海洋淋巴囊腫病毒的分離純化

海洋淋巴囊腫病毒的分離純化

淋巴氏?。╰c）是魚類中常見的病毒，可由淡水魚類感染?，F(xiàn)已知該病在42科、125種魚上被發(fā)現(xiàn)?；疾◆~體表可見單個或聚集成團(tuán)的皮膚瘤狀或菜花狀贅生物,喪失商品價值。目前,各國學(xué)者對該病的流行情況、病理變化、病原特性、免疫診斷等方面都進(jìn)行了大量研究[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11]。Heppell等對淋巴囊腫病毒(LCDV)粒子的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了細(xì)致的描述,Garcia-Rosado等建立了LCDV的血清學(xué)診斷方法。但在病毒結(jié)構(gòu)蛋白及其抗原性的研究中,由于病毒來源、純化方法以及操作等方面的不同,結(jié)果存在一定的差異。Iwamoto等認(rèn)為,淋巴囊腫病毒株KU、YO、KA的結(jié)構(gòu)蛋白帶分別為26條、27條、29條且分子量為50kD的多肽為LCDV種特異性抗原蛋白;Garcia-Rosado等分析了歐洲不同宿主的LCDV后,結(jié)論是LCDV1和ATCCVR342病毒株結(jié)構(gòu)蛋白為21條,而LCDV3、LCDV4、LCDV7和LCDV11病毒株結(jié)構(gòu)蛋白為30條。最近,Alonso等報道,分子量為80kD、55kD、44kD、和40kD的多肽為該病毒具有抗原性的結(jié)構(gòu)蛋白。為此,本研究采用差速離心、蔗糖密度梯度離心的方法,擬從病魚囊腫組織獲得高純度的病毒粒子,進(jìn)而應(yīng)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)方法對純化的淋巴囊腫病毒進(jìn)行結(jié)構(gòu)蛋白成分分析,同時使用免疫印跡技術(shù)(Westernblotting)對病毒結(jié)構(gòu)蛋白的抗原性進(jìn)行探討,以期為進(jìn)一步研究確定淋巴囊腫病毒的主要衣殼蛋白提供基礎(chǔ)依據(jù)。1材料和方法1.1清水、棉球、可混養(yǎng)兔患病牙鲆采自山東威海牙鲆魚養(yǎng)殖場,病魚的體表可見有單個或聚集成團(tuán)的乳頭瘤狀贅生物,尤其在口唇部、背鰭及尾鰭較多,大小不一,形狀不規(guī)則,顏色有乳白色、灰白色及紅色。70%酒精棉球消毒患病部位后,用滅菌手術(shù)刀片切下囊腫,-80℃下分裝保存?zhèn)溆?。純系新西蘭大白兔由青島藥檢所購得。弗氏完全佐劑及不完全佐劑、堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗兔IgG、氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(BCIP)均購自Sigma公司。1.2方法1.2.1病毒粗提液tne解凍病料,剝除囊腫瘤組織表面的薄膜,加入適量石英砂和?10倍體積的TNE緩沖液(0.05mol/LTris-HCL;0.15mol/LNaCl;0.01mol/LEDTA;pH7.4),冰浴勻漿。勻漿液600g離心30min,取上清液,1800g再次離心30min;收集上清液,78000g離心2h;棄上清,向沉淀中添加適量TNE,此為病毒粗提液。將其輕置于由37%、40%、47%、52%、57%、62%(W/V)組成的蔗糖密度梯度離心管上層,78000g離心2h;用一次性注射器吸出各病毒帶,TNE重懸各病毒帶,78000g?離心1h以除去蔗糖。上述各步離心均于4℃?下進(jìn)行。然后將病毒用2%磷鎢酸負(fù)染,電鏡觀察、拍照。1.2.2基礎(chǔ)免疫法調(diào)整提純病毒的蛋白質(zhì)量濃度為?1mg/mL,免疫純系新西蘭大白兔,共免疫4次,具體免疫程序如下:基礎(chǔ)免疫,將病毒液與弗氏完全佐劑等比混勻,采用皮下6點(diǎn)免疫,每點(diǎn)注射0.2mL;2周后加強(qiáng)免疫,將病毒液與弗氏不完全佐劑等比混勻,方法與基礎(chǔ)免疫相同;1周后再加強(qiáng)免疫1次,采用耳緣靜脈直接注射方法,注射劑量為0.5mL,無佐劑;再1周后加強(qiáng)免疫第2次;第4次免疫后的第7天,從心臟一次性采血,室溫放置1h,轉(zhuǎn)入4℃過夜;次日,4℃下1500g離心15min分離抗血清。1.2.3u3000酸、堿、解的最佳條件采用辛酸-硫酸銨法從血清中純化IgG,具體過程如下:抗血清用4倍體積乙酸-乙酸鈉緩沖液(0.06mol/L,pH4.0)稀釋,NaOH調(diào)pH為4.5;室溫下滴加辛酸(25mL/L血清稀釋液),同時緩慢攪拌,然后4℃,10000g離心30min;收集上清,加入10倍體積0.1mol/L磷酸鹽(PBS)緩沖液,NaOH調(diào)pH為7.4;計算溶液總體積,按313g/L加入硫酸銨粉末,同時緩慢攪拌,防止出現(xiàn)沉淀,4℃靜置過夜;次日4℃,5000g離心20min,沉淀用少量透析液溶解(0.01mol/LNa2HPO4-KH2PO4;0.0151mol/LNaCl;pH7.2),4℃透析12h后,5000g離心20min,吸出上清,即為純化的抗體,-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.4提取上清液-丙酮法非特異性抗體的吸收參照Sambrook等的方法,取正常牙鲆魚的表皮組織、肌肉組織,加入TNE緩沖液,冰浴勻漿;勻漿液經(jīng)4℃,600g離心30min,1800g離心30min后,取上清液,4℃,78000g離心2h,棄去上清;沉淀用2mL/g預(yù)冷到4℃的0.1mol/LNaCl重懸,混勻;加入4倍體積的丙酮(-20℃),混勻后冰浴1h;4℃,78000g離心30min;棄上清液,加入與上一步相同體積的丙酮,重懸,混勻后冰浴10min,懸液4℃,78000g離心30min;棄上清液,沉淀轉(zhuǎn)移到保鮮膜上晾干;純化的抗體中加入干燥后的粉末至終濃度為1%(W/V),混勻懸液,冰浴15min,然后4℃,78000g離心30min,取上清,即為處理的抗體,-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.5酶處理gly及sds-ros染色電泳凝膠由濃度為?12%?分離膠和濃度為5%濃縮膠兩部分組成;純化的病毒液與電泳樣品緩沖液(0.5mol/LTris-HClpH6.8;1%SDS;1%疏基乙醇;10%甘油;0.02%溴酚藍(lán))等體積混合,加熱煮沸3min,冷卻后加樣;采用Tris甘氨酸(Gly)電泳緩沖液(0.025mol/LTris;0.25mol/LGly;0.1%SDS;pH8.3),4℃電泳,穩(wěn)流狀態(tài)下,濃縮膠30mA,分離膠60mA,至溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到分離膠底部邊緣時停止電泳;采用硝酸銀染色法進(jìn)行凝膠染色;經(jīng)全自動凝膠成像分析系統(tǒng)掃描和Gel-Pro軟件分析處理,計算出各結(jié)構(gòu)蛋白分子量及其相對百分含量。1.2.6加大免疫活性的牛血清酶染色電泳完畢后,取出凝膠移到電泳轉(zhuǎn)移槽中,加入轉(zhuǎn)移緩沖液(0.025mol/LTris;0.1925mol/LGly;20%甲醇;pH8.3),穩(wěn)流200mA,轉(zhuǎn)移5h;轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜(NC膜)用2%牛血清白蛋白37℃封閉1h,PBS浸洗3次,每次5min;加入第一抗體(處理后的抗血清),37℃孵育45min,PBS浸洗3次,每次5min,以正常兔血清代替第一抗體,作為陰性對照;加入第二抗體(堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗兔IgG,1∶30000),37℃孵育45min,PBS浸洗3次,每次5min;最后,加入新鮮配制的NBT/BCIP作用液,室溫顯色。2結(jié)果2.1病毒粒子觀察病毒粗提液在蔗糖梯度溶液中分成2條帶,位置分別在37%~40%和47%~52%蔗糖密度區(qū)域,均呈乳白色,吸出病毒帶,脫糖,負(fù)染,電鏡觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2條帶中均有病毒粒子存在,37%~40%病毒帶中病毒粒子極少,雜質(zhì)量較多;47%~52%病毒帶中病毒純度高,病毒粒子密度大,背景清晰,基本沒有雜質(zhì)(圖1a)。電鏡下可清楚地看到病毒粒子呈近似于圓形的多角形,直徑為210~250nm,病毒結(jié)構(gòu)完整,衣殼可分為2層,且層次清晰,衣殼與核髓之間并未緊密接觸,有一定空隙(圖1b)。2.2電泳圖譜分析調(diào)整病毒液的蛋白濃度,使其與等體積電泳樣品緩沖液混合后,電泳樣品中分別含有50μg、100μg、200μg、400μg的蛋白量。多次實(shí)驗后發(fā)現(xiàn)樣品中蛋白含量為100~200μg時,條帶清晰,且數(shù)目較多,故加樣量定為每孔200μg蛋白。提純的病毒經(jīng)SDS電泳,凝膠采用硝酸銀染色后,SDS圖譜顯示:清晰分辨的條帶共計有22條。其中9條蛋白條帶(VP6、VP7、VP8、VP9、VP10、VP11、VP12、VP13、VP14)密集的集中在電泳帶的中間部分;電泳圖譜中染色相對較深的蛋白條帶分別是VP6、VP7、VP8、VP9、VP12、VP13、VP14(圖2)。Gel-Pro軟件分析處理各結(jié)構(gòu)蛋白分子量結(jié)果表明(表1),LCDV結(jié)構(gòu)蛋白的分子量范圍為123~26kD。其中著色相對較深的7條蛋白條帶VP6、VP7、VP8、VP9、VP12、VP13、VP14的分子量集中在74~44kD區(qū)間,分別是73.662kD、67.352kD、65.292kD、63.362kD、54.438kD、47.674kD和44.759kD。由Gel-Pro軟件分析各蛋白條帶相對百分含量可知,在所有蛋白條帶中VP12蛋白帶相對百分含量最高,為32.27%;其次VP8,為13.13%。2.3結(jié)構(gòu)蛋白檢測應(yīng)用特異性抗血清進(jìn)行Westernblotting分析,結(jié)果顯示(圖3),VP1(123.55kD)、VP8(65.292kD)、VP12(54.438kD)3條結(jié)構(gòu)蛋白顯示出較強(qiáng)的特異性免疫反應(yīng),其中VP8蛋白帶反應(yīng)強(qiáng)度明顯高于其他2條蛋白帶,而VP1蛋白帶的反應(yīng)強(qiáng)度要比VP12蛋白帶弱些。3病毒結(jié)構(gòu)蛋白的制備及鑒定本研究通過剝離囊腫組織外膜、勻漿、差速離心和蔗糖密度梯度離心獲得了大量高純度的病毒。應(yīng)用SDS和Westernblotting方法分析了LCDV的結(jié)構(gòu)蛋白及其抗原性。結(jié)果顯示,LCDV病毒結(jié)構(gòu)蛋白由22條多肽組成,其中分子量為123.55kD、65.292kD和54.438kD的3條蛋白帶顯示出較強(qiáng)的抗原性。目前,提純LCDV病毒有以下3種方法:(1)采用濾膜過濾的方法;(2)膠原酶消化、水解組織中的膠原蛋白和糖蛋白,然后離心獲得病毒;(3)組織勻漿液通過差速離心、蔗糖密度梯度超速離心的方法分離獲得病毒。通過對各種方法的實(shí)驗比較,認(rèn)為前兩種方法純化效果不穩(wěn)定,病毒純度及數(shù)量皆不理想,不能滿足實(shí)驗需要。本實(shí)驗中采用差速離心、蔗糖密度梯度離心獲得LCDV病毒粒子,經(jīng)電鏡觀察證實(shí)病毒純度高,雜質(zhì)少,LCDV病毒粒子結(jié)構(gòu)完整且病毒囊膜損傷小。這為病毒精細(xì)結(jié)構(gòu)觀察、結(jié)構(gòu)蛋白分析提供了合格的材料。國內(nèi)外的學(xué)者對病毒的超微結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn),LCDV病毒衣殼外形呈五角形或六角形,病毒粒子直徑多在130~260nm。本實(shí)驗純化病毒的直徑為210~250nm,病毒粒子近似圓形,被衣殼覆蓋,外圍則是一層纖突結(jié)構(gòu),衣殼與核髓之間并未緊密連接,有一定空隙。對于這一差異,Heppell等認(rèn)為,LCDV的大小在不同地域、不同宿主的分離株中表現(xiàn)不同,從120nm到227nm,有時甚至達(dá)到380nm;病毒粒子被兩層蛋白鞘所覆蓋,其外層蛋白可被蛋白酶K消化,內(nèi)層可被堿性磷酸酶A2消化。因此推測其外層蛋白可能為相互緊密連接而形成表面蛋白結(jié)構(gòu)單位,而內(nèi)層蛋白則是脂蛋白膜。此外,正是因為囊膜與核髓的空隙,使得病毒的囊膜在受到外力后得不到核髓的有效支持,使囊膜具有一定的柔韌性。因此在勻漿、離心等處理過程中,病毒粒子受到外部機(jī)械壓力導(dǎo)致部分纖突的脫落,同時使病毒囊膜失去原來形狀,成為近似圓形的結(jié)構(gòu)。本研究在應(yīng)用免疫印跡技術(shù)鑒定病毒蛋白抗原性及其免疫特性時,使用的是多克隆抗體,其中存在針對宿主蛋白的抗體,與宿主蛋白發(fā)生交叉反應(yīng),影響結(jié)果的特異性。針對這一問題,本研究中參考了Sambrook等的方法來消除非特異性抗體,即用正常的牙鲆表皮組織、肌肉組織對抗血清中的非特異性抗體進(jìn)行吸收,排除了與宿主蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)的可能。本研究所得SDS圖譜顯示,LCDV結(jié)構(gòu)蛋白為22條,免疫印跡分析顯示其中僅有3條多肽具有良好的抗原性,類似情況也出現(xiàn)在Iwamoto和Alonso的研究結(jié)果中。分析其原因,一是由于結(jié)構(gòu)上的遮掩和空間阻礙,以及生化構(gòu)成的差異,有的病毒結(jié)構(gòu)蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性,有的免疫原性卻很弱或無;二是部分結(jié)構(gòu)蛋白屬于內(nèi)部抗原,其存在于病毒體內(nèi),不暴露于病毒顆粒表面,導(dǎo)致在制備兔抗LCDV抗血清時未能激發(fā)兔體產(chǎn)生抗體。在本實(shí)驗中,LCDV結(jié)構(gòu)蛋白的分子量為123~26kD。對于結(jié)構(gòu)蛋白的研究,不同研究者得出的結(jié)果也不盡相同。Iwamoto等分析了日本牙鲆淋巴囊腫病毒株KU、YO、KA后,發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)蛋白帶數(shù)分別為26條、27條、29條;加拿大的Robin等則認(rèn)為淋巴囊腫病毒LeetownNFH株結(jié)構(gòu)蛋白為21條,分子量為210~33.7kD;Garcia-Rosado等在分析了歐洲不同宿主的淋巴囊腫病毒后,結(jié)論是LCDV1和ATCCVR342病毒分離株結(jié)構(gòu)蛋白為21條,分子量在30.5~136kD,主要結(jié)構(gòu)蛋白分子量為44.5kD、55.6kD、79.7kD;LCDV3、LCDV4、LCDV7和LCDV11病毒分離株結(jié)構(gòu)蛋白為30條,分子量在29.7~187.6kD,主要結(jié)構(gòu)蛋白分子量為79.7kD、76.9kD、55.6kD、52.8kD、46kD、43.8kD、40.2kD、37.6kD。使用免疫印跡方法對LCDV結(jié)構(gòu)蛋白的抗原性研究中