基于草甘膦抗性基因的大豆轉(zhuǎn)基因體系的建立與驗證

基于草甘膦抗性基因的大豆轉(zhuǎn)基因體系的建立與驗證

大豆是重要的糧食和油食動物，也是人類主要的食物原因和資源來源。自1996年美國孟山都公司開發(fā)的抗草甘娜轉(zhuǎn)換率大豆被批準用于商業(yè)目的以來，世界轉(zhuǎn)換率大豆的種植面積逐年增加，占總種植面積的81%。中國是世界上最大的大豆出口國。由于低生產(chǎn)效率和年產(chǎn)量的下降，目前的全球大豆產(chǎn)量占總進口量的80%。建立中國的獨立匯率控制體系對恢復(fù)中國的大豆生產(chǎn)和提高大豆行業(yè)的國際競爭力具有重要意義。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因法具有成本低、轉(zhuǎn)化植株的外源基因拷貝數(shù)較少、后代遺傳更穩(wěn)定等優(yōu)勢,是大豆轉(zhuǎn)基因的主要手段.與其他物種相比,大豆是一種再生困難的作物,轉(zhuǎn)基因效率普遍較低.研究表明,農(nóng)桿菌與植物細胞間的相互作用是影響大豆轉(zhuǎn)基因效率的關(guān)鍵因素[7~9],而受體基因型、外植體活力、農(nóng)桿菌菌株、載體、篩選系統(tǒng)(包括篩選劑類型以及篩選壓力)、激素配比、抗氧化劑、溫度、光等因素,也會影響大豆轉(zhuǎn)化效率.草甘膦是一種有機磷除草劑,它的生物活性很高,具有高效、低毒、殺草譜廣、易分解、低殘留、對環(huán)境影響相對較低等特點,是農(nóng)業(yè)上應(yīng)用最為廣泛的一種除草劑.植物體中有3種芳香族必需氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸),它們的生物合成途徑中有一個關(guān)鍵性酶—5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyryvylshikimicacid-3-phosphatechorismatesynthase,EPSPS),它能催化莽草酸-3-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)合成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimmateacid-3-phosphate,EPSP).草甘膦是PEP的一種結(jié)構(gòu)類似物,能夠與EPSPS蛋白結(jié)合位點結(jié)合,從而競爭性抑制該酶的活性,阻斷了植物莽草酸途徑,導(dǎo)致苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸等芳香族必需氨基酸的生物合成受阻,從而使莽草酸過度積累而影響植物正常生長,最終導(dǎo)致死亡[12~14].從抗高濃度草甘膦的微生物中分離獲得的草甘膦不敏感EPSPS蛋白編碼基因,是抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的基因源.例如,商業(yè)化生產(chǎn)的抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆中采用CP4-EPSPS基因,是從農(nóng)桿菌菌株CP4中分離獲得,CP4-EPSPS蛋白對草甘膦的親和力非常低,導(dǎo)入大豆及其他農(nóng)作物后其酶活性不被草甘膦抑制,從而使轉(zhuǎn)基因植物高抗草甘膦.大豆轉(zhuǎn)基因體系中常用的篩選劑包括潮霉素(hygromycin)和草胺膦(glufosinate).通過對大豆轉(zhuǎn)基因體系的摸索和完善,本實驗室以草胺膦為篩選標記的大豆轉(zhuǎn)化體系效率已經(jīng)達到4.59%以上.在培育抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆過程中,一方面出于產(chǎn)品的安全性考慮,轉(zhuǎn)基因過程中要求盡可能地避免使用選擇標記基因;另一方面,轉(zhuǎn)基因過程中直接用目的性狀進行篩選可獲得性狀突出的轉(zhuǎn)基因事件.因此,抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆的培育中理想的轉(zhuǎn)基因體系應(yīng)以除草劑作為直接篩選物.通過對EPSPS基因及轉(zhuǎn)基因體系的優(yōu)化,建立了一個以草甘膦為直接篩選劑的大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系,并獲得了一批穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因后代.本研究結(jié)果對國內(nèi)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)基因方法研究及抗除草劑新品種選育具有重要意義.1材料和方法1.1植物材料實驗用的大豆品種為天隆1號、華春3號、威廉姆斯82和杰克.1.2實驗用培養(yǎng)基實驗用的雙元載體為pSOY11,pSOY12和pSOY19.這些載體的T-DNA區(qū)段由高抗草甘膦的假單胞桿菌中分離的目的基因G6-EPSPS(EU169459.1)和G10-EPSPS(AAF10666.1)組成(圖1).雙元載體pSOY11和pSOY19的骨架是pCAMBIA1300載體,通過XhoⅠ酶切將原載體中潮霉素抗性基因hpt切除,加入來自于苜?；ㄈ~病毒(Alfalfamosaicvirus)的增強子序列和棉花(GossypiumhirsutumL.)EPSPS基因前246個堿基的葉綠體信號肽(圖1).pSOY12的T-DNA區(qū)域除了G6基因表達框外,還攜帶了bar基因的表達框,轉(zhuǎn)基因過程中可選用草胺膦作為篩選劑.實驗用的根癌農(nóng)桿菌菌株為LBA4404.在pSOY19載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建了雙元載體pSOY17,pnBT,pnsBT,pGMⅠ,pGMⅡ和pGMⅢ,這些載體除了篩選標記基因外,還分別攜帶了抗蟲(pnBT,pnsBT)和高產(chǎn)(pGMⅠ,pGMⅡ,pGMⅢ)等目的基因或報告基因(pSOY17攜帶GUS).以這些載體開展的轉(zhuǎn)基因研究數(shù)據(jù)也體現(xiàn)在本研究中.實驗用農(nóng)桿菌首先在加有相應(yīng)抗生素的YEP(yeastextract-peptone)液體培養(yǎng)基(10g/L蛋白胨,10g/L酵母浸膏,5g/L氯化鈉,pH7.0)中振蕩培養(yǎng)至飽和,培養(yǎng)溫度為28℃,振蕩速率為250r/min.飽和菌液用250mLYEP液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)至A650nm=0.8~1.0,2000×g離心10min收集菌落后,用液體共培養(yǎng)基(liquidco-cultivationmedium,LCCM)重懸沉淀后備用.LCCM培養(yǎng)液含1/10的B5大量元素、B5微量元素和維生素、3%蔗糖、有機緩沖劑2(N-嗎啉)乙醇磺酸3.9g/L,pH5.4,120℃滅菌20min.在無菌環(huán)境下加入赤霉素(gibberellicacid,GA3)0.25mg/L、6-芐基腺嘌呤(benzylaminopurine,BAP)1.67mg/L、半胱氨酸(Cys)400mg/L、二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)154.2mg/L、乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)200μmol/L.1.3大豆種子吸脹改性co-cutivationmof2轉(zhuǎn)化方法參考美國IowaStateUniversity,PlantTransformationFacility使用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法.大豆種子采用氯氣干法滅菌16h后播種到萌發(fā)培養(yǎng)基上(蔗糖20g/L、瓊脂3g/L,pH5.8,120℃滅菌20min),28℃,光照(光周期18h/6h,光照強度140μmolmuf02d2suf02d1)12~15h.將吸脹的大豆種子置于無菌吸水紙上,沿著種臍用手術(shù)刀縱向切割種子,將子葉和下胚軸均勻分開兩瓣,去除種皮后備用.將農(nóng)桿菌重懸液倒入潔凈的無菌培養(yǎng)皿中,放入大約50個外植體,室溫侵染20~30min.將外植體取出,用無菌吸水紙吸干后置于放有無菌濾紙的共培養(yǎng)基(co-cultivationmedium,CM)上,每皿7~10個外植體.封口后在培養(yǎng)箱(Percival,美國)中23℃,黑暗共培養(yǎng)3~5天.CM培養(yǎng)基配方與LCCM相同,另加瓊脂5g/L.1.4si培養(yǎng)基si的使用共培養(yǎng)后,將外植體轉(zhuǎn)移到含篩選劑的芽誘導(dǎo)(shootinduction,SI)培養(yǎng)基上,SI培養(yǎng)基基本成分為B5培養(yǎng)基,外加蔗糖30g/L,2-(4-嗎啉)乙磺酸(2-(Nmorpholino)ethanesulfonicacid,MES)0.59g/L和瓊脂8g/L,pH5.8.120℃滅菌20min,冷卻到50℃,加入抽濾后的BAP1.67mg/L、替卡西林(ticarcillin,Tic)250mg/L、頭孢霉素(cephalosporin,Cef)100mg/L,培養(yǎng)基中還加入了標注濃度的草甘膦作為篩選劑.用透氣膠帶封口并轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)室(24℃,光周期18h/6h,光照強度140μmolmuf02d2suf02d1),每2周更換一次新鮮的SI培養(yǎng)基.SI培養(yǎng)4周后,切除殘余子葉,并轉(zhuǎn)移到芽伸長(shootelongation,SE)培養(yǎng)基上,SE培養(yǎng)基基本成分為MS(MurashigeandSkoog)培養(yǎng)基,外加蔗糖30g/L、MES0.59g/L、瓊脂8g/L,pH5.8.120℃滅菌20min后,加入抽濾后的赤霉素(GA3)30.5mg/L,L-天冬酰胺(L-Asp)50mg/L,谷氨酰胺(Glu)50mg/L,吲哚乙酸(indoleaceticacid,IAA)0.1mg/L,玉米素(zeatin,ZR)1mg/L,Tic250mg/L,Cef100mg/L及標注濃度的草甘膦篩選劑.培養(yǎng)條件同叢生芽誘導(dǎo)過程,培養(yǎng)2~8周,每2周更換一次SE培養(yǎng)基.將伸長3cm的幼芽切下,在吲哚丁酸(indolebutyricacid,IBA)中蘸30s后插入生根培養(yǎng)基(rootingmedium,RM)中,RM培養(yǎng)基含MS大量元素,MS微量元素和維生素,蔗糖20g/L,MES0.59g/L,瓊脂8g/L,吲哚丁酸(indole-3-butytricacid,IBA)0.1mg/L,L-Asp50mg/L,Glu50mg/L,Tic250mg/L,Cef100mg/L,1~2周后待根長約2cm時,將生根苗從培養(yǎng)基中取出,洗凈根部殘留的培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)入土中移至溫室培養(yǎng).1.5出苗率和基因型肝移植的特征本研究中再生率為篩選4周后剩余外植體個數(shù)/占侵染外植體總數(shù)的百分率;出苗率為經(jīng)轉(zhuǎn)基因程序后生根苗株數(shù)占侵染外植體總數(shù)的百分率;轉(zhuǎn)化效率為經(jīng)分子及除草劑抗性鑒定后確定的陽性轉(zhuǎn)基因苗株數(shù)占侵染外植體總數(shù)的百分率.1.6多序列比較與嵌入式樹分析1.7ssr-pcr反應(yīng)及檢測T0代轉(zhuǎn)基因大豆通過聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)檢測.用基因組DNA簡易提取法提取轉(zhuǎn)基因幼苗的基因組DNA后用PCR進行檢測.725bpEPSPS基因片段的引物序列為5′-GTACCGGCAGGCTGAAGTCC-3′(上游)和5′-CGGTCTGCACCATCGTCAAC-3′(下游).PCR反應(yīng)結(jié)束后,制作1%的瓊脂糖凝膠,將PCR產(chǎn)物點樣電泳20min,用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照.T1代轉(zhuǎn)基因苗用Southernblot檢測.用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammoniumbromide,CTAB)法抽提大豆葉片基因組DNA.30μg的DNA用XbaⅠ(Thermo,美國)完全酶切.酶切片段用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Amersham,英國).EPSPS基因的PCR產(chǎn)物用地高辛試劑盒標記(RocheAppliedScience,瑞士).預(yù)雜交、雜交、洗膜和檢測也根據(jù)試劑盒說明進行(RocheAppliedScience,瑞士).1.8半定量rt-pcr分析根據(jù)Trizol試劑說明抽提大豆幼苗葉片的總RNA(Invitrogen,美國).以M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega,美國)合成的cDNA第一條鏈為模板擴增目的基因,進行反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR).用大豆的ACTIN基因作為內(nèi)參,再用EPSPS基因引物進行半定量RT-PCR分析.半定量RT-PCR所用ACTIN基因片段上、下游引物分別為5′-TCAATGTGCCTGCCATGTATGTG-3′和5′-CCAGCGAGATCCAAACGAAG-3′.EPSPS基因上、下游引物分別為5′-CATCTGCTCTGAGACCAAGAA-3′和5′-GCCATCCAAGAACTACACCAC-3′.1.9穩(wěn)定型聚丙烯酰胺凝膠電泳大豆幼嫩葉片在液氮中研磨至粉末狀后移至離心管中,加入預(yù)冷的蛋白提取液(0.1mol/L醋酸鉀,20mmol/LCaCl2,2mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA),0.1mmol/L苯甲基磺酰氟,20%甘油,pH5.4),混合均勻,12000×g,4℃,離心15min,取上清.用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis,SDS)分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)膜上.將膜置于TBSTM(0.01mol/LTris-HCl,0.5mol/LNaCl,0.05%Tween-20,5%脫脂奶粉)中,室溫孵育1h;在TBSTM中按1/500加入EPSPS一抗,孵育1h;用TBST(0.01mol/LTris-HCl,0.5mol/LNaCl,0.05%Tween-20)洗膜3次,每次5min;在TBSTM中按1/10000加入山羊抗兔二抗(康為,北京),孵育1h;用TBST洗膜3次,每次5min;在10mLTBST中加入適量33μL5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphatep-toluidinesalt,BCIP)和66μL氯化硝基四氮唑藍(nitrobluetetrazolium,NBT),混勻,將膜置于其中進行顯色10min,烘干后照相.1.10田間藥劑防治轉(zhuǎn)基因大豆的草甘膦抗性檢測首先在溫室盆栽苗上進行,鑒定在幼苗1~3片三復(fù)葉時期進行,用1/200(體積比)的41%的農(nóng)達藥劑噴灑,劑量為植株葉面上有一薄層水膜.藥劑噴施后5~7天統(tǒng)計植株對草甘膦的抗性.田間除草劑抗性鑒定在苗齡3周時進行,以2倍的生產(chǎn)劑量進行鑒定,即41%農(nóng)達噴施劑量為6000g/hm2,5~7天后觀察植株對草甘膦的抗性.2結(jié)果2.1抗草甘膦的先發(fā)基因在大豆細胞中的表達為了獲得具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗草甘膦基因,將草甘膦污染土壤樣品在含有50mmol/L草甘膦的M63培養(yǎng)基培養(yǎng).由于M63不含芳香族氨基酸,存活和生長的細菌為抗性菌.獲得的一株抗性菌株能在含200mmol/L草甘膦的M63培養(yǎng)基生長.擴增獲得16SRNA后,經(jīng)序列鑒定,發(fā)現(xiàn)它與Pseudomonassp.‘FSLR1-057’菌株(AF205137),Pseudomonasputida(AB180734)(AM184283)及Pseudomonasrhizosphaerae(AY866408)均有99%的相同性.因此獲得的菌株來自假單胞桿菌(Pseudomonas).根據(jù)基因庫Pseudomonasputida已完成基因組測序的基因序列資料,設(shè)計引物對其EPSPS基因進行了擴增,獲得的產(chǎn)物用pMD18-T克隆并測序.結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與Pseudomonas等已完成基因組測序的EPSPS相似.測序獲得的EPSPS基因序列與其他已知抗草甘膦基因同源性較低.例如它與已知具有抗草甘膦的農(nóng)桿菌CP4的EPSPS基因的氨基酸序列只有46.4%的同源性,與Pseudomonassp.PG2982的只有46.5%的同源性(美國專利:5633435).該序列轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichiacoli)后能顯著地提高大腸桿菌對草甘膦的抗性.為了將該基因用于作物轉(zhuǎn)基因中,根據(jù)玉米(Zeamays)氨基酸密碼子的使用頻率,人工合成了編碼PseudomonasputidaF1的理論預(yù)測蛋白質(zhì)的EPSPS區(qū)域,定名為G6-EPSPS(EU169459).G6的功能在擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)、水稻(OryzasativaL.)(圖2A)、玉米(圖2B)中得到了驗證,含G6基因的轉(zhuǎn)基因水稻和玉米在噴灑草甘膦后生長良好,而非轉(zhuǎn)基因植株整株枯死.以G6基因為篩選標記基因,進行了大量的大豆轉(zhuǎn)基因工作,以攜帶G6基因的雙元載體pSOY11(圖1A)的農(nóng)桿菌侵染的外植體數(shù)目達14700,但未能獲得轉(zhuǎn)基因幼苗.為了進一步鑒定G6基因在大豆中的效果,將35S啟動子驅(qū)動的G6基因表達框裝入雙元載體pTF101.1后獲得新載體pSOY12(圖1B),以bar基因為篩選標記再轉(zhuǎn)入大豆中,獲得了22個轉(zhuǎn)基因株系.草甘膦噴灑后,轉(zhuǎn)基因植株的藥害雖顯著低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹牧?但仍有明顯藥害(圖2C),抗性不能達到生產(chǎn)要求.為了獲得高抗草甘膦的目標基因,用以上方法,又克隆了多個菌株中的EPSPS基因,其中從抗除草劑的耐輻射球菌(DeinococcusradioduransR1)中克隆的EPSPS基因,基因庫編碼為AAF10666.1.該基因轉(zhuǎn)入擬南芥后,含G10基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥在噴灑4500g/hm2的41%農(nóng)達后生長良好,對照植株整株枯死(圖3).基因編碼的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn),G10-EPSPS與CP4的同源性為32%,與G6-EPSPS的同源性為31%.CP4,G6-EPSPS及G10-EPSPS氨基酸序列同源性比對結(jié)果見圖4.由于G10-EPSPS在轉(zhuǎn)基因大豆中表現(xiàn)較強的抗除草劑能力,所以被用于本文后面介紹的抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因大豆研究.2.2液體共培養(yǎng)體系(ⅰ)受體基因型與轉(zhuǎn)化效率分析.大豆轉(zhuǎn)基因能否成功,很大程度上取決于受體大豆基因型對農(nóng)桿菌的易感性及再生能力,因此,受體大豆的基因型是影響大豆轉(zhuǎn)基因效率的重要因素.前期工作中通過瞬時表達率和再生率2項指標分析,篩選出適宜大豆遺傳轉(zhuǎn)化的華春3號、華春6號、天隆1號和威廉姆斯82等品種.將轉(zhuǎn)基因體系的篩選標記改為草甘膦,鑒定了以上大豆基因型的轉(zhuǎn)化效率.草甘膦篩選轉(zhuǎn)基因體系的流程如圖5所示,與報道的草胺膦篩選體系相比,該體系SE篩選4周后叢生芽發(fā)黃,而不是整棵褐化變黑.草胺膦篩選體系中表現(xiàn)優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因受體品種天隆1號、華春3號、杰克和威廉姆斯82對草甘膦篩選體系反應(yīng)良好,其中華春3號、天隆1號和杰克的平均轉(zhuǎn)化效率為1%左右,威廉姆斯82的平均轉(zhuǎn)化效率略低,約為0.8%(表1).(ⅱ)固體與液體共培養(yǎng)的比較.相比于以瓊脂為介質(zhì)的固體培養(yǎng)基,液體培養(yǎng)操作方便,在植物轉(zhuǎn)基因研究中有很大的應(yīng)用前景.在大豆遺傳轉(zhuǎn)化研究中,國際上已經(jīng)報道了很多關(guān)于液體培養(yǎng)的技術(shù),不僅是共培養(yǎng),在篩選和分化等步驟中都采用液體培養(yǎng)方法.本研究比較了液體與固體共培養(yǎng)體系對大豆轉(zhuǎn)基因效率的影響.實驗選用基因型天隆1號,載體pSOY19,農(nóng)桿菌菌株LBA4404分別進行5批子葉節(jié)外植體侵染實驗.通過2種不同方法進行共培養(yǎng),對外植體進行再生率統(tǒng)計.結(jié)果表明,液體共培養(yǎng)體系對大豆的再生率無顯著影響(表2).但液體共培養(yǎng)體系可大大地節(jié)省培養(yǎng)基配制的工作量和培養(yǎng)基成本,因而推薦在今后的大豆轉(zhuǎn)基因工作中采用.(ⅲ)草甘膦篩選濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響.按照農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化方法,用攜帶pSOY19載體的農(nóng)桿菌LBA4404侵染大豆杰克的子葉節(jié)外植體,共培養(yǎng)后,用不同的草甘膦篩選濃度梯度(2.5~100mg/L)進行篩選.在不同草甘膦篩選濃度的SI培養(yǎng)基和相同草甘膦篩選濃度的SE培養(yǎng)基中各篩選4周后,外植體的生長狀態(tài)出現(xiàn)明顯差異.當(dāng)SI培養(yǎng)基草甘膦篩選濃度在2.5~10mg/L時,外植體的叢生芽生長旺盛(圖6A和C),篩選濃度為50mg/L時,外植體生長沒有受到抑制;草甘膦篩選濃度為100mg/L時,叢生芽的誘導(dǎo)受到明顯抑制(圖6B和D).對外植體的再生率進行統(tǒng)計分析,結(jié)果表明,隨著SI中草甘膦篩選濃度的增加,外植體的再生率呈下降趨勢(圖6E).其中,草甘膦篩選濃度在2.5~10mg/L時,再生率的差異較小,二次篩選培養(yǎng)后外植體的平均叢生芽再生率約為75%;篩選濃度上升到50mg/L時,再生率顯著降低,約為50%;篩選濃度為100mg/L時,再生率下降至30%.實驗結(jié)果表明,在SI培養(yǎng)階段,隨著草甘膦濃度增加,低濃度的草甘膦對外植體生長無顯著差異,高濃度的草甘膦則顯著抑制外植體生長.研究利用pSOY19及其5個衍生載體(除G10-EPSPS外攜帶一個目的基因)pnBT,pnsBT,pGMⅠ,pGMⅡ和pGMⅢ,比較了10和100mg/L2種草甘膦濃度篩選對最終轉(zhuǎn)基因效率的影響.當(dāng)叢生芽誘導(dǎo)、芽伸長階段草甘膦篩選濃度分別從10和5mg/L提高到100和10mg/L時,即選擇程序從10/10/5/5提高到100/100/10/10時,雖然再生率顯著下降(圖6E),但平均轉(zhuǎn)基因效率仍達1.05%(表3),2種篩選程序的轉(zhuǎn)基因效率在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異.高濃度的草甘膦篩選抑制了非抗性叢生芽的生長,使抗性芽得到了更好的生長機會,同時在轉(zhuǎn)基因過程中節(jié)省了大量培養(yǎng)基,因而推薦采用.2.3嵌入3g-mb-pcr陽性植株的ssr-pcr分析T0代再生大豆植株中目的基因的整合首先通過PCR檢測進行.圖7A展示了10個T0代植株的G10-EPSPS基因的PCR結(jié)果,其中L1,L2,S8,S9,S22和S24為PCR陽性植株;L3,S10,S11和S12為PCR陰性植株.為了驗證G10-EPSPS基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達水平,提取PCR陽性植株的RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,以大豆ACTIN作為內(nèi)參,對轉(zhuǎn)入的G10-EPSPS基因進行半定量表達分析,從圖7B結(jié)果可見,以上PCR陽性植株的G10-EPSPS基因均有很高的表達量.對T1代轉(zhuǎn)基因植株提取基因組DNA后,每個株系取2株樣品,每個樣品取30μg基因組DNA,用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ進行酶切,用地高辛標記EPSPSG10為探針后進行Southernblot鑒定.圖7C結(jié)果顯示,L1,L2,S8,S9和S22轉(zhuǎn)基因事件均為單拷貝插入的獨立轉(zhuǎn)基因陽性株系.為了明確各轉(zhuǎn)基因株系目的基因的蛋白表達水平,提取了L1,L2,S8,S9,S22和S24等6個株系的轉(zhuǎn)基因大豆總蛋白,用G10-EPSPS的抗體進行Westernblot檢測,圖7D結(jié)果顯示,6個待檢測的轉(zhuǎn)基因大豆樣品中均能檢測到48kD的目的蛋白,為轉(zhuǎn)基因陽性植株.2.4t0抗轉(zhuǎn)大豆t0的鑒定對溫室種植的T0代轉(zhuǎn)基因植株進行了抗除草劑的初步鑒定,除草劑濃度梯度實驗表明,播種后3周的大豆幼苗噴施1/200(體積比)41%的農(nóng)達1周后可以清楚地區(qū)分轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因的大豆植株(圖8A).用此方法,鑒定并篩選獲得了T0代高抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因植株.對T1及T2代的轉(zhuǎn)基因大豆植株,田間中間實驗過程中選用了2倍的生產(chǎn)劑量,對轉(zhuǎn)基因大豆進行了草甘膦抗性鑒定.如圖8B和C所示,轉(zhuǎn)基因大豆的后代出現(xiàn)了除草劑抗性分離,抗性轉(zhuǎn)基因大豆植株能夠正常生長,而分離出的陰性轉(zhuǎn)基因大豆植株整株枯萎死亡.3抗雜草性能優(yōu)良的基因受體類型及其用量我國具有自主知識產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因大豆新品種選育仍處于研發(fā)階段.本研究從草甘膦抗性基因克隆、功能比較、轉(zhuǎn)基因體系建立等方面入手,開展了抗除草劑草甘膦的轉(zhuǎn)基因大豆培育工作.完成了G6-EPSPS和G10-EPSPS2個抗草甘膦