醬腌菜咸胚中亞硝酸鹽的測定 頂空-氣相色譜法 征求意見稿編制說明

地方標(biāo)準(zhǔn)《醬腌菜咸胚中亞硝酸鹽的測定頂空-氣相色譜法》編制說明一、任務(wù)來源及背景說明本標(biāo)準(zhǔn)為地方標(biāo)準(zhǔn)制定項目，2023年由湖南省市場監(jiān)督管理局立項，湖南省食品標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口，下達文件：湘市監(jiān)標(biāo)函[2023]25號。醬腌菜產(chǎn)地甚多，湖南、浙江、福建等地均有大型的產(chǎn)業(yè)基地，醬腌菜生產(chǎn)企業(yè)近萬家。據(jù)統(tǒng)計，2004年我國腌制品行業(yè)的年銷售額在20億元左右，到2017年榨菜行業(yè)規(guī)模達50億元，2020年突破60億元。我國腌制菜年出口量近20萬噸，如日本蔬菜加工品中55%是腌制品;日本每年消費鹽漬菜大約40億美元，其中80%左右鹽漬菜從我國進口。我省醬腌菜生產(chǎn)主要集聚在岳陽市，該產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，作為主要經(jīng)濟支撐行業(yè)之一，現(xiàn)有大型企業(yè)湖南插旗菜業(yè)有限公司、湖南錦瑞食品有限公司、湖南李記食品有限公司等。但2022年央視“3·15”晚會腌制菜生產(chǎn)引發(fā)眾多網(wǎng)友關(guān)注。其中，康師傅等企業(yè)老壇酸菜供應(yīng)商湖南插旗菜業(yè)有限公司曝光，該企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化腌制池腌出來的酸菜，是用來加工出口產(chǎn)品的，而內(nèi)銷的老壇酸菜包里的酸菜，則是從外面收購來的“土坑酸菜”。事件過后，政府和企業(yè)啟動對相關(guān)產(chǎn)品的下架回收，其帶來的經(jīng)濟社會影響是巨大的?；诖?，我院聯(lián)合岳陽市檢驗檢測中心啟動關(guān)于醬腌菜系列標(biāo)準(zhǔn)的研究工作，以期保障產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。目前國內(nèi)關(guān)于醬腌菜有產(chǎn)品和衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，如GB2714-2015食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)醬腌菜、SB/T10439-2007醬腌菜、NY/T437-2012綠色食品醬腌菜、GB/T5009.54-2003醬腌菜衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法等。亞硝酸鹽作為醬腌菜的重要污染指標(biāo)之一，現(xiàn)有檢測方法主要為GB/T5009.33-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》，標(biāo)準(zhǔn)中包含三種方法：第一法離子色譜法，亞硝酸鹽檢出限為0.2mg/kg；第二法分光光度法，亞硝酸鹽檢出限:液體乳0.06mg/kg,乳粉0.5mg/kg,干酪及其他1mg/kg；第三法蔬菜、水果中硝酸鹽的測定紫外分光光度法，硝酸鹽檢出限為1.2mg/kg。二、制定的目的和意義醬腌菜是湖南省岳陽市的特色食品，該產(chǎn)品以新鮮蔬菜為主要原料，采用不同的腌漬工藝制作而成的各種蔬菜制品。我國醬腌菜生產(chǎn)的歷史悠久，品種繁多，是人民群眾喜愛的一種佐餐食品。硝酸鹽和亞硝酸鹽作為常用食品添加劑中的發(fā)色劑和防腐劑，廣泛存在于此類食品中。而且在醬腌菜的生產(chǎn)過程中也會產(chǎn)生該類物質(zhì)，隨著腌制時間長短還會出現(xiàn)含量不一的現(xiàn)象。其原理在于蔬菜中常含有較多的硝酸鹽，大量使用含氮肥料、除草劑，土壤中缺鉬或干燥時節(jié)均可使農(nóng)作物大量蓄積硝酸鹽，其在還原性微生物作用下轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽。在蔬菜發(fā)酵初期酸性環(huán)境尚未形成，具有硝酸鹽還原作用的雜菌將蔬菜中大量硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，使產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量急劇升高。蔬菜在腌漬的一定時期由硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽是一種強毒性物質(zhì)，成年人一次性攝入3g即可致死，其對人體造成的危害，主要包括引起高鐵血紅蛋白癥以及在人體內(nèi)形成致癌物質(zhì)亞硝胺。過多攝入的亞硝酸鹽使紅細胞亞鐵血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，導(dǎo)致全身出現(xiàn)缺氧反應(yīng)，高鐵血紅蛋白在體內(nèi)達到70%以上時將導(dǎo)致死亡。亞硝酸鹽的長期攝入還會引起維生素A缺乏癥。由亞硝酸鹽引起的胎兒和嬰兒組織性缺氧，嚴重時會危及生命。食品中的亞硝酸鹽已引起人們足夠的重視，經(jīng)過聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）食品添加劑委員會的數(shù)次修訂，在2002年亞硝酸鹽的每日允許攝入量（ADI）被建議為每千克體重0~0.07mg。此外，歐共體建議嬰兒食品中不得使用亞硝酸鹽。亞硝酸鹽和硝酸鹽已成為食品質(zhì)量安全中重要的檢測指標(biāo)。中國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》GB2762—2022中規(guī)定，腌漬蔬菜亞硝酸鹽（以NaNO2計）不超過20mg·kg-1。中國《綠色食品醬腌菜》標(biāo)準(zhǔn)（NY/T437—2012）中規(guī)定亞硝酸鹽（NaNO2計）≤4mg·kg-1。目前，醬腌菜中亞硝酸鹽的檢測主要采用GB/T5009.33-2016第二法分光光度法，該方法操作相對繁瑣，能影響最終測定結(jié)果的因素較多，其準(zhǔn)確性易受操作環(huán)境、檢測人員等的影響，且該方法檢出限高，亞硝酸濃度較高時，重復(fù)性差，平行性不好。第一法為離子色譜法，帶電導(dǎo)檢測器的離子色譜法受基體、溫度影響較大，而且有大量氯離子存在下無法測定亞硝酸鹽，使用率也就不高。其他檢測ＮＯ－2和ＮＯ－3的方法如熒光法，該方法靈敏，但有些物質(zhì)的存在會增加或降低熒光強度導(dǎo)致相對標(biāo)準(zhǔn)誤差增大，特別是醬腌菜成分復(fù)雜?，F(xiàn)階段沒有任何標(biāo)準(zhǔn)采用頂空-氣相色譜法對醬腌菜亞硝酸鹽的檢測，我院積累歷年檢測和科研經(jīng)驗，發(fā)現(xiàn)該方法前處理簡單，檢出限低，準(zhǔn)確度和靈敏度高，干擾小，重復(fù)性好，可以大批量檢測醬腌菜中的亞硝酸鹽，更好縮短檢測時限，更好為我省醬腌菜企業(yè)提供服務(wù)保障。因此本文件旨在建立頂空-氣相色譜法測定醬腌菜中亞硝酸鹽，包括樣品制備和檢測的方法，該方法確立填補頂空-氣相色譜法測定醬腌菜亞硝酸鹽檢測標(biāo)準(zhǔn)的空白，同時為進一步對國標(biāo)食品中亞硝酸鹽測定方法的制修訂提供技術(shù)支持。三、制定標(biāo)準(zhǔn)工作簡介1、主要工作過程 本標(biāo)準(zhǔn)的編制工作從2023年3月開始，由湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗研究院食品檢驗部具體承擔(dān)。本標(biāo)準(zhǔn)制定嚴格按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》要求進行。從接到標(biāo)準(zhǔn)的編制任務(wù)開始，參加編寫的人員就開始收集醬腌菜中亞硝酸鹽的相關(guān)資料。包括收集亞硝酸鹽的文獻和各類標(biāo)準(zhǔn)、醬腌菜中亞硝酸鹽檢測方法相關(guān)文獻，組織編制組成員多次討論研究，初步確定醬腌菜亞硝酸鹽的試驗方案。其次，編制組成員通過探究性試驗，優(yōu)化色譜條件等，確定了試驗方案。并對試驗方案進行反復(fù)確證研究，包括精密度試驗、回收率試驗、實際樣品檢測，確定了最終試驗方案。項目組經(jīng)過多次討論修改，初步形成了標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿。再次，項目組就標(biāo)準(zhǔn)草案征求了廣電計量檢測（湖南）有限公司、岳陽市檢驗檢測中心、懷化市檢驗檢測中心等檢驗機構(gòu)或公司相關(guān)技術(shù)專家的意見。最后，項目組對各方專家頂空-氣相色譜法對醬腌菜中亞硝酸鹽的測定方法地方標(biāo)準(zhǔn)的意見和建議進行了充分討論研究，形成了《醬腌菜咸胚中亞硝酸鹽的測定頂空-氣相色譜法》征求意見稿。2、標(biāo)準(zhǔn)主要起草人及分工見表1表1主要起草人及分工序號起草人所在單位主要工作1曾小明湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗研究院項目負責(zé)人2吳海智項目總體聯(lián)絡(luò)與溝通3袁列江技術(shù)指導(dǎo)4上官佳標(biāo)準(zhǔn)文本編寫5蘇家佑企業(yè)聯(lián)絡(luò)與溝通6程夢雅實驗操作7何浩實驗操作8朱禮岳陽市檢驗檢測中心主要研究人員9朱明揚主要研究人員10張鵬斐懷化市檢驗檢測中心主要研究人員四、標(biāo)準(zhǔn)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)的編制遵循GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則—第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》和GB/T20001.4-2001《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：化學(xué)分析方法》的要求編寫制訂，標(biāo)準(zhǔn)編制遵循“科學(xué)性、實用性、統(tǒng)一性、規(guī)范性”的原則，重點突出在方法準(zhǔn)確性、可操作性，并注重標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一性和規(guī)范性。五、標(biāo)準(zhǔn)的重要內(nèi)容說明1范圍本文件規(guī)定了醬腌菜咸胚中亞硝酸鹽的測定方法。本文件適用于頂空-氣相色譜法測定醬腌菜咸胚中亞硝酸鹽。2原理在酸性條件下，環(huán)已基氨基磺酸鈉和亞硝酸鈉在酸性條件下反應(yīng)生成環(huán)己醇，環(huán)己醇在酸性條件下又繼續(xù)與亞硝酸鈉發(fā)生酯化反應(yīng)生成環(huán)己烯，環(huán)己烯在常溫下成氣態(tài)，采用頂空氣相進樣系統(tǒng)進行定量檢測。根據(jù)環(huán)己烯色譜響應(yīng)值與亞硝酸鹽濃度成正比，計算出醬腌菜咸胚中亞硝酸鹽含量。3實驗方法的確定與驗證3.1檢測方法的確定醬腌菜中亞硝酸鹽通過頂空-氣相色譜進行分離，采用FID進行檢測。以亞硝酸鈉作為標(biāo)品，樣品處理液中先后加入環(huán)己基氨基磺酸鈉溶液和硫酸溶液，在頂空瓶中５０℃條件下發(fā)生重氮化反應(yīng)，以衍生產(chǎn)物環(huán)己烯作為目標(biāo)產(chǎn)物，定量分析進行定量測定。3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制3.2.1亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（200ug/ml）（以亞硝酸鈉計):準(zhǔn)確稱取0.1000g于110℃~120℃干燥恒重的亞硝酸鈉，加水溶解，移入500mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。3.2.2亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液A(1.0ug/mL)：臨用前，吸取2.50mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，置于500mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。3.2.3亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液B(0.05ug/mL)：臨用前，吸取5.00mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。3.3試樣前處理的要求試樣前處理方法參考GB/T5009.33-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》具體如下：稱取3g(精確至0.001g)勻漿試樣,置于250mL具塞錐形瓶中,加5mL50g/L飽和硼砂溶液,加入70℃左右的水約60mL，混勻，于沸水浴中加熱15min，取出置冷水浴中冷卻，并放置至室溫。定量轉(zhuǎn)移上述提取液至100mL容量瓶中，加入2mL106g/L亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入2mL220g/L乙酸鋅溶液，以沉淀蛋白質(zhì)。加水至刻度,搖勻,放置30min,除去上層脂肪,上清液用濾紙過濾,棄去初濾液30mL,濾液備用。3.4儀器測定條件的選擇和優(yōu)化3.4.1方法原理被測樣品溶液置于密封的頂空瓶中,在恒定的溫度和硫酸介質(zhì)中,樣品中的亞硝酸鹽與環(huán)已基氨基磺酸鈉反應(yīng)生成環(huán)己烯,環(huán)己烯在常溫下成氣態(tài),用帶有FID檢測器的氣相色譜儀進行分析,以保留時間定性。本文件分別考察了色譜柱類型、環(huán)己基氨基磺酸鈉濃度、硫酸濃度、平衡溫度、平衡時間的影響，優(yōu)化試驗條件。3.4.2氣相色譜條件色譜柱參考選擇石英毛細管柱(10%二甲基聚硅氧烷)，本文件中分別選用了DB-1(30m×0.32mm×0.50um)、DB-624(30m×0.32mm×1.8um)進行試驗，保留時間分別為2.481min和3.333min，分離良好。3.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限―配制亞硝酸鹽濃度依次為0、0.015、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、3.0ug的標(biāo)準(zhǔn)系列,用外標(biāo)法繪制出濃度–峰面積校正曲線，見表1。相關(guān)系數(shù)r=0.9995,回歸方程F(x)=12607x-42.963。本研究選用3倍信噪比為判斷標(biāo)準(zhǔn),若取3g樣品測定,測得亞硝酸鹽的最低檢出濃度0.10mg/kg，當(dāng)樣品含量較高時,可減少取樣量或者減少進樣量。3.4.4對環(huán)己基氨基磺酸鈉濃度為10mg/L時,分別加入0.50、1.00、1.50、2.00和2.50mL進行測定,結(jié)果顯示當(dāng)環(huán)己基氨基磺酸鈉加入量在1.00mL以上時信號響應(yīng)不再隨環(huán)己基氨基磺酸鈉的含量增加而升高,實驗時選擇1.00mL。3.4.5硫酸主要是給亞硝酸鹽酯化提供酸性環(huán)境,經(jīng)實驗加入100g/L硫酸0.50、1.00、1.50和2.00mL對檢測器的信號響應(yīng)值沒有明顯影響,選擇使用1.00mL100g/L硫酸。3.4.6一般來說,平衡溫度越高,分析靈敏度越高,但過高的平衡溫度又會產(chǎn)生大量的水蒸氣,反而會降低響應(yīng)值。選擇在2.50mL樣品中加入等量的標(biāo)準(zhǔn)溶液,在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃條件下平衡30min,在同一色譜條件下分析。結(jié)果表明隨著溫度的升高,響應(yīng)值一直在增大,但溫度過高,水量也在逐漸增大,會對檢測器有損害,因此在能滿足檢測限的要求下,選擇盡量低的保溫溫度,最終選擇50℃即可滿足要求。3.4．7待測物質(zhì)在氣液兩相達到平衡狀態(tài)需要一定的時間,選擇在10mL樣品中加入等量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在50℃條件下設(shè)平衡時間為10、20、30、40和50min,在同一色譜條件下分析。結(jié)果表明環(huán)己烯的峰面積隨著平衡時間的延長先增加然后趨于平緩,30min后峰面積變化不明顯,故本方法先用30min為平衡時間。3.5方法驗證3.5.1線性回歸方程、線性范圍、檢出限和定量限按照儀器工作條件以亞硝酸鈉含量（ug）為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的響應(yīng)值峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，目標(biāo)物的線性濃度范圍為0.015～3ug，相關(guān)系數(shù)大于0.9990；以3倍、9倍信噪比（S/N）計算方法的檢出限（3S/N）和定量限(9S/N)，本方法的檢出限和定量限結(jié)果見表2。表2線性回歸方程、線性范圍、檢出限和定量限標(biāo)準(zhǔn)溶液亞硝酸鈉質(zhì)量（ug）峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線信息濃度（ug/mL）進樣體積（mL）0.050000.300.0152120.400.022701.000.056702.000.1010381.00.200.2025440.500.5062281.001.00127692.002.00244313.003.0038209線性回歸方程F(x)=12607x-42.963線性相關(guān)系數(shù)0.9995方法檢出限0.1mg/kg方法定量限0.3mg/kg頂空氣相色譜法測定醬腌菜中亞硝酸鹽，取樣量為3g時，檢出限為0.1mg/kg，方法定量限為0.3mg/kg。3.5.2加標(biāo)回收率按照上述試驗方法對樣品進行3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗，每個濃度水平平行測定3次，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，3個加標(biāo)水平下的回收率為97.2%~103.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=3）為0.446%~2.61%；表明本方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。表3加標(biāo)回收率樣品名稱樣品質(zhì)量（g）加標(biāo)量（ug）實際樣品亞硝酸鈉含量mg/kg測定值mg/kg回收率（%）RSD（%）醬腌菜（辣椒醬）3.2937350.05511.0393103.40.9783.091311.6585102.53.144911.3454101.43.02526019.423597.72.613.086119.8568101.93.175918.426397.23.008512040.8310102.20.4463.227938.2540102.83.518735.2176103.13.5.3方法的重復(fù)性重復(fù)性是重復(fù)條件下的精密度，同一實驗室，同一人操作，使用相同的設(shè)備，用同樣的方法分別獲得獨立測量結(jié)果。分別對醬腌菜1（酸豆角）和醬腌菜2（剁辣椒）重復(fù)檢測6次，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中亞硝酸鈉含量。對比結(jié)果計算RSD，兩種醬腌菜樣品的RSD為2.15%與2.81%，結(jié)果表明方法穩(wěn)定，重復(fù)良好。具體數(shù)據(jù)見表4。表4方法重復(fù)性醬腌菜1（酸豆角）醬腌菜2（辣椒醬）樣品質(zhì)量（g）樣品中亞硝酸鹽含量（mg/kg）RSD(%)樣品質(zhì)量（g）樣品中亞硝酸鹽含量（mg/kg）RSD(%)3.18966.832.153.00131.512.813.28866.653.02681.523.26616.993.08921.513.44806.683.03541.603.27066.953.20121.593.26536.953.01781