植物組織培養(yǎng)中的污染

植物組織培養(yǎng)中的污染

1組培污染是根本原因植物組織培養(yǎng)是20世紀初以來在植物生化的基礎上發(fā)展起來的植物繁殖技術。污染是組織培養(yǎng)過程中首先遇到的問題,且難以控制。不能把污染率降低到可以接受的范圍,也就意味著這項工藝不能進行下去。因此,控制污染成了組培中的首要技術。污染是組織培養(yǎng)中普遍存在的問題。在植物快速繁殖過程中,培養(yǎng)基、超凈工作臺、接種室消毒不嚴或無菌操作不規(guī)范等均可導致污染的發(fā)生。另外,對于植物本身,特別是對那些在熱帶、南亞熱帶生長的植物,由于常年高溫多雨,空氣濕度大,在植物莖葉表面容易滋生大量的微生物,甚至一些菌絲體侵入表皮內(nèi)的薄壁組織,不能被一般的表面消毒方法所清除,隨材料帶入培養(yǎng)過程,引起內(nèi)生菌的污染。這些都嚴重影響了組培苗的商業(yè)化生產(chǎn)。因此,研究微生物污染的種類、來源、消毒方法以及一些抑制劑的篩選,對減輕微生物造成的污染,提高培養(yǎng)成功率和培養(yǎng)物的成活率,降低成本,提高經(jīng)濟效益等都有重要意義。2組織培養(yǎng)過程中外生菌污染造成的污染影響污染的因素有很多,概括起來主要有兩方面:一是植物本身帶菌(簡稱外生菌)所造成的污染。外植體帶菌是不易清除的,特別是外植體內(nèi)部所帶的菌(簡稱內(nèi)生菌),特別難消除。二是組織培養(yǎng)工藝過程中的各個環(huán)節(jié)操作不當或不嚴格而帶菌所導致的污染。具體分析起來有以下幾方面的污染因素。2.1引起污染的菌落外生細菌的癥狀是在初代培養(yǎng)中,表面細菌引起的污染通常在2~3d就能在外植體周圍或培養(yǎng)基表面形成明顯的水污狀、油污狀、氣泡或干縮的紅、黃或乳白等顏色的菌落。2.2內(nèi)細菌2.2.1復雜營養(yǎng)的原核生物在組培中,由于材料內(nèi)部(細胞或細胞間)的內(nèi)生菌不能被一般的表面消毒方法所清除,隨材料帶入培養(yǎng)過程引起污染稱內(nèi)生細菌污染或內(nèi)源細菌污染。內(nèi)部污染問題包括病毒、類病毒以及其他需要復雜營養(yǎng)的原核生物,后者包括與植物有關的細菌以及無細胞核的原核生物及寄生于維管組織中的細菌。它們可以是潛伏的,分布也比較廣,木質(zhì)部、韌皮部、局部或全身。從以前的報道看,已經(jīng)被鑒定的內(nèi)生細菌的種類主要有:黃單胞菌屬(Xanthommnas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)等等,具體見表1。從表中可以看出,內(nèi)生細菌的種類非常多,但引起內(nèi)生細菌污染的內(nèi)生細菌種類遠不止上表所列。目前在各種農(nóng)作物和果樹等經(jīng)濟作物等大多數(shù)植物中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生細菌已經(jīng)超過129種(隸屬54個屬)之多。2.2.2植物內(nèi)細菌污染的癥狀和危害2.2.2.內(nèi)生細菌污染內(nèi)生細菌的癥狀是在外植體培養(yǎng)后3~5d內(nèi)未發(fā)生細菌污染,但以后會不斷地出現(xiàn)明顯或不明顯的細菌菌落,這種情況就有可能是由內(nèi)生細菌引起的污染。2.2.2.培養(yǎng)物生長減緩內(nèi)生細菌引起的危害較多,主要包括:導致早期培養(yǎng)的失敗,引起增殖效率的降低,培養(yǎng)物生長減緩,玻璃苗增加等等。并在后期導致試管苗移栽的困難甚至死亡,有報道說有時污染也會引起培養(yǎng)物遺傳變異,但也有報道說一些潛在污染并不影響培養(yǎng)物增殖,這有待于進行進一步的研究工作,從而得出結(jié)論。2.3資金來源、膜的操作中注意注意的三角瓶、培養(yǎng)液、封口膜等植物組織培養(yǎng)中的器具包括:鑷子、剪刀、刀片、三角瓶、培養(yǎng)皿、封口膜等,污染的原因有時是這些器具滅菌不徹底,操作時要注意器具的滅菌要到位,另外超凈工作臺濾布不潔也會造成污染。2.4瓶塞+扎瓶口培養(yǎng)基的污染表現(xiàn)為接種前后培養(yǎng)基出現(xiàn)大量污染。若菌落只存在于培養(yǎng)基表面且多為真菌時可能是由于瓶塞不嚴或扎瓶口的橡皮筋松弛,或放置培養(yǎng)基的空氣環(huán)境中孢子過多;如果菌落存在于培養(yǎng)基內(nèi)則很可能是由于各種貯存母液的污染而引起的;另外,培養(yǎng)瓶不潔凈或滅菌不徹底也會導致培養(yǎng)基在未接種前即有大量污染。2.5培訓環(huán)境植物組織培養(yǎng)中的培養(yǎng)物的培養(yǎng)環(huán)境大體可以分為外部環(huán)境和內(nèi)部環(huán)境兩個大環(huán)境。2.5.1外部環(huán)境組培室在公路邊、工礦區(qū)、垃圾場和集市等附近,污染源多、雜,難以控制。2.5.2內(nèi)部環(huán)境組培室、接種室門窗封閉不嚴,給蒼蠅、飛蛾、蜘蛛等的進入創(chuàng)造了條件,有利于雜菌傳播,同時室內(nèi)塵埃多,若不經(jīng)常清潔消毒,將會使細菌增多。2.6接種操作的污染控制在植物組織培養(yǎng)過程中,能夠熟練掌握無菌接種操作的各個技術環(huán)節(jié),是控制污染的重要措施。這就要求操作人員在進行操作之前,要認真學習有關無菌操作技術規(guī)程方面的知識。3控制污染事件針對上述不同的污染原因,在植物組培過程中,應注意以下幾點無菌操作環(huán)節(jié),嚴格控制污染的發(fā)生。3.1由培養(yǎng)材料引起的消毒培養(yǎng)材料的滅菌是植物組培工作中的重要環(huán)節(jié),它既要求將外植體表面的微生物徹底殺死,又要求盡可能少傷害外植體組織和表面細胞。3.1.1外植體滅菌方法若用植物莖尖、葉片等作外植體時,為降低污染,可在室內(nèi)或無菌條件下對枝條先進行預培養(yǎng),即枝條用水沖洗后插入無糖營養(yǎng)液中,使其發(fā)枝,然后用新抽的嫩枝作外植體。外植體滅菌通常分4大步驟:清洗外植體、70%乙醇滅菌、0.1%升汞滅菌、無菌水漂洗。若材料滅菌比較容易,則不需用乙醇滅菌。經(jīng)過以上的處理,在實驗中污染率可控制在10%以內(nèi),有時可達5%以下,此殺菌過程具有一定的普遍性。材料消毒措施的力度越大,滅菌就越徹底,污染率就越低,但要注意防止材料受藥害。3.1.2培養(yǎng)法:自然地面培養(yǎng)法多次滅菌是指將培養(yǎng)幾天的培養(yǎng)物進行重新滅菌,再進行培養(yǎng),或利用多種藥液多次浸泡法,尤其是木本植物等難以消毒的材料可以采用多次滅菌法,這樣可以大大加強滅菌效果,減少污染率。3.1.3添加抗生素的方法植物組織培養(yǎng)中的滅菌只能消除材料表面的病菌,而其內(nèi)部所帶的細菌和霉菌等雜菌卻難以對付,有關方面報道,解決此問題的有效辦法是在培養(yǎng)基中添加抗生素。這樣的抗生物質(zhì)有鏈霉素、青霉素、地霉素、夾竹桃霉素和新霉素等物質(zhì),其應用濃度依不同培養(yǎng)物的不同而不同。3.2消毒與污染控制這方面主要包括:器具清洗與滅菌、控制母液污染、控制母液污染、器具與培養(yǎng)基濕熱滅菌、瓶塞松緊和大小要適中、掌握無菌操作的技術環(huán)節(jié)以及培養(yǎng)室的消毒與污染控制等等。4不同類型微生物以及不同組織材料的抗菌活性4.1在組培過程中不管采取哪種措施,都既要保證防止污染的效果良好,又要經(jīng)濟實用,同時還不能與外植體進一步增殖分化生長相矛盾,也就是一方面既要消滅材料上的病菌,同時又要保證材料不受損或者只是輕微損傷組織材料,而不影響其生長,力求從各個環(huán)節(jié)控制致變因素,但不同植物不同部位的組織,有其不同的特點,對消毒劑的敏感反應也不同,因此開始要進行摸索試驗,以達到最佳的滅菌效果。4.2在大規(guī)模微繁期間,即使外植體在一開始進行了嚴格消毒,某些慢速生長的病原菌可能依然存在,但只有在培養(yǎng)物經(jīng)過多次繼代之后,這些污染物才