線粒體基因組的研究與應(yīng)用

線粒體基因組的研究與應(yīng)用

骨干物的血漿（mtd，美國(guó)得多爾霍夫na）的結(jié)構(gòu)與細(xì)菌dna相似。呈雙鏈環(huán)形，可獨(dú)立編碼一些蛋白質(zhì)。這是核外遺傳物質(zhì)。在骨干物中發(fā)現(xiàn)了p1、dna聚合酶、鈉聚合酶、trn和核糖體等完整設(shè)備，表明中軸線具有獨(dú)立的遺傳系統(tǒng)。1mtcdna的基因序列mtDNA分子為環(huán)狀雙鏈DNA分子,外環(huán)為重鏈(H),內(nèi)環(huán)為輕鏈(L)?；蚺帕蟹浅＞o湊,除與mtDNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄有關(guān)的一小段區(qū)域外,無內(nèi)含子序列。每個(gè)線粒體含數(shù)個(gè)mtDNA,動(dòng)物組織mtDNA約16~20kb,大多數(shù)基因由H鏈轉(zhuǎn)錄,包括2個(gè)rRNA,14個(gè)tRNA和12個(gè)編碼多肽的mRNA,L鏈編碼另外8個(gè)tRNA和一條多肽鏈。mtDNA上的基因相互連接或僅間隔幾個(gè)核苷酸序列,一些多肽基因相互重疊,幾乎所有閱讀框都缺少非翻譯區(qū)域。很多基因沒有完整的終止密碼,而僅以T或TA結(jié)尾,mRNA的終止信號(hào)是在轉(zhuǎn)錄后加工時(shí)加上去的。2mtcd在動(dòng)物部分中的應(yīng)用mtDNA是一共價(jià)閉合的雙鏈環(huán)狀遺傳物質(zhì),具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于分離、拷貝數(shù)高、突變率高、進(jìn)化速度快、母性遺傳、無組織特異性等特點(diǎn)。其分子大小在14~42kb之間,絕大多數(shù)介于16~18kb,mtDNA已被廣泛應(yīng)用于發(fā)病機(jī)理、臨床診斷、遺傳變異、生物進(jìn)化等多方面的研究,并已在分類學(xué)、種系鑒定、遺傳學(xué)、進(jìn)化論等領(lǐng)域取得一定的成就。對(duì)大量不同動(dòng)物(包括人在內(nèi)的13種哺乳動(dòng)物、2種鳥類、2種兩棲類、6種魚類、4種爬行類、6種昆蟲類等)線粒體基因組全序列測(cè)定表明,動(dòng)物線粒體基因由大致為15~20kb的雙鏈環(huán)狀DNA分子組成。雙鏈3′端是一段具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的高保守性控制區(qū),控制線粒體DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。這一區(qū)域多是串聯(lián)重復(fù)序列,并在核DNA上有同源區(qū)。它與轉(zhuǎn)座、錯(cuò)配表達(dá)和線粒體基因異質(zhì)(heteroplasmy)相關(guān)。3數(shù)堿基—mtDNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)mtDNA結(jié)構(gòu)基因排列緊湊,幾乎沒有間隙序列和內(nèi)含子。在編碼脯氨酸和苯丙氨酸t(yī)RNA的基因之間,由少數(shù)堿基構(gòu)成一個(gè)突出結(jié)構(gòu)—D環(huán),它由與輕鏈互補(bǔ)的一小段DNA合成,并在這一區(qū)域取代了重鏈。D環(huán)是mtDNA與細(xì)胞核相聯(lián)絡(luò)的重要區(qū)域,也是mtDNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵部位。該區(qū)在人、鼠、豬的mtDNA中是相當(dāng)保守的,可形成一種發(fā)夾樣次級(jí)結(jié)構(gòu)。這一結(jié)構(gòu)可與線粒體引發(fā)酶、γ-DNA-多聚酶和線粒體拓外異物酶Ⅰ和Ⅱ等強(qiáng)烈結(jié)合。4柱層析分離法mtDNA制備方法是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn),目前已有較多報(bào)道,可分為:超速離心法、差速離心法、堿裂解法和柱層析法?，F(xiàn)將國(guó)內(nèi)外幾種較好的提取組織線粒體DNA的方法進(jìn)行比較。4.1mtcd分離細(xì)胞的制備戴紀(jì)剛等利用非離子型去污劑TrionX-100能溶解除核膜以外的所有細(xì)胞膜的特點(diǎn),建立了一種通過核質(zhì)分離技術(shù)制備mtDNA的方法。通過適當(dāng)?shù)碾x心,分離細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)來獲取mtDNA。其主要優(yōu)點(diǎn)是不需要分離細(xì)胞的總DNA,也不需要分離和純化細(xì)胞線粒體,而是從完整細(xì)胞直接分離mtDNA,方法簡(jiǎn)單快速,對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑要求不高,一般實(shí)驗(yàn)室均可應(yīng)用。由此可見,本方法制備mtDNA完全可以滿足常規(guī)的研究工作的需要。4.2體膜內(nèi)釋放染色體dna的pcr檢測(cè)朱克軍等以差速離心法分離線粒體,用堿性SDS法裂解線粒體膜,釋放線粒體DNA后用酚/氯仿抽提,TE或ddH2O溶解,然后將所得線粒體DNA進(jìn)行純度鑒定,并和其他方法制備的線粒體DNA經(jīng)PCR進(jìn)行擴(kuò)增,比較擴(kuò)增效果。4.3長(zhǎng)心時(shí)間的問題密度梯度離心法純化DNA是一種廣泛應(yīng)用的方法,其突出優(yōu)點(diǎn)是獲得的DNA純度高。但經(jīng)典的等密度梯度離心法的離心時(shí)間需要48~60h,實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng),儀器損耗大,對(duì)于電壓不穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)室,這個(gè)問題還直接危及儀器的安全,而且,DNA樣品長(zhǎng)時(shí)間暴露在高濃度的鹽(如CoCI)溶液中,容易受損傷。徐秀英等采用兩級(jí)梯度離心法純化DNA,離心時(shí)間只需5h,離心效果與48h經(jīng)典的密度梯度離心法無明顯差別,達(dá)到了快速純化的目的。4.4mtcd提取法堿裂解法,即SDS堿裂解法。其主要原理是通過使細(xì)胞壁破裂,染色體DNA和蛋白質(zhì)變性,相互纏繞成大型復(fù)合物,被十二烷基磺酸鈉包蓋,當(dāng)用鉀離子取代鈉離子時(shí),復(fù)合物會(huì)從溶液中有效沉淀下來,離心后即可從上清中回收質(zhì)粒DNA。(1)Tamura等通過改進(jìn)提取質(zhì)粒DNA的堿裂解法來提取線粒體DNA,優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便快捷,缺點(diǎn)是微量制備,如果要檢測(cè)大量個(gè)體,堿裂解法就會(huì)顯得非常麻煩和費(fèi)時(shí)。(2)劉麗紅等提出了一種直接以組織細(xì)胞制備mtDNA的技術(shù)方法,其優(yōu)點(diǎn):(1)對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑要求不高,一般實(shí)驗(yàn)室均可應(yīng)用。(2)該方法對(duì)標(biāo)本要求不高,-70℃冰凍保存或液氮保存即可。(3)mtDNA產(chǎn)率有極大提高,mtDNA樣品紫外分光光度檢測(cè)結(jié)果表明,每克組織可獲得約8μgmtDNA。(4)不需要分離細(xì)胞的總DNA,也不需要分離和純化細(xì)胞線粒體,而是從完整細(xì)胞直接分離mtDNA。因此,本方法簡(jiǎn)便快速,僅需2~3h,重復(fù)性好。(5)本方法尤其適用于標(biāo)本量少,經(jīng)費(fèi)不足時(shí)mtDNA模板的制備。(6)用本方法所得mtDNA樣品純度高。4.5動(dòng)物土地dna的提取和分子遺傳層析分離技術(shù)是一種物理的分離方法、它利用混合物中的各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差別(如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等),各組分以不同程度分布在兩相中,從而使各組分以不同速度移動(dòng)而達(dá)到分離。柱層析法是利用各分子形狀和大小不同,在層析柱中的流速不同而將各組分分離。此方法操作簡(jiǎn)單,效果好,重復(fù)性高,應(yīng)用廣泛。常用于線粒體分離。人類及絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞mtDNA都是閉環(huán)雙鏈DNA分子。動(dòng)物組織線粒體DNA的提取方法依其動(dòng)物本身組織的不同特點(diǎn),從方法學(xué)研究角度看,對(duì)新鮮動(dòng)物線粒體DNA提取分離方法常用的有酚氯仿萃取、乙醇沉淀、CsC1超速離心、酸性緩沖液、堿性緩沖液等。而對(duì)中藥材來說,DNA一般因加工、干燥、儲(chǔ)藏等過程部分降解同時(shí)易受到細(xì)胞中抑制PCR的蛋白質(zhì)、多糖類、多酚類成分的影響,在提取DNA時(shí)加入SDS等蛋白質(zhì)變性劑,在PCR時(shí)加入小牛血清蛋白(BSA)以滅活內(nèi)源性核糖酶,排除干擾PCR的色素物質(zhì)。分子遺傳學(xué)標(biāo)記技術(shù)為中藥材與易混品種的鑒別提供了一條新的途徑。線粒體DNA(mtDNA)作為遺傳信息的載體,是研究動(dòng)物起源進(jìn)化及對(duì)群體進(jìn)行遺傳分析的理想對(duì)象,線粒體細(xì)胞色素b(cytb)基因進(jìn)化速度適中,是分析種內(nèi)、種間遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系的適當(dāng)DNA片段,可應(yīng)用于生物的分類、系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性的研究。5合理篩選重點(diǎn)原料,強(qiáng)化道地藥材的保護(hù)與管理我國(guó)雖有豐富的中草藥資源,但由于缺乏系統(tǒng)的整理和歸類,致使中藥材同名異物、同物異名的現(xiàn)象屢有發(fā)生;中藥商品市場(chǎng)混亂,多有以假充真、以次充好的情況;隨著人們“回歸自然”迫切需求,中藥需求量的日益擴(kuò)大,資源矛盾日趨尖銳。而解決這些問題的關(guān)鍵是要有一套簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確有效的鑒別中藥材正品的技術(shù)與方法,以杜絕假、劣及混淆品的干擾;找出形成質(zhì)量?jī)?yōu)、產(chǎn)量高的道地藥材的機(jī)制,明確其生長(zhǎng)條件,以培育出更多優(yōu)質(zhì)的重要原材料;對(duì)于珍稀、瀕危動(dòng)植物,則需要大力保護(hù),積極尋找替代品,或根據(jù)習(xí)性進(jìn)行人工栽培和繁殖。目前,分子生物學(xué)技術(shù)已成為中藥DNA指紋圖譜鑒定的一項(xiàng)主要技術(shù),DNA分子標(biāo)記技術(shù)在中藥鑒定和質(zhì)量檢測(cè)方面均有其獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景,但仍需完善。而動(dòng)物mtDNA的研究已廣泛滲透到保護(hù)生物學(xué)、系統(tǒng)學(xué)、分類學(xué)等學(xué)科中。