有益菌固態(tài)發(fā)酵普洱茶香氣成分分析

有益菌固態(tài)發(fā)酵普洱茶香氣成分分析

普洱茶是由地理標志保護范圍內(nèi)的云南大冶茶加工而成的。該加工工藝在地理標志保護范圍內(nèi)采用特定的加工方法（發(fā)酵）。其獨特品質(zhì)特征為:外形色澤紅褐,內(nèi)質(zhì)湯色紅濃明亮,香氣獨特陳香,滋味醇厚回甘,葉底紅褐。20世紀80年代以來,劉勤晉、紀文明、周志宏等先后對一些普洱茶樣品的香氣成分進行了研究,結(jié)果表明普洱茶的香氣成分主要是由萜烯類、芳環(huán)醇類、醛酮類、酚類、雜環(huán)化合物、酸酯類、碳氫化合物組成,它們的形成與微生物代謝關(guān)系密切。云南普洱茶發(fā)酵過程中主要有益微生物有黑曲霉(Aspergillusniger)、青霉屬(Penicllium)、少根根霉屬(Rhizopus)、灰綠曲霉(Aspergillusgloucus)、釀酒酵母屬(Saccharomyces)、土生曲霉(Aspergillusterreus)、白曲霉(Aspergilluscandidus)、細菌類(Bacterium),其中黑曲霉最多。有益微生物的發(fā)酵作用在云南普洱茶品質(zhì)形成中起決定性的作用,是云南普洱茶品質(zhì)形成的必要條件,離開了有益微生物和濕熱作用,曬青毛茶難以形成普洱茶的特有品質(zhì)風格。發(fā)酵過程中,在濕熱條件下,有益微生物利用曬青毛茶豐富的內(nèi)含物質(zhì),進行生長繁殖,產(chǎn)生了一系列影響普洱茶品質(zhì)的復(fù)雜的中間代謝產(chǎn)物(如芳香特性化合物)。目前關(guān)于有益菌固態(tài)發(fā)酵對普洱熟茶香氣方面的影響研究在國內(nèi)外鮮有報道。本研究采用同時蒸餾萃取法(SDE),對普洱茶揮發(fā)性成分進行提取,并與氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)聯(lián)用,對普洱熟茶的揮發(fā)性成分進行了比較研究,探討了授權(quán)專利有益菌種(綠色木霉TrichodermaviridePers.exFr.、黑曲霉AspergillusnigervanTieghem、少根根霉RhizopusarrhizusFischer、釀酒酵母Saccharomycescerevisiae)對普洱熟茶香氣成分的影響。1材料和方法1.1微生物菌種保存少根根霉、黑曲霉、釀酒酵母、綠色木霉均由云南省自然科學基金項目研究組進行分離、純化、鑒定、保存、篩選、擴繁而得,菌種保存在中國普通微生物菌種保藏管理中心(綠色木霉200710065786.5、黑曲霉ZL200510010941.4,2005、少根根霉200710065787.X、釀酒酵母ZL200510010940.X,2005),并獲授權(quán)專利。1.2種有益菌種成茶的制備由國家科技支撐計劃項目“普洱茶加工關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”提供,采用云南大葉種茶樹[CamelliaSinensis(Linn.)Var.assamica(masters)Kitamura]鮮葉制成的曬青毛茶,經(jīng)分別接種4種有益菌種固態(tài)發(fā)酵而成的普洱茶。1.3儀器和質(zhì)譜條件提取方法(SDE):準確稱取茶樣50.0g,采用SDE法提取,用二氯甲烷30mL提取2h。萃取液濃縮至0.5mL,用氣質(zhì)聯(lián)用儀進行檢測。GC/MS分析條件:色譜柱:HP-5,30m×0.2mm(id)×0.5μm(膜厚)。載氣:氦氣,純度>99.999%;流速:1mL/min。柱溫:初溫60℃,保留2min,以3℃/min的升溫速率,升至200℃,保留25min;進樣口溫度:250℃。質(zhì)譜部分條件如下,電離方式:EI;電離能量:70eV;離子源溫度:250℃;全譜掃描,掃描范圍為40~400m/z;進樣量:1μL。定性和定量方法:按上述分析條件對香氣成分進行氣相色譜-質(zhì)譜分析,將各色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖利用Wiley及NIST兩個計算機譜庫,對得到的質(zhì)譜圖進行串聯(lián)檢索,并與文獻值對照相結(jié)合進行人工解析,再結(jié)合保留時間、質(zhì)譜、實際成分和保留指數(shù)等參數(shù),并參考有關(guān)茶葉芳香物質(zhì)成分的分析結(jié)果(tR值)進行組分比較鑒定,并對部分成分進行標準物質(zhì)對照,同時對總離子流量(TIC)用峰面積歸一化定量,得到各組分的相對含量。1.4瀝茶湯感官評整個評審操作流程:取樣→評外形→稱樣→沖泡→瀝茶湯→評湯色→聞香氣→嘗滋味→看葉底,審評時取茶樣3.0g,150mL沸水沖泡,靜置5min,重復(fù)3次。2結(jié)果與分析2.1加味型茶樹的香氣物質(zhì)組成特點由于烷烴一般香氣微弱或幾乎沒有香氣,對茶葉的香氣貢獻較小,所以在香氣分析時,常常將其略去。表1和圖1、2、3、4、5的結(jié)果表明,在綠色木霉處理樣、黑曲霉處理樣、少根根霉處理樣以及釀酒酵母處理樣4個普洱茶樣品中,分別鑒定出13種、18種、19種、19種香氣化合物,經(jīng)檢測出的香氣成分占香氣總量的比例分別為53.66%、74.77%、54.19%、59.15%。萜烯、醇類、酮類、酯類、醛類是茶樣中最主要的香氣成分。圖1結(jié)果同時顯示,不同有益菌固態(tài)發(fā)酵下的普洱茶香氣成分以甲氧基苯及其衍生物和萜烯醇類化合物及其衍生物為主。綠色木霉固態(tài)發(fā)酵的普洱茶共檢測出13種香氣成分,含量較高的成分主要有:強烈的花-木香氣的順式氧化芳樟醇(化合物17,占11.36%)、芳樟醇氧化物Ⅱ(化合物24,占6.5%)、芳樟醇氧化物Ⅰ(化合物23,占2.45%);濃郁的玉簪花香氣的苯乙醛(化合物14,占3.66%);典型陳香的1,2,3-三甲氧基苯(化合物34,占7.4%)、1,2-二甲氧基苯(化合物22,占3.89%)、1,2,4-三甲氧基苯(化合物37,占3.07%)、3,4,5-三甲氧基甲苯(化合物39,占2.14%)等。該普洱茶的香氣物質(zhì)組成特點為:甲氧基苯及其衍生物和萜烯醇類化合物及其衍生物、醛類含量較高,其他香氣物質(zhì)含量較少。黑曲霉固態(tài)發(fā)酵的普洱茶共檢測出18種香氣成分,含量較高的成分主要有:杏仁氣味的苯甲醛(化合物7,占5.39%);清香、醛香、雞肉香氣的(E,E)-2,4-庚二烯醛(化合物10,占3.23%);濃郁的玉簪花香氣的苯乙醛(化合物14,占7.08%);強烈的花-木香氣的順式氧化芳樟醇(化合物17,占6.01%)、芳樟醇氧化物Ⅱ(化合物24,占5.54%)、芳樟醇(化合物18,占2.7%)、芳樟醇氧化物Ⅰ(化合物23,占2.15%);典型陳香的1,2,3-三甲氧基苯(化合物34,占10.35%)、1,2-二甲氧基苯(化合物22,占8.66%)、3,4,5-三甲氧基甲苯(化合物39,占5.33%)、1,2,4-三甲氧基苯(化合物37,占3.59%)、4-乙基-1,2-二甲氧基甲苯(化合物35,占3.31%);玫瑰花香氣的苯乙醇(化合物20,占2.12%)、紫羅蘭花香氣、暖和木香的β-紫羅蘭酮(化合物44,占1.56%)等。該普洱茶的香氣物質(zhì)組成特點為:甲氧基苯及其衍生物、萜烯醇類化合物及其衍生物與醛類含量較高,其他香氣物質(zhì)含量較少。少根根霉固態(tài)發(fā)酵的普洱茶共檢測出19種香氣成分,含量較高的成分主要有:清香、醛香、雞肉香氣的(E,E)-2,4-庚二烯醛(化合物10,占3.51%);濃郁的玉簪花香氣的苯乙醛(化合物14,占3.17%);強烈的花-木香氣的芳樟醇(化合物18,占2.58%)、順式氧化芳樟醇(化合物17,占2.02%);典型陳香的1,2,3-三甲氧基苯(化合物34,占10.39%)、1,2-二甲氧基苯(化合物22,占6.3%)、4-乙基-1,2-二甲氧基甲苯(化合物35,占3.43%)、1,2,4-三甲氧基苯(化合物37,占2.44%)、3,4,5-三甲氧基甲苯(化合物39,占1.48%);冬青味的水楊酸甲酯(化合物26,占3.28%);紫羅蘭花香氣、暖和木香的?-紫羅蘭酮(化合物44,占3.88%)、α-紫羅蘭酮(化合物41,占1.85%)等。該普洱茶的香氣物質(zhì)組成特點為:甲氧基苯及其衍生物、萜烯醇類化合物、醛類、酮類含量較高,其他香氣物質(zhì)含量較少。釀酒酵母固態(tài)發(fā)酵的普洱茶共檢測出19種香氣成分,含量較高的成分主要有:清香、醛香、雞肉香氣的(E,E)-2,4-庚二烯醛(化合物10,占2.42%);濃郁的玉簪花香氣的苯乙醛(化合物14,占2.88%);強烈的花-木香氣的順式氧化芳樟醇(化合物17,占4.1%)、芳樟醇(化合物18,占3.57%)、芳樟醇氧化物Ⅱ(化合物24,占3.33%);典型陳香的1,2,3-三甲氧基苯(化合物34,占9.4%)、1,2-二甲氧基苯(化合物22,占6.09%)、4-乙基-1,2-二甲氧基甲苯(化合物35,占3.17%)、1,2,4-三甲氧基苯(化合物37,占3.33%)、3,4,5-三甲氧基甲苯(化合物39,占2.08%);冬青味的水楊酸甲酯(化合物26,占2.22%);紫羅蘭花香氣、暖和木香的β-紫羅蘭酮(化合物44,占2.89%)、α-紫羅蘭酮(化合物41,占1.16%)等。該普洱茶的香氣物質(zhì)組成特點為:甲氧基苯及其衍生物、萜烯醇類化合物及其衍生物、醛類與酮類含量較高,其他香氣物質(zhì)含量較少。2.2加味加味茶的制備審評結(jié)果見表2。綠色木霉發(fā)酵的普洱茶滋味醇厚回甘,香氣陳香透花-木香;黑曲霉發(fā)酵的普洱茶滋味醇厚,陳香透花果香;少根根霉發(fā)酵的普洱茶滋味醇厚甘滑,陳香濃;釀酒酵母發(fā)酵的普洱茶滋味醇和甘滑,香氣陳香較顯,這與香氣物質(zhì)成分的比例和含量相吻合。3加發(fā)酵過程中加味劑的發(fā)酵微生物固態(tài)發(fā)酵是普洱茶加工的關(guān)鍵工序,對普洱茶品質(zhì)的形成具有重要意義。它是以曬青毛茶的內(nèi)含成分為基質(zhì),在微生物分泌的胞外酶(多酚氧化酶、抗壞血酸酶等)的酶促作用、微生物呼吸代謝產(chǎn)生的熱量和茶葉水分的濕熱作用的協(xié)同下,發(fā)生以茶多酚轉(zhuǎn)化為主的一系列復(fù)雜而劇烈的化學變化,從而形成普洱茶特有的色、香、味。微生物固態(tài)發(fā)酵中香氣成分的變化與微生物、酶和水熱作用是密切相關(guān)的。據(jù)周紅杰等研究認為,在水分適度時,大量釀酒酵母的生長對普洱茶甜醇滋味的形成有重要作用。陳英燦認為,普洱茶的發(fā)酵是以微生物的參與為主體,普洱茶香氣和韻味的形成,主要依靠微生物的作用。劉勤晉等研究認為微生物代謝過程所產(chǎn)生的生物熱化學作用可以形成大量新的揮發(fā)性香氣物質(zhì)。如黑曲霉在有酸存在的條件下,能產(chǎn)生1,2-二甲氧基-4-甲基苯、1,2-二甲氧基-4-乙烯基苯等多種帶有霉味和陳香的香氣物質(zhì)。XUX等研究表明,在渥堆發(fā)酵過程中曲霉對普洱茶揮發(fā)性物質(zhì)的組成有重要影響;在后發(fā)酵過程中,醛類和酮類的濃度下降,而甲氧基苯、萜醇類會有所增加。李中皓等研究表明,甲氧基苯及其衍生物類物質(zhì)能夠有效地改善茶葉的粗老味,使普洱茶香味陳醇,是普洱茶類的重要特征陳香香氣成分之一。筆者研究發(fā)現(xiàn),不同有益微生物固態(tài)發(fā)酵的普洱茶香氣成分之間存