硫酸銨3、雜質(zhì)變性法（denaturationofcontaminants）：加熱或改變pH使雜質(zhì)變性；丙酮、氯仿等有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)等雜質(zhì)變性4、細(xì)胞組分的酶消化法（enzymaticdigestionofcellconstituents）：核酶、蛋白酶降解細(xì)胞中的核酸核蛋白質(zhì)。病毒對(duì)其具有較強(qiáng)抗性。第一節(jié)病毒一、概述二、病毒的形態(tài)和化學(xué)組分三、病毒的繁殖方式四、病毒的培養(yǎng)和純化五、病毒的分類ClassificationofvirusesHistorically,virologistsclassifiedvirusesbythetypeofhoststructurestheyinfected.Bacteriaviruses(bacteriophage)plantvirusesanimalviruses.Virusescanalsobeclassifiedinregardstothespecifictissuetheyinfect

–dermotropic,neurotropic,pneumotropicandviscerotropic.ClassificationofvirusesDiscoveriesatthebiochemicalandmolecularlevelsallowedvirusestobeclassifiedbasedon;TypeandstructureoftheirNA.Methodofreplication.Hostrange.Otherphysicalandchemicalcharacteristics.1966–

InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses(ICTV)formedtoestablishasingle,universaltaxonomicschemeforviruses.VirusfamiliesareoftendistinguishedbytheirNAtype,capsidshape,envelopeandsize.GroupContains

I

dsDNAviruses

II

ssDNAviruses

III

dsRNAviruses

IV

(+)ssRNAviruses

V

(-)ssRNAviruses

VI

ssRNA-RTviruses

VII

dsDNA-RTvirusesBaltimoreclassificationss:single-stranded,ds:doublestranded

RT:reversetranscribingExampleofRNAvirusPolio(Enterovirus).Oncovirus(Reterovirus).TheAIDSvirus–alsoaRetrovirus.Rabiesvirus(Rhabdovirus).Fluvirus(Orthomyxovirus)Picornaviruses–verysmall,naked,polyhedral,(+)senseRNAviruses.TheyincludetheEnterovirus,Hepatovirus,andRhinovirus.Poliovirus71,500XRetroviruses

–envelopedvirusesthathavetwocompletecopiesof(+)senseRNA.Theyalsocontaintheenzymereversetranscriptase,whichusestheviralRNAtoformacomplementarystrandofDNA,whichisthenreplicatedtoformdsDNA.Oncovirus42,500XRhabdovirus

–

Thecapsidishelicalandmakesthevirusnearlyrodorbullet-shaped.ContainanRNA-dependentRNApolymerasethatusesthe(-)sensestrandtoforma(+)sensestrandthatservesasamRNAandtemplateforsynthesisofnewviralRNA.Rabiesvirus164,121XOrthomyxovirus–mediumsized,envelope,(-)sensethatvaryinshapefromsphericaltohelical.Theirgenomeissegmentedintoeightpieces.Influenzavirus186,098XExamplesofDNAvirusHerpes(Herpesvirus).Humanpapillomavirus(warts).Parvovirus(causesdiseaseinanimals–nothumans).Herpesvirus

–relativelylarge,envelopedwithlineardsDNA.Widelydistributedinnature,andmostanimalsareinfectedwithoneormoreofthe100typesdiscovered.Herpesvirus148,924X第二節(jié)噬菌體一、概述二、噬菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成三、噬菌體的繁殖四、噬菌體與發(fā)酵工業(yè)五、噬菌體的其他利用一、概述1、噬菌體的發(fā)現(xiàn)1915年英國(guó)人Twort培養(yǎng)葡萄球菌時(shí)發(fā)現(xiàn)菌落出現(xiàn)透明斑。1917年法國(guó)人d’Herelle觀察到痢疾桿菌的新鮮液體培養(yǎng)物能被加入的某種污水的無(wú)細(xì)菌濾液所溶解，培養(yǎng)物由混濁變澄清。溶菌因子－－噬菌體2、噬菌體的概念是侵染細(xì)菌、放線菌、藍(lán)細(xì)菌等原核微生物的病毒。20世紀(jì)60年代后發(fā)現(xiàn)一些真菌都有噬菌體的存在：酵母菌、青霉菌、曲霉菌、交鏈孢菌、鐮刀菌等。3、噬菌體的分布土壤肥料糞便腐爛的有機(jī)物污水（包括下水道污水）發(fā)酵工廠排出的廢液周圍空氣第二節(jié)噬菌體一、概述二、噬菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成三、噬菌體的繁殖四、噬菌體與發(fā)酵工業(yè)五、噬菌體的其他利用噬菌體的基本形態(tài)dsDNAdsDNAdsDNAssDNAssRNAssDNA頭部頸部尾鞘刺突尾絲基板E.coliT4噬菌體結(jié)構(gòu)模式圖噬菌體的結(jié)構(gòu)化學(xué)組成蛋白質(zhì)核酸dsDNAssDNAssRNAdsRNA第二節(jié)噬菌體一、概述二、噬菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成三、噬菌體的繁殖四、噬菌體與發(fā)酵工業(yè)五、噬菌體的其他利用三、噬菌體的繁殖根據(jù)噬菌體與宿主細(xì)胞間的關(guān)系，將噬菌體分為：烈性噬菌體（或稱毒性噬菌體）溫和噬菌體噬菌體侵入細(xì)菌細(xì)胞后，在宿主細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)增殖，產(chǎn)生大量子噬菌體，并通過(guò)裂解細(xì)菌細(xì)胞而釋放出來(lái)的噬菌體，被稱為烈性噬菌體。T4噬菌體是一個(gè)典型的烈性噬菌體。敏感性菌株（體）（一）烈性噬菌體噬菌體繁殖的5個(gè)階段：吸附、侵入、增殖（復(fù)制與生物合成）、成熟（裝配）、裂解釋放吸附噬菌體粒子敏感細(xì)菌隨機(jī)碰撞而接觸（靜電引力或氫鍵）可逆吸附，無(wú)特異性（非細(xì)胞顆粒也可吸附）噬菌體表面蛋白與細(xì)菌受體的結(jié)合特異性，不可逆吸附，啟動(dòng)噬菌體感染的第一階段吸附吸附是噬菌體與菌體表面受體發(fā)生特異性結(jié)合的過(guò)程，其特異性取決于噬菌體蛋白與宿主菌表面受體分子結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性。宿主菌表面特異性受體E.coli對(duì)T3、T4、T7的特異性受體是脂多糖層；E.coli對(duì)T2、T6的特異性受體是脂蛋白層；噬菌體的吸附器官尾絲頂角上的衣殼粒

不同噬菌體吸附于宿主細(xì)胞的部位不同E.coliT系噬菌體以其尾部的末端吸附于宿主細(xì)胞表面；E.coliM13噬菌體吸附于宿主細(xì)胞的性纖毛末端；還有噬菌體吸附于E.coli性纖毛的側(cè)面影響噬菌體吸附的因素噬菌體數(shù)量陽(yáng)離子濃度溫度輔助因子（Trp、Biotin）感染復(fù)數(shù)（度）每一敏感細(xì)胞所能吸附的相應(yīng)噬菌體的數(shù)量。侵入有尾噬菌體：注射方式將噬菌體核酸注入細(xì)胞首先吸附，并通過(guò)尾部刺突固著于細(xì)胞；尾部的酶水解細(xì)胞壁的肽聚糖，是細(xì)胞壁產(chǎn)生小孔；尾鞘收縮，核酸通過(guò)中空的尾管壓入胞內(nèi)，蛋白質(zhì)外殼留在胞外；吸附刺突固著尾鞘收縮尾管穿入DNA注入無(wú)尾噬菌體的侵入絲狀噬菌體M13：將核酸注入宿主細(xì)胞內(nèi)，而留下90％蛋白質(zhì)在細(xì)胞外；絲狀噬菌體f1、fd：為ssDNA的雄性噬菌體，只能侵入雄性菌株，通過(guò)雄性菌株的性纖毛將其DNA轉(zhuǎn)入到菌體內(nèi)；人工分離的裸露的DNA也能進(jìn)入菌體內(nèi)；如果大量噬菌體在短時(shí)間內(nèi)吸附于同一細(xì)胞上，使細(xì)胞壁產(chǎn)生許多小孔，也可引起細(xì)胞立即裂解，但并未進(jìn)行噬菌體的增殖，這種現(xiàn)象稱為自外裂解。自外裂解（lysisfromwithout）復(fù)制（增殖）核酸復(fù)制蛋白質(zhì)生物合成兩種不同的復(fù)制情況噬菌體核酸侵入宿主細(xì)胞后，立即破壞細(xì)菌的核質(zhì)體，細(xì)菌的合成作用停止，而以噬菌體核酸為模板利用宿主RNA聚合酶、核糖體等合成噬菌體所需的酶類；噬菌體核酸侵入宿主細(xì)胞后，還需要依賴宿主細(xì)胞提高的某些酶類，因此噬菌體并不破壞宿主細(xì)胞的核質(zhì)體，從而使宿主細(xì)胞能夠繼續(xù)合成某些蛋白質(zhì)；裝配T4噬菌體的裝配是一個(gè)極為復(fù)雜的自我裝配的過(guò)程

T4噬菌體注入后約30min細(xì)菌中含大量的完整噬菌體大多數(shù)噬菌體都是以裂解細(xì)胞方式釋放釋放T4噬菌體釋放過(guò)程涉及多個(gè)基因一個(gè)基因指導(dǎo)合成內(nèi)溶菌素，它攻擊細(xì)胞壁肽聚糖。一個(gè)基因指導(dǎo)合成噬菌體蛋白－－穿孔素(holin)，它破壞質(zhì)膜，使呼吸停止，并允許內(nèi)溶菌素攻擊肽聚糖，推測(cè)它使膜形成孔洞釋放絲桿噬菌體（如M13或fd）不殺死細(xì)胞，子代毒粒以分泌方式不斷從受染細(xì)胞中釋放，并同時(shí)完成毒粒的組裝。毒性噬菌體的一步生長(zhǎng)（復(fù)制周期、裂解性周期、增殖周期、溶菌性周期）T4噬菌體的生命周期TimecourseofeventsinphageT4infectionLatentperiod一步生長(zhǎng)曲線（one－stepgrowthcurve）定義：定量描述烈性噬菌體生長(zhǎng)規(guī)律的實(shí)驗(yàn)曲線。噬菌斑和噬菌體效價(jià)的測(cè)定一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定方法一步生長(zhǎng)曲線特征研究一步生長(zhǎng)曲線意義噬菌斑和噬菌體效價(jià)的測(cè)定噬菌斑(plaque)：在固體培養(yǎng)基上，若用適量的噬菌體和宿主菌液混合后接種培養(yǎng)，培養(yǎng)基表面可有透亮的溶菌空斑出現(xiàn)。一個(gè)空斑系由一個(gè)噬菌體復(fù)制增殖并裂解細(xì)菌后形成，稱為噬菌斑。不同噬菌體噬斑的形態(tài)與大小不盡相同。噬菌斑的形態(tài)：部分大腸桿菌T系噬菌體在大腸桿菌菌苔上產(chǎn)生的噬菌斑。噬菌斑表型有顯著差別。噬斑熒光假單胞菌噬菌斑噬菌斑的形態(tài)噬菌斑作用用于菌株鑒定用于噬菌體的檢出、分離和純化進(jìn)行噬菌體的計(jì)數(shù)噬菌體效價(jià)的測(cè)定效價(jià)(噬菌斑形成單位數(shù),plaque－formingunit，pfu、感染中心數(shù)):表示每毫升試樣種所含有的具侵染性的噬菌體粒子數(shù)。效價(jià)測(cè)定方法試管法瓊脂平板法單層瓊脂法雙層瓊脂法玻片快速法電鏡直接計(jì)數(shù)法平板法效價(jià)測(cè)定原理噬菌體檢查和效價(jià)測(cè)定方法－雙層瓊脂法（2％agar）（1％agar）噬菌體檢查和效價(jià)測(cè)定方法－單層瓊脂法噬菌體檢查和效價(jià)測(cè)定方法－平板點(diǎn)滴法效價(jià)計(jì)算公式效價(jià)＝噬菌斑數(shù)目噬菌體稀釋液體積×噬菌體稀釋度成斑率（efficiencyofplating，EOP）同一樣品根據(jù)噬菌斑計(jì)算出來(lái)的效價(jià)與用電鏡計(jì)算出來(lái)的效價(jià)之比。一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定方法1、用噬菌體的稀釋液感染高濃度的宿主細(xì)胞；2、數(shù)分鐘后，加入抗噬菌體的抗血清（中和未吸附的噬菌體）；3、將上述混合物大量稀釋，終止抗血清的作用和防止新釋放的噬菌體感染其它細(xì)胞；4、保溫培養(yǎng)并定期檢測(cè)培養(yǎng)物形成噬菌斑數(shù)目（對(duì)噬菌體含量進(jìn)行計(jì)數(shù)）；5、以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，以噬菌斑數(shù)目為縱坐標(biāo)，繪制出噬菌體特征性的繁殖曲線－－一步生長(zhǎng)曲線；一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定方法取培養(yǎng)物直接測(cè)定噬菌體數(shù)量將培養(yǎng)物過(guò)濾去細(xì)胞后測(cè)定噬菌體數(shù)量將細(xì)胞裂解后測(cè)定噬菌體的數(shù)量。前期可將培養(yǎng)物先離心去上清以消除未吸附噬菌體的影響潛伏期噬菌體吸附到細(xì)胞到釋放出新噬菌體的時(shí)間隱蔽期噬菌體在受染細(xì)胞內(nèi)消失到細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)新的噬菌體時(shí)間在潛伏期的前一段，受染細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)不到感染性噬菌體，后一階段，感染性噬菌體在受染細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量急劇增加。隱蔽期噬菌體在細(xì)胞內(nèi)存在的動(dòng)力學(xué)曲線呈線性函數(shù)，而非指數(shù)關(guān)系，從而證明子代噬菌體顆粒是由新合成的噬菌體基因組與蛋白質(zhì)經(jīng)裝配成熟，而不是通過(guò)雙分裂方式產(chǎn)生的。裂解量：每個(gè)受染細(xì)胞所產(chǎn)生的子代噬菌體顆粒的平均數(shù)目。其值等于潛伏期受染細(xì)胞的數(shù)目除以穩(wěn)定期受染細(xì)胞所釋放的全部子代噬菌體數(shù)目：穩(wěn)定期噬菌體效價(jià)與潛伏期噬菌體效價(jià)之比。

噬菌體復(fù)制（繁殖）：（一步生長(zhǎng)曲線）1、吸附期；游離的噬菌體吸附到宿主細(xì)胞2、潛伏期；從噬菌體吸附到細(xì)胞到釋放出新噬菌體的最短時(shí)期3、裂解期；隨著菌體不斷破裂，新噬菌體數(shù)目增加，直到最高值測(cè)定一步生長(zhǎng)曲線的意義了解噬菌體在菌體內(nèi)的最短潛伏期和平均收獲量（裂解量、爆破量）－－反映噬菌體的重要特征參數(shù)之一裂解量：是指每個(gè)被感染的細(xì)菌釋放新的噬菌體的平均數(shù)。了解理化因素的變化對(duì)噬菌體感染循環(huán)時(shí)間的影響，以及每個(gè)被感染菌釋放噬菌體的影響。裂解量＝裂解期平均噬菌斑數(shù)潛伏期平均噬菌斑數(shù)感染宿主細(xì)胞后不能完成復(fù)制循環(huán)，噬菌體基因組長(zhǎng)期存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，沒(méi)有成熟噬菌體產(chǎn)生。所以溫和噬菌體也稱溶源性噬菌體（lysogenicphage）這一現(xiàn)象稱做溶源性（lysogeny）現(xiàn)象（二）溫和噬菌體溫和噬菌體的溶源性反應(yīng)（繁殖）整合于細(xì)菌染色體或以質(zhì)粒形成存在的溫和噬菌體基因組稱做原噬菌體（prophage、前噬菌體）在原噬菌體階段，噬菌體的復(fù)制被抑制，宿主細(xì)胞正常地生長(zhǎng)繁殖，而噬菌體基因組與宿主細(xì)菌染色體同步復(fù)制，并隨細(xì)胞分裂而傳遞給子代細(xì)胞。細(xì)胞中含有以原噬菌體狀態(tài)存在的溫和噬菌體基因組的細(xì)菌稱做溶源性細(xì)菌（lysogenicbacteria）溶源性細(xì)菌的基本特性特性1：溶源性是溶源性細(xì)菌的一個(gè)及其穩(wěn)定的遺傳特性特性2：自發(fā)裂解：溶源性細(xì)菌的自發(fā)裂解特性3：誘發(fā)裂解：H2O2、UV、X－射線、氮芥子氣、乙酰亞胺、絲裂霉素C等特性4：免疫性：被溫和噬菌體感染后形成的溶源性細(xì)菌具有“免疫性”，即其它同類噬菌體雖然可以再次感染該細(xì)胞，但不能增殖，也不能導(dǎo)致溶源性細(xì)菌裂解。特性5：溶源性細(xì)菌的復(fù)愈：溶源性細(xì)菌有時(shí)消失了其中的原噬菌體，變成非溶源性細(xì)胞，這時(shí)既不發(fā)生自發(fā)裂解現(xiàn)象，也不發(fā)生誘發(fā)裂解現(xiàn)象。稱為溶源性細(xì)菌的復(fù)愈后非溶源化。特性6：溶源轉(zhuǎn)變：原噬菌體引起的溶源性細(xì)菌除免疫性外的其他的表形改變，包括溶源菌細(xì)胞表面性質(zhì)的改變和致病性轉(zhuǎn)變被稱為溶源轉(zhuǎn)變(lysogenicconversion)。例如：白喉?xiàng)U菌只有在含有特定類型的原噬菌體時(shí)才能產(chǎn)生白喉毒素，引起被感染機(jī)體發(fā)病。外界因素如紫外線可引起宿主的染色體的破壞，宿主產(chǎn)生應(yīng)急反應(yīng)合成具有DNA重組活性的RecA蛋白，導(dǎo)致cI的被降解，噬菌體進(jìn)入裂解循環(huán)。誘發(fā)裂解是檢查是否存在溶原性細(xì)菌的有效方法溶源性細(xì)菌的檢定方法需要一種敏感的、非溶源性的菌株作為指示菌；對(duì)待測(cè)的溶源性菌株進(jìn)行誘發(fā)裂解；培養(yǎng)物過(guò)濾，濾液與指示菌混合，觀察是否形成噬菌斑；結(jié)果：有噬菌斑：為溶源菌無(wú)噬菌斑：不是溶源菌溫和噬菌體的存在狀態(tài)游離的、具有感染性的病毒粒子；原噬菌體；營(yíng)養(yǎng)期噬菌體決定溫和噬菌體三種存在狀態(tài)的因素細(xì)菌和噬菌體本身的遺傳特性溫度宿主生理狀況菌種每個(gè)細(xì)菌所接受的噬菌體的數(shù)目溶源性存在大腸桿菌假單胞菌沙門(mén)氏菌鏈球菌芽孢桿菌棒桿菌弧菌極毛桿菌溶源性菌株的命名E.coliK12（λ）溫和噬菌體的種類按照溫和噬菌體與細(xì)菌DNA結(jié)合部位不同可分為兩類：只有一個(gè)結(jié)合部位：附著在宿主細(xì)胞膜的某一位點(diǎn)，或具有多個(gè)或不定的接合位點(diǎn)：第二節(jié)噬菌體一、概述二、噬菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成三、噬菌體的繁殖四、噬菌體與發(fā)酵工業(yè)五、噬菌體的其他利用噬菌體對(duì)發(fā)酵工業(yè)的危害發(fā)酵周期延長(zhǎng)發(fā)酵液變清發(fā)酵產(chǎn)物難以形成嚴(yán)重時(shí)倒罐、停產(chǎn)等噬菌體的分離與檢查原理分離方法：雙層瓊脂平板方法：

單層瓊脂平板方法：載玻片快速法：噬菌體防治避免噬菌體污染，應(yīng)樹(shù)立“預(yù)防為主”的觀念。1）決不使用可疑菌種；2）嚴(yán)格保持環(huán)境衛(wèi)生，決不隨意丟棄、排放生產(chǎn)菌種的菌液；3）注意通氣質(zhì)量，嚴(yán)格過(guò)濾；4）不斷篩選抗噬菌體菌種；5）經(jīng)常輪換生產(chǎn)菌種；6）嚴(yán)格會(huì)客制度。第二節(jié)噬菌體一、概述二、噬菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成三、噬菌體的繁殖四、噬菌體與發(fā)酵工業(yè)五、噬菌體的其他利用噬菌體其它利用價(jià)值測(cè)定輻射劑量在分子生物學(xué)中的應(yīng)用第三節(jié)亞病毒一、類病毒二、擬病毒三、朊病毒

亞病毒類病毒擬病毒朊病毒具有侵染性的RNA分子包裹在真病毒粒中的有缺陷的類病毒不含核酸的具有侵染性的蛋白質(zhì)第三節(jié)亞病毒一、類病毒二、擬病毒三、朊病毒

（一）類病毒的發(fā)現(xiàn)早在1922年在美國(guó)發(fā)現(xiàn)了一種嚴(yán)重影響馬鈴薯產(chǎn)量的馬鈴薯紡錘形塊莖?。≒otatospindletubedisease，PSTD）。1960年以來(lái)，在我國(guó)的黑龍江省也發(fā)現(xiàn)了這類病毒，造成馬鈴薯減產(chǎn)20～70％。1971年瑞士的T.O.Diener經(jīng)過(guò)研究證實(shí)了引起這類病毒的病原生物是一種不具蛋白質(zhì)衣殼，僅有RNA組成的新病毒，稱它為馬鈴薯紡錘形塊莖病類病毒（Potatospindletuberviroid，PSTV）。馬鈴薯紡錘型塊莖病檢疫對(duì)象，向日本出口馬鈴薯接受該項(xiàng)檢疫。組織培養(yǎng)法植物脫毒技術(shù)（二）類病毒定義

只含RNA一種核酸的最小的，專性細(xì)胞內(nèi)寄生的分子生物。（三）類病毒分布只在植物體中發(fā)現(xiàn)類病毒引起的植物病害馬鈴薯紡錘形塊莖病番茄簇頂病柑桔裂皮病菊花矮化病黃瓜白果病椰子死亡病酒花矮化?。ㄋ模╊惒《镜幕蚪M其基因組為單股閉合環(huán)狀的RNA分子，由246～375個(gè)核苷酸分子組成相對(duì)分子量很小，（0.5～1.2）*105不夠編碼1個(gè)蛋白分子

詳細(xì)內(nèi)容自學(xué)?。?！第三節(jié)亞病毒一、類病毒二、擬病毒三、朊病毒

（一）擬病毒的發(fā)現(xiàn)1981年Randles等在絨毛煙（Nicotianavelutina）上分離到一種直徑為30nm的二十面體病毒，稱為絨毛煙斑駁病毒（VTMoV，velvettobaccomottlevirus）。當(dāng)他們?cè)阼b定該病毒時(shí)，發(fā)現(xiàn)其基因組除含一種大分子線狀ssRNA（稱RNA-1）外，還含有一種類似于類病毒的環(huán)狀ssRNA分子（稱RNA-2）及它的線狀形式（稱RNA-3）。進(jìn)一步研究表明，用RNA-1和RNA-2進(jìn)行單獨(dú)接種時(shí)都不能感染和復(fù)制，只有把兩者