連錢草提取物抗炎作用機(jī)制研究

連錢草提取物抗炎作用機(jī)制研究

連草是嘴唇科植物的活血丹glecodapr（nakai）kuber。具有利濕通淋、清熱解毒、散淤消腫的功能。在民間被廣泛應(yīng)用于治療尿路感染、感冒、跌打損傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腹瀉等。筆者在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)連錢草的抗炎作用作了初步研究,重點(diǎn)從炎癥遞質(zhì)方面對(duì)其進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。1藥物、試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1.1材料連錢草(自行采集于武漢大學(xué)珞珈山,經(jīng)湖北中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室陳家春教授鑒定)。連錢草水提物的制備:取適量連錢草干品,加純化水浸泡30min后,加熱煮沸,開始用強(qiáng)火,沸騰后改用文火煮沸30min,攪拌,趁熱過濾,藥渣再加純化水同法煮沸30min后過濾,合并濾液,水浴濃縮至100%(含生藥1g·mL-1)備用。連錢草醇提物的制備:取連錢草干品適量,加95%乙醇于圓底燒瓶中,浸泡6h后水浴加熱回流1h,趁熱過濾,藥渣再用75%乙醇加熱回流1h,過濾,合并濾液,減壓回收乙醇濃縮至100%(含生藥1g·mL-1)備用。阿司匹林(湖北制藥廠生產(chǎn),臨用前用1%CMC-Na配成混懸液備用);蛋清(市場(chǎng)上購買的新鮮雞蛋,取其蛋清);伊文思藍(lán)(上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站經(jīng)銷,行知校辦廠分裝);角叉菜膠(購自Sigma公司);二甲苯、乙酸、乙醇、甲醇、正丁醇、正庚烷、鄰苯二甲醛(OPT)、NaIO4、氯化鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純或進(jìn)口分裝。1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種雌性未孕小鼠,體重18~22g;昆明種雄性小鼠,體重18~22g。所有動(dòng)物均由湖北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.4儀器Bs200s電子天平(Sartorins公司),723紫外分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司),LuminnescencespectrometerLS55熒光儀(PerkinElmerinstruments),TL04A離心機(jī)(北京大恒建?？瀑Q(mào)公司)。2方法和結(jié)果2.1醇提物對(duì)小鼠耳水腫的影響取雄性小鼠32只,體重18~22g。按體重隨機(jī)分為4組各8只,即0.9%氯化鈉溶液組、阿司匹林組、連錢草醇提物組和連錢草水提物組。每天灌胃給藥1次,連續(xù)3d,末次給藥后45min,以二甲苯0.02mL均勻涂于小鼠左耳廓兩側(cè)致炎,致炎1h后處死小鼠,沿耳廓基線剪下左右兩耳片分別稱重,以兩耳重量差作為腫脹度。結(jié)果見表1。連錢草水提物與醇提物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹有顯著的抑制效果。與0.9%氯化鈉溶液組比較,*1P<0.052.2小鼠造林后的毛細(xì)管透氣性取雄性小鼠24只,體重18~22g。按體重隨機(jī)分為4組各6只,即0.9%氯化鈉溶液組、阿司匹林組、連錢草醇提物組和連錢草水提物組。每天灌胃給藥1次,連續(xù)3d,末次給藥1h后各鼠尾靜脈注射0.5%伊文思藍(lán)0.1mL·(10g)-1,隨后腹腔注射0.6%醋酸,每只0.2mL。20min后處死小鼠,各鼠用5mL0.9%氯化鈉溶液分次沖洗腹腔,收集腹腔洗出液,用722型分光光度計(jì)在590nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。結(jié)果見表2。連錢草水提物與醇提物對(duì)醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加有顯著的抑制效果。與0.9%氯化鈉溶液組比較,*1P<0.052.3角叉菜膠對(duì)小鼠水腫足中pge2含量的影響取雄性小鼠40只,體重18~22g。按體重隨機(jī)分為4組,即0.9%氯化鈉溶液組、阿司匹林組、連錢草醇提物組和連錢草水提物組。各組小鼠每天灌胃給藥1次,連續(xù)3d,末次給藥后45min,每只小鼠右后足墊皮下注射角叉菜膠0.9%氯化鈉溶液0.1mL,40min后從小鼠齊踝關(guān)節(jié)處剪下左后足,分別稱重,劃破皮膚后浸于裝有2.5mL0.9%氯化鈉溶液的試管中,不時(shí)振搖,2h后取出,將浸泡液3000r·min-1離心15min,取上清液0.3mL置于試管內(nèi),加入0.5mol·L-1氫氧化鉀(KOH)甲醇溶液1.0mL,50℃水浴20min異構(gòu)化,加甲醇2.5mL,在278nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色,測(cè)定吸光度(A)值,用A值表示PGE2含量。結(jié)果見表3。連錢草醇提取物對(duì)角叉菜膠致小鼠腫脹足組織中炎癥遞質(zhì)PGE2的釋放沒有抑制作用,而水提物組PGE2含量明顯升高。與0.9%氯化鈉溶液組比較,*1P<0.012.4醇提物對(duì)炎性足中組織胺含量的影響取雄性小鼠27只,體重18~22g。按體重隨機(jī)分為3組,即0.9%氯化鈉溶液組、連錢草醇提物組和連錢草水提物組。均每天灌胃給藥1次,連續(xù)3d,末次給藥后45min,每只小鼠右后足墊皮下注射10%新鮮蛋清0.9%氯化鈉溶液0.1mL,同時(shí)0.9%氯化鈉溶液[灌胃,4mL·(100g)-1]行水負(fù)荷。致炎后40min沿踝關(guān)節(jié)處剪下致炎足,稱重,劃破皮膚組織后浸泡于酸化正丁醇0.2mL中2.5h,再用超聲處理20min,去掉致炎足,浸液離心。取上清液1.5mL,加入正庚烷3mL和0.1mol·L-1鹽酸1.2mL,振搖5min,離心(3000r·min-1,5min),離心后取水相5mL,加入3mL三蒸水稀釋,再加0.4mol·L-1NaOH堿化,混勻,并迅速加入0.1%OPT溶液0.1mL,立即混勻,并在21~22℃反應(yīng)10min,然后加入0.5mol·L-1鹽酸1mL酸化以終止縮合反應(yīng),在激發(fā)光波長(zhǎng)360nm,發(fā)射光波長(zhǎng)440nm下測(cè)定熒光強(qiáng)度,用熒光強(qiáng)度(int)表示炎性足組織中組織胺的相對(duì)含量(熒光法),比較給藥組和空白對(duì)照組組胺相對(duì)含量的差異。結(jié)果見表4。連錢草水提物對(duì)蛋清致小鼠腫脹足組織中炎癥遞質(zhì)組胺的釋放有明顯抑制作用,但醇提物組織胺含量明顯升高。與0.9%氯化鈉溶液組比較,*1P<0.052.5連錢草水提物int-取雄性小鼠27只,體重18~22g。按體重隨機(jī)分為3組,即0.9%氯化鈉溶液組、連錢草醇提物組和連錢草水提物組各9只。每天灌胃給藥1次,連續(xù)3d,末次給藥后45min,每只小鼠右后足墊皮下注射10%新鮮蛋清0.9%氯化鈉溶液0.1mL,同時(shí)0.9%氯化鈉溶液[灌胃,4mL·(100g)-1]行水負(fù)荷。致炎后40min沿踝關(guān)節(jié)處剪下致炎足,稱重,劃破皮膚組織后浸泡于酸化正丁醇0.2mL中2.5h,再用超聲處理20min,去掉致炎足,浸液離心。取上清液1.5mL,加入正庚烷3mL和0.1mol·L-1鹽酸1.2mL,振搖5min,離心(3000r·min-1,5min),離心后取水相5mL,加入0.2mL5%半胱氨酸,再加0.004%的OPT鹽酸溶液6mL,混勻,并加入0.20mL0.02%的NaIO4溶液,沸水浴10min,在激發(fā)光波長(zhǎng)365nm,發(fā)射光波長(zhǎng)480nm下測(cè)定熒光強(qiáng)度,用熒光強(qiáng)度(int)表示炎性足組織中5-羥色胺的相對(duì)含量(熒光法),比較給藥組和空白對(duì)照組5-羥色胺相對(duì)含量的差異.結(jié)果見表5。連錢草水提物對(duì)蛋清致小鼠腫脹足組織中炎癥遞質(zhì)5-羥色胺的釋放有明顯抑制作用(P<0.05),醇提物組有抑制5-羥色胺釋放的作用,但作用較水提物小。與0.9%氯化鈉溶液組比較,*1P<0.053炎癥遞質(zhì)pge2、組織胺和5-羥色胺含量的測(cè)定炎癥是機(jī)體活組織對(duì)各種損傷因子所發(fā)生的以防御為主的反應(yīng),連錢草提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹和小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加等炎癥模型具有較強(qiáng)的抑制作用,表明連錢草提取物具有較強(qiáng)的抗炎作用。而PGE2、組織胺和5-羥色胺均為參與炎癥反應(yīng)的主要炎癥遞質(zhì),在炎癥反應(yīng)中起重要作用。筆者使用