拮抗果蔬腐霉的木霉菌株篩選及防效研究

拮抗果蔬腐霉的木霉菌株篩選及防效研究

腐菌病是植物病理學(xué)的重要病原體之一，導(dǎo)致各種作物的腐爛和突然倒下。尤其嚴(yán)重的是，這種疾病通常會導(dǎo)致大量的幼苗死亡并破壞棲息地。突然死亡稻草是煙草的一個重要疾病，由瓜果腐爛引起。播種期導(dǎo)致卷煙種子腐爛，不能發(fā)芽，苗期導(dǎo)致煙草叢生，旱期導(dǎo)致煙草根腐和莖腐。為了克服長期采用化學(xué)藥劑帶來的環(huán)境污染和病原菌產(chǎn)生的抗藥性,研制高效且對環(huán)境安全的生物殺菌劑成為新一代農(nóng)藥的發(fā)展方向.目前已發(fā)現(xiàn)許多微生物對植物病原真菌具有拮抗作用,木霉菌(Trichodermaspp.)就是一類具有開發(fā)應(yīng)用前景的生防菌.本研究以瓜果腐霉為靶標(biāo)菌,進(jìn)行拮抗木霉菌株的篩選.1材料和方法1.1綠色木霉t.viride菌株的分離與鑒定哈茨木霉(T.harzianum)菌株TGY040604,綠色木霉(T.viride)菌株TG050601、TG050609、TZ050610,均由福建農(nóng)林大學(xué)植保學(xué)院線蟲研究室分離、純化及保存.1.2煙低的分離純化采用誘捕分離法對腐霉菌進(jìn)行分離:截取長約10cm的煙杈,散布于煙畦上,待其上長滿白色菌絲體后,帶回實(shí)驗(yàn)室用玉米粉瓊脂培養(yǎng)基(CMA)進(jìn)行分離純化.參照文獻(xiàn),根據(jù)腐霉菌的形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀進(jìn)行種類鑒定.1.3培養(yǎng)腐霉菌以煙草、黃瓜、辣椒的幼苗作為靶標(biāo)作物,采用創(chuàng)傷接種法進(jìn)行致病性測定,方法如下:用滅菌的四號注射針頭將幼苗的根莖輕微刺傷,將在CMA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4d的腐霉菌培養(yǎng)物敷于傷口處,并用濕潤的脫脂棉保濕,置于室內(nèi)培養(yǎng);定期噴水保濕.以只接CMA培養(yǎng)基為對照.每一處理3株幼苗,3次重復(fù).并對發(fā)病植株進(jìn)行再分離,以明確供試菌株的致病性.1.4生育木菌的篩選1.4.1培養(yǎng)機(jī)構(gòu)設(shè)置將各木霉菌株在PSA平板上培養(yǎng)4d;用打孔器(直徑為6mm)打取病原菌菌餅,接于PSA平板(直徑為9mm)中央,置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng);采用十字交叉法測量菌落直徑,直至某一菌株長滿全皿為止.分別在木霉菌生長的第3、4、5天測定產(chǎn)孢能力,用100mL蒸餾水洗下孢子,于微型渦旋混合儀上振蕩3min,配制均勻一致的孢子懸浮液,吸取菌液于血球計數(shù)板上計數(shù).每處理重復(fù)3次.1.4.2抑菌率測定參照程麗云的方法,用打孔器(直徑為6mm)打取培養(yǎng)4d的木霉菌和腐霉菌的菌餅;在距離PSA平板中心2.5cm的相對2點(diǎn)上,分別接種木霉和腐霉菌;置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),測量兩接種點(diǎn)連線上腐霉菌的菌落半徑,計算抑菌率.以不接木霉菌、只接腐霉菌的為對照.每一處理重復(fù)3次.抑菌率/%=對照腐霉菌菌落半徑?處理腐霉菌菌落半徑對照腐霉菌菌落半徑×100/%=對照腐霉菌菌落半徑-處理腐霉菌菌落半徑對照腐霉菌菌落半徑×100當(dāng)兩菌落接觸后,觀察記載木霉菌對病原菌的抑制、包圍、侵入情形,及其占領(lǐng)腐霉菌生長空間的過程,挑取交接部位菌絲在顯微鏡下觀察木霉菌與腐霉菌的相互作用.1.4.3接種腐霉菌餅、調(diào)濕餅的制備參照文獻(xiàn)的方法,在培養(yǎng)皿的底和蓋上倒入等量(15mL)的PSA培養(yǎng)基,制成平板;在蓋上接種已活化4d的木霉菌餅(直徑為6mm),在底上接種腐霉菌餅(直徑為6mm);將培養(yǎng)皿倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24、48、72h后分別測量腐霉菌的菌落直徑,計算抑菌率.以皿底只接腐霉菌、蓋上不接木霉的為對照.每處理重復(fù)3次.抑菌率/%=對照腐霉菌菌落直徑?處理腐霉菌菌落直徑對照腐霉菌菌落直徑×100/%=對照腐霉菌菌落直徑-處理腐霉菌菌落直徑對照腐霉菌菌落直徑×1001.4.4培養(yǎng)培養(yǎng)基的制備參照文獻(xiàn)的方法,將木霉菌接于PSA斜面上培養(yǎng)6-7d,待其大量產(chǎn)孢后用滅菌水洗下孢子,采用血球計數(shù)法計數(shù),配成106個·mL-1的孢子懸浮液;取1mL上述孢子懸浮液加入裝有100mLPS培養(yǎng)液的250mL三角瓶中,在28℃、180r·min-1的搖床中培養(yǎng)5d;過濾去除菌絲體,濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾濃縮至原體積的1/4,濃縮液用滅菌的濾膜(直徑為0.22μm)過濾除菌;將無菌濾液與PSA培養(yǎng)基按1∶9的比例混勻后倒入平板,每皿15mL;在平板中央接種培養(yǎng)4d的腐霉菌餅(直徑為6mm),置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),測量菌落直徑,計算抑菌率.以不加木霉菌發(fā)酵濾液為對照.1.5煙苗的地面處理腐霉菌孢子囊懸浮液的制備:將腐霉菌接于燕麥培養(yǎng)基上,置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待其產(chǎn)生孢子囊后用滅菌水洗下,配成104個·mL-1的孢子囊懸浮液.取生長40d左右、生長較為一致的煙苗,栽植于花盆中(18cm×24cm),每盆10株.設(shè)以下3個處理.處理1:50mL107個·mL-1的木霉菌(TGY040604)菌液與50mL上述孢子囊懸浮液的混合液.處理2:50mL1mg·mL-1的58%甲霜靈錳鋅WP藥液與50mL上述孢子囊懸浮液的混合液.對照:50mL清水與50mL上述孢子囊懸浮液的混合液.用上述混合液澆灌煙苗根際土壤(每盆100mL),7-10d后觀察各處理煙苗的發(fā)病情況,計算發(fā)病率及防治效果.每個處理3次重復(fù).2結(jié)果與分析2.1頂生或間生在玉米粉瓊脂培養(yǎng)基(CMA)上腐霉菌菌落呈棉絮狀,氣生菌絲發(fā)達(dá)、分支、無隔,直徑5.3-7.8(6.6)μm,可在皿壁和蓋上生長;孢子囊是由膨大不規(guī)則的分枝組成的復(fù)合體,頂生或間生,大小為[31.6-88.4(63.4)]μm×[12.7-14.6(13.7)]μm;泡囊球形,頂生或間生,大小為14.6-18.5(17.1)μm;藏卵器球形,外壁平滑,多頂生,偶有間生,雄器棍棒狀或袋狀,與藏卵器同絲生或異絲生;卵孢子球形平滑,未滿器,直徑21.5-30.0(25.8)μm,壁厚1.6-3.1(2.4)μm(圖1).鑒定該腐霉菌為瓜果腐霉(P.aphanidermatum).2.2病害與種苗生長的關(guān)系接種2-3d后,各接菌幼苗根莖部出現(xiàn)開水燙狀軟腐,葉片萎蔫下垂,下部葉片變黃,隨著病害的發(fā)展,幼苗倒伏;而對照幼苗生長正常.說明該腐霉菌對茄科的煙草、辣椒和葫蘆科的黃瓜具有致病性,引起幼苗猝倒(圖2).從各接種作物的病株上可重新分離到腐霉菌,對其形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀進(jìn)行觀察,鑒定其為瓜果腐霉(與接種病原菌一致).2.3生育木菌的篩選2.3.1木霉菌tg0606060606060606060606060606060606060606060606060606粗的產(chǎn)孢量在4個供試的木霉菌株中TG040604生長最快,培養(yǎng)24和48h時,其生長速度大于其他3個菌株.4個供試的木霉菌接種3d后均長滿整個培養(yǎng)皿.在培養(yǎng)72h后,菌株TZ050610的產(chǎn)孢量明顯大于其他菌株.隨著培養(yǎng)時間的延長,各菌株產(chǎn)孢量不斷增加,培養(yǎng)120h后,菌株TG040604的產(chǎn)孢量與菌株TZ050610的相當(dāng),分別為菌株TG050601和TGY050609的1.2倍和1.5倍(表1).2.3.2木霉菌絲感染原理4個木霉菌對瓜果腐霉菌均有不同程度的抑制作用,菌株TG040604的抑制效果尤為顯著(表2),這可能是由于其生長快,迅速占領(lǐng)營養(yǎng)空間,并產(chǎn)生具有抑菌活性的代謝物質(zhì),從而阻止了病原菌的進(jìn)一步擴(kuò)展.培養(yǎng)40h后,木霉菌絲與瓜果腐霉菌絲交接,挑取交接處的菌絲在顯微鏡下觀察,結(jié)果表明,木霉菌絲纏繞于腐霉菌絲上,它產(chǎn)生的吸器或類似吸器的結(jié)構(gòu)穿入腐霉菌絲,腐霉菌絲出現(xiàn)原生質(zhì)濃縮、菌絲斷裂和消解等現(xiàn)象.隨著培養(yǎng)時間的延長,對峙培養(yǎng)中的病原菌生長受抑制,木霉菌持續(xù)生長,侵入腐霉菌落中,腐霉菌落萎縮,并產(chǎn)生1條明顯的消解帶,最終整個菌落被木霉菌吞噬,并形成大量的綠色孢子(圖3).2.3.3揮發(fā)性物質(zhì)抑制高效試驗(yàn)結(jié)果表明,4個木霉菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝物對瓜果腐霉菌均有不同程度的抑制效果(表2).接種2d后,菌株TG050609產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對P.aphanidermatum生長的抑制效果最大,TG050601和TZ050610次之,TGY040604的抑制效果最差.與對照相比,各處理腐霉菌菌落生長明顯受抑制,菌絲生長稀疏;挑取菌絲鏡檢可觀察到菌絲扭曲畸形、原生質(zhì)濃縮、菌絲中央縊縮斷裂、消解等現(xiàn)象(圖4).2.3.4菌株的篩選結(jié)果結(jié)果表明,4個木霉菌株發(fā)酵液對瓜果腐霉的抑制效果從大到小排列如下:TGY040604>TG050609>TG050601>TZ050610(表2).與對照相比,腐霉菌在含木霉菌發(fā)酵液培養(yǎng)基上生長明顯受到抑制,菌絲稀疏.挑取菌絲鏡檢結(jié)果出現(xiàn)菌絲扭曲畸形、中央縊縮斷裂、菌絲消解等現(xiàn)象(圖5).由上述結(jié)果可見,菌株TG040604的生長速率最快,產(chǎn)孢量與TZ050610相當(dāng),優(yōu)于其他2個菌株.在對峙培養(yǎng)中,菌株TG040604對瓜果腐霉的抑制效果顯著優(yōu)于其他3個菌株,其代謝物質(zhì)對瓜果腐霉也具有一定的抑制效果.綜合上述各項(xiàng)指標(biāo),篩選出哈茨木霉(T.harzianum)菌株TGY040604作為拮抗瓜果腐霉的優(yōu)良生防菌株.2.4甲霜靈錳鋅對煙苗的防治效果盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示,用木霉菌TGY040604防治煙草猝倒病,煙苗死亡率為27.7%,相對防效為65.2%;用58%甲霜靈錳鋅WP防治煙草猝倒病,煙苗死亡率為30.0%,相對防效為61.9%,略低于木霉菌株TGY040604,兩者差異不顯著.對各處理的煙苗生長情況進(jìn)行觀察,經(jīng)木霉菌處理的煙苗的長勢優(yōu)于甲霜靈錳鋅處理,主要表現(xiàn)為葉片數(shù)增多,葉片增大,株高增加.由此表明該木霉菌對煙苗具有一定的促生作用.3田間防治木霉菌活性.主要考慮了生防木霉菌t改性復(fù)合從煙田土壤中分離到的1株腐霉,經(jīng)鑒定為瓜果腐霉.致病性測定結(jié)果表明其對煙草具有致病性;且生長繁殖速度快,是煙草苗期的重要病原菌,引發(fā)煙草猝倒病.煙田土壤帶菌是煙草猝倒病的重要侵染源.因此,育苗前開展土壤病原菌檢測,采用無病土育苗是防治該病害的重要措施.通過平板對峙培養(yǎng)以及對木霉菌次生