動物細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器及專用微載體

動物細胞培養(yǎng)生物反響器及專用微載體廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院柯德森為什么要進行動物細胞培養(yǎng)?動物細胞的特點、培養(yǎng)條件及存在問題動物細胞培養(yǎng)方式動物細胞培養(yǎng)的操作方式動物細胞培養(yǎng)生物反響器動物細胞反響器的控制動物細胞培養(yǎng)專用微載體內(nèi)容提要動物細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)是指離體細胞在無菌條件下分裂、生長，在整個培養(yǎng)過程中不出現(xiàn)分化，不再形成組織。動物細胞培養(yǎng)的意義動物細胞培養(yǎng)對生產(chǎn)生物工程產(chǎn)品,特別是功能蛋白質(zhì)方面具有明顯的優(yōu)勢:1)同源性:直接進行翻譯后加工,蛋白質(zhì)可直接折疊成正確的構(gòu)象翻譯后修飾糖基化，與天然產(chǎn)品一致。2)有利于產(chǎn)品的別離純化:分泌胞外、純化方便動物細胞培養(yǎng)的意義醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域生物工程生物制藥領(lǐng)域羊水細胞培養(yǎng)羊水細胞培養(yǎng)是培養(yǎng)羊水內(nèi)脫落的胎兒細胞，做成染色體核型分析，用于診斷胎兒染色體病及胎兒畸形，是一種科學(xué)的、結(jié)果可靠的、平安的產(chǎn)前診斷法。

MRC-5：從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細胞系。核型為2n=46。屬成纖維細胞。培養(yǎng)基用加小牛血清。同工酶G6PDB型。有限壽命42～46代。增殖速度較W1-38快，對不良環(huán)境敏感性較W1-38低。對人的病毒敏感。

用于生產(chǎn)疫苗。BHK-21:從5只無性別的生長1天的地鼠幼鼠腎臟中別離的;成纖維樣細胞,核型為2n=44;培養(yǎng)基為DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，現(xiàn)已用于工程細胞構(gòu)建。Vero：從正常成年非洲綠猴腎臟別離的。為貼壁依賴的成纖維細胞，核型2n=60；培養(yǎng)基為199培養(yǎng)基，加5%胎牛血清；用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒。

Namalwa：從肯尼亞患有淋巴瘤病人獲取，建成的人的類淋巴母細胞。2.8%的高倍體率，12～14條標記染色體。單條X，無Y。培養(yǎng)基為RPMI1640，添加7%胎牛血清。用于生產(chǎn)α干擾素。SP2/0-Ag14：通過融合的方法，從有羊抗紅細胞活性的BALB/c小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞系P3X63Ag8融合雜交瘤SP2/NL-Ag亞克隆中別離獲得，能耐受8氮鳥嘌呤20μg/ml但在含HAT選擇培養(yǎng)基中不能存活。通常用培養(yǎng)基為DMEM，添加10%胎牛血清。用于生產(chǎn)單抗雜交瘤細胞和抗體。Sf-91983年從親代IPLB—SF21AE中克隆形成。親代細胞從秋粘蟲的蛹卵組織中別離獲得。它對苜宿尺蠖核型多角體病毒和其它桿狀病毒高度敏感。通常用的培養(yǎng)基為Grace培養(yǎng)基，添加3.3g/L水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液,10%胎牛血清。用于高效表達外來蛋白制品。動物細胞的生理特點動物細胞有兩種類型:1〕非貼壁依賴性細胞(血液、淋巴組織、腫瘤組織〕2〕貼壁依賴性細胞〔大多數(shù)動物細胞，包括非淋巴組織的細胞和許多異倍體細胞〕培養(yǎng)方法1、貼壁培養(yǎng)2、懸浮培養(yǎng)3、固定化培養(yǎng)貼壁培養(yǎng):貼壁依賴性細胞在培養(yǎng)中要貼附于壁上才能迅速鋪展,開始有絲分裂并迅速進入對數(shù)生長期,這種培養(yǎng)方式就叫貼壁培養(yǎng).多數(shù)動物細胞的培養(yǎng)都采取這種方式.動物細胞對周圍環(huán)境十分敏感:

對理化因素敏感，如：滲透壓、pH、離子濃度、剪切力、微量元素等。動物細胞對培養(yǎng)基要求高:

必需氨基酸、維生素、無機鹽、微量元素、葡萄糖、細胞生長因子、貼壁因子等。1、培養(yǎng)基組成：血清是目前細胞培養(yǎng)基中不可缺少的成分，向細胞提供生長所需要的激素、轉(zhuǎn)移蛋白和其他營養(yǎng)成分，已成為細胞培養(yǎng)到達最優(yōu)化和降低本錢的主要障礙。降低血清用量和采用無細胞培養(yǎng)基是目前研究的熱點。六大限制細胞生長的因素：血清培養(yǎng)基的主要缺點及其原因：血清中含有細胞生長必須的微量組分，但這些組分的成分及其作用至今未清楚，因此無法取代；血清的存在是產(chǎn)物純化的主要障礙；血清是病毒污染及其他未知因素影響的主要來源，增加了細胞培養(yǎng)產(chǎn)品潛在的使用危險；血清是培養(yǎng)根本錢的主要局部；血清同時也有生長抑制的作用；血清使用使實驗和生產(chǎn)過程標準化變得困難。2、限制細胞生長的因素：動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)能到達的細胞密度較低的主要原因是培養(yǎng)條件和最優(yōu)化控制的困難，包括：細胞代謝產(chǎn)物的毒害：乳酸、氨等；營養(yǎng)物的耗竭可利用的外表積的限制；接種的細胞最小密度；解決問題的方法是通過過程調(diào)控來實現(xiàn)：灌注系統(tǒng)、換液、流加等，其中灌注是最好的方法。同時采用合理的培養(yǎng)系統(tǒng)以增加外表積并提供最正確的物理化學(xué)環(huán)境。細胞凋亡3、污染的控制：污染來源包括細胞種子、血清、試劑、實驗環(huán)境和操作人員。污染控制起始于細胞種子及其保存；除菌方法的改進是關(guān)鍵---血清？可高溫滅菌的培養(yǎng)基的研究；設(shè)備的合理設(shè)計及操作人員的培訓(xùn)必不可少。4、產(chǎn)物表達的控制：問題：細胞生長的最優(yōu)化條件并不一定是表達的產(chǎn)物的最優(yōu)化條件？問題的解決在于上游分子生物學(xué)的研究5、硬件和過程設(shè)計參數(shù)：硬件設(shè)計中的主要問題：細胞培養(yǎng)條件的控制〔溫度、溶解氧、二氧化碳、pH、滲透壓〕，其中充分的氧傳遞是所有生物反響器中的共同問題；而其他條件對動物細胞來說可以接受的范圍都比較窄。污染的排除；遏制潛在生物毒害物的擴散；足夠外表積的提供；培養(yǎng)過程中剪切力的控制〔攪拌、通氣、收獲〕6、產(chǎn)物收獲目前細胞培養(yǎng)產(chǎn)物的收率很低，不及總蛋白的1%，主要原因在于：血清蛋白質(zhì)的污染；細胞表達產(chǎn)物濃度低；產(chǎn)物在培養(yǎng)條件下不穩(wěn)定；解決方法：使用無血清培養(yǎng)基；開發(fā)在無血清培養(yǎng)基中穩(wěn)定蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法；開發(fā)篩選技術(shù)以得到產(chǎn)量高的細胞克??；開發(fā)產(chǎn)物別離技術(shù)：親和柱、中空纖維、微囊等動物細胞培養(yǎng)的方式1、貼壁培養(yǎng)2、懸浮培養(yǎng)3、固定化培養(yǎng)一.貼壁培養(yǎng)概念:貼壁依賴性細胞在培養(yǎng)中要貼附于壁上才能迅速鋪展,開始有絲分裂并迅速進入對數(shù)生長期,這種培養(yǎng)方式就叫貼壁培養(yǎng).多數(shù)動物細胞的培養(yǎng)都采取這種方式.1.單層靜置貼壁培養(yǎng)2.多層固定培養(yǎng)法玻璃圓柱鈦碟裝置3.微載體培養(yǎng)優(yōu)點:外表積/體積比大;微載體懸浮于培養(yǎng)基中,細胞生長環(huán)境均一,便于監(jiān)測和控制;培養(yǎng)基利用率高;采樣重演性好;收獲過程不復(fù)雜;放大較容易;勞動強度小,占用空間小.4.中空纖維培養(yǎng)法:模擬脈管在細胞間分布擴散的原理,采用合成的中空纖維制成類似脈管的分布擴散系統(tǒng).細胞接種于中空纖維外外表與反響器內(nèi)外表之間,培養(yǎng)液自入口進入儲罐,進行再生處理,循環(huán)使用.6.玻璃珠床反響器二.懸浮培養(yǎng)概念:是指細胞在培養(yǎng)器中自由懸浮生長的過程.主要用于非貼壁依賴性細胞培養(yǎng),如雜交瘤細胞等.是在微生物發(fā)酵的根底上開展起來的;可以借鑒微生物發(fā)酵的經(jīng)驗;由于動物細胞比較脆弱,所以在攪拌通氣等方式上必須比微生物培養(yǎng)更加溫和.三.固定化培養(yǎng)概念:利用吸附或包埋等固定化的方式將細胞限制在一定的空間內(nèi),然后以固定化的顆粒進行懸浮培養(yǎng).該方法對貼壁性和非貼壁依賴性細胞都是適合的.常用的包埋培養(yǎng)方法:對非貼壁依賴性細胞常用海藻酸鈣包埋;對貼壁依賴性細胞常用膠原包埋.動物細胞培養(yǎng)的操作方式分為5種:分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式、灌注式一、分批式操作：概念：是將細胞和培養(yǎng)液一次性裝入反響器內(nèi)，進行培養(yǎng)，細胞不斷生長，產(chǎn)物也不斷形成，經(jīng)過一段時間后，將整個反響系取出。培養(yǎng)過程：滯后期、對數(shù)生長期、減速期、穩(wěn)定期、衰退期優(yōu)點：操作簡便，容易掌握，是最常用的方式；缺點：不能使細胞自始至終處于最優(yōu)條件下。二、流加式操作：概念：先將一定量的培養(yǎng)液裝入反響器，，在培養(yǎng)過程中隨著細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，新的營養(yǎng)成分不斷補充至反響器內(nèi)，使細胞進一步代謝，到反響終止時取出整個反響系。特點：1〕能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)濃度；2〕整個過程中反響體積是變化的。存在二種流加方式：無反響控制流加：反響控制流加：最常見的流加物質(zhì)：葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源三、半連續(xù)式操作〔反復(fù)分批式、換液培養(yǎng)〕：概念：在分批培養(yǎng)操作的根底上，不全部取出反響系，剩余局部重新補充新的營養(yǎng)成分，再按分批式操作方式進行培養(yǎng)，反響器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變。優(yōu)點：可反復(fù)收獲培養(yǎng)液，對培養(yǎng)基因工程動物細胞分泌有用產(chǎn)物或病毒培養(yǎng)過程比較實用。四、連續(xù)操作：概念：在培養(yǎng)過程中一方面新鮮培養(yǎng)液不斷參加反響器內(nèi)，另一方面又將反響液連續(xù)不斷地取出，使反響條件處于一種恒定狀態(tài)。優(yōu)點：維持細胞一直處于優(yōu)化狀態(tài)下，促進細胞生長和產(chǎn)物的形成；對細胞生理和代謝規(guī)律的研究是一種重要的手段。五、灌注式操作培養(yǎng)：概念：細胞培養(yǎng)過程中一方面不斷參加新鮮培養(yǎng)基，另一方面又將反響液連續(xù)不斷地取出，但細胞留在反響器內(nèi)，使細胞處于一種不斷的營養(yǎng)狀態(tài)。優(yōu)點：可以把培養(yǎng)過程保持在穩(wěn)定的、廢代謝物低于抑制水平下的狀態(tài)。第四節(jié)動物細胞培養(yǎng)生物反響器生物反響器設(shè)計必須滿足的條件：生物因素；化學(xué)因素；傳質(zhì)因素；傳熱因素；平安因素；操作因素；反響器類型；操作方式；控制方式；攪拌方式歸結(jié)到一、生物反響器的種類：懸浮培養(yǎng)用反響器空氣提升式；攪拌槽；中空纖維管；陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀生物反響器貼壁培養(yǎng)用攪拌槽〔微載體系統(tǒng)〕中空纖維管陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀生物反響器包埋培養(yǎng)用流化床固定床氣升式細胞培養(yǎng)生物反響器：優(yōu)點：產(chǎn)物的湍流溫和而均勻，剪切力相當(dāng)小，對細胞損傷小，氧傳遞速率高；液體循環(huán)量大，細胞和營養(yǎng)分布均勻。一般產(chǎn)生泡沫不多。中空纖維管生物反響器：特點：纖維一般是橫放的；優(yōu)點：用途廣，可用于懸浮培養(yǎng)和貼壁依賴性細胞培養(yǎng)，細胞密度高，培養(yǎng)基和細胞分布均勻，能長期運轉(zhuǎn)通氣攪拌生物反響器無泡攪拌反響器動物細胞反響器的控制溶氧控制：針對動物培養(yǎng)的適宜攪拌，參加少量溶氧量大的不相溶溶濟，改變通入氣體的氮氧比；pH控制：采用通入CO2/NaOH緩沖液系統(tǒng)來控制，可防止局部的極端pH出現(xiàn)；溫度和攪拌轉(zhuǎn)速的控制比較簡單采用微載體培養(yǎng)貼壁依賴性細胞是當(dāng)前最有開展前途的一種培養(yǎng)模式微載體:指直徑在60~250μm、能夠適用于貼壁細胞生長的微珠。應(yīng)用微載體于細胞培養(yǎng)的優(yōu)點：外表積/體積〔S/V〕大；采用均勻懸浮培養(yǎng)，將懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點融合，簡化了環(huán)境因素的檢測和控制；培養(yǎng)基利用率高；收獲細胞過程不復(fù)雜；放大容易；勞動強度?。慌囵B(yǎng)系統(tǒng)占用空間小動物細胞貼壁的可能性取決于：細胞與微載體接觸的機率；細胞與微載體的相融性；微載體外表的物理化學(xué)物性，主要是與電荷極性的電荷密度，以及培養(yǎng)基或微載體上吸附的媒介有關(guān)；與細胞生長環(huán)境有關(guān)，適宜的生長環(huán)境有利于吸附。優(yōu)良的微載體應(yīng)具有的特性不含能毒害細胞的成分；微載體須與細胞有良好的相容性；優(yōu)良的微載體應(yīng)具有的特性密度應(yīng)略大于培養(yǎng)基；粒徑在40~120μm范圍，生理鹽水溶脹后增大到60~250μm，粒度分布均勻，徑差不大于20~25μm；優(yōu)良的微載體應(yīng)具有的特性良好的光學(xué)透明性；能在PBS中耐120~125C、20~30min高溫滅菌；優(yōu)良的微載體應(yīng)具有的特性應(yīng)是非剛性材料；不吸收培養(yǎng)中的營養(yǎng)成分；優(yōu)良的微載體應(yīng)具有的特性收獲細胞或細胞制品容易，不影響蛋白質(zhì)別離純化；價廉，能重復(fù)使用。微載體主要類型一、交聯(lián)葡萄糖為基質(zhì)的微載體：DEAE-交聯(lián)葡聚糖：Cytodex1微載體Cytodex2微載體：Cytodex3微載體：〔最優(yōu)良的微載體〕二、纖維素為基質(zhì)的微載體：三、蛋白質(zhì)為基質(zhì)的微載體-變性膠原微載體：四、高分子合成材料為基質(zhì)的微載體：聚苯乙烯微載體：帶負電荷，透明，適應(yīng)細胞型廣泛，不攝取培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，能制備高純度的生物制品，可重復(fù)使用。缺點是帶負電荷，細胞貼壁速度慢；材質(zhì)剛性易損傷細胞；需較高轉(zhuǎn)速才能懸浮。苯乙烯-二乙烯苯共聚微載體：聚甲基丙烯酸羥乙基酯微載體：聚乙烯吡啶微載體：聚瑞烯酰胺微載體：硅橡膠微載體：五、無機材料玻璃為基質(zhì)的微載體：中空玻璃微載體：是一種優(yōu)良的微載體，但相對密度太大，需經(jīng)過特殊工藝處理加工成適宜密度的中空玻璃微珠；明膠涂覆的多孔微載體：多孔