木霉分生孢子可濕性乳化劑的篩選及生物活性研究

木霉分生孢子可濕性乳化劑的篩選及生物活性研究

木霉菌屬于半知菌絲菌屬的草質(zhì)干熱菌叢，廣泛存在于土壤、植物殘體、植物根、植物葉片和種子、莖表面和動物糞便中。該類真菌因能產(chǎn)生拮抗物質(zhì)和寄生有害植物病原菌,而被人們廣泛研究。目前普遍認為木霉真菌抑制病原菌的作用機制主要包括競爭、寄生、抗生、溶菌和誘導抗性,并具有促進植物生長等輔助機制。近年來,國內(nèi)外已有許多公司將木霉開發(fā)成了產(chǎn)品,其中哈茨木霉和綠色木霉應用最為廣泛。四川農(nóng)業(yè)大學植保系無公害農(nóng)藥研究實驗室從四川地區(qū)篩選得到的綠色木霉L24菌株,對多種植物病原菌有一定的抑制作用并可明顯促進植物生長。為了更好地開發(fā)利用該菌株,本試驗通過正交設計篩選L24菌株分生孢子可濕性粉劑(WP)的最優(yōu)配方,并研究該制劑對植物生長的影響及防治玉米紋枯病和玉米褐斑病效果。1材料和方法1.1材料表面1.1.1試驗中的蘑菇綠色木霉L24菌株由四川農(nóng)業(yè)大學無公害農(nóng)藥研究實驗室提供。1.1.2試驗品種白菜,品種為“黃金”和“金鳳”,市購。玉米,品種為“長玉13”,市購。1.2方法1.2.1接種室培養(yǎng)采用淺層發(fā)酵,發(fā)酵底物為麥麩,將麥麩分裝于塑料袋中,于121℃下滅菌20~30min后待用。對接種室用甲醛和高錳酸鉀混合液[V(甲醛)∶V(高錳酸鉀)=1∶2]密閉熏蒸滅菌24h。然后將麥麩(已滅菌)和木霉液體發(fā)酵母液充分混合,均勻鋪展在簸箕表面(厚度約1cm),恒溫(27℃)保濕(RH≥85%)培養(yǎng)5d。1.2.2木霉分生孢子計數(shù)板法風干淺層發(fā)酵產(chǎn)物,粉碎后過200目篩,收集木霉分生孢子粉。含孢量測定采用血球計數(shù)板計數(shù)法:將所收集的木霉分生孢子粉稀釋50倍,配成孢子懸浮液。按對角線方位,取左上、左下、右上、右下和中央5個格的孢子計數(shù)。重復3次,取其平均值,用下式計算含孢量。每毫升分生孢子數(shù)量=每小格孢子數(shù)×4000×1000×稀釋倍數(shù)1.2.3分生孢子萌發(fā)率測定采用孢子萌發(fā)法。稱取一定量的載體和各種潤濕劑、分散劑,將載體、潤濕劑和分散劑配制成50、100、200、400和800μg/mL的質(zhì)量濃度,將孢子粉加入到所配制的溶液中,在顯微鏡下調(diào)整到每視野分生孢子數(shù)50~100。然后將混合懸浮液滴于凹玻片上,30℃恒溫保濕培養(yǎng)24h,測定孢子萌發(fā)率。通過測定萌發(fā)率來判斷各載體、潤濕劑和分散劑對木霉L24菌株分生孢子萌發(fā)的影響。1.2.4可濕性粉劑潤濕分散劑種類的篩選潤濕劑和分散劑種類的選擇方法:木霉孢子粉的質(zhì)量分數(shù)為30%,潤濕分散劑質(zhì)量分數(shù)各為10%,其余以硅藻土補足,分別配制成可濕性粉劑樣品,測定樣品的潤濕時間和懸浮率并進行比較。潤濕效果好、懸浮率高的樣品所選擇的潤濕分散劑即為較好的潤濕分散劑種類。潤濕劑和分散劑的最優(yōu)配比篩選:以1g為基數(shù),木霉孢子粉質(zhì)量分數(shù)為30%,按篩選的助劑種類和比例進行正交設計,確定木霉分生孢子的最佳配方。1.2.5潤濕時間、懸浮率、水分L24菌株分生孢子可濕性粉劑品質(zhì)檢測制劑樣品品質(zhì)檢測方法:潤濕時間按GB/T5451-2001測定;懸浮率按GB/T12853-2006測定;水分按GB/T1600-2001,共沸法測定;pH按GB/T19600-1993測定。1.2.6木霉可濕性粉劑對小鼠的影響選用2個白菜品種,共設置8個處理,每處理3次重復,小區(qū)面積為20m2,隨機區(qū)組排列各小區(qū)。在小白菜種植7d后,開始施用木霉可濕性粉劑,每7d施用1次,共施藥3次,施藥處理為木霉可濕性粉劑400、800、1600倍稀釋液,以清水處理為對照。在第3次施藥后7d測量和記錄株高、主根長、葉面積和鮮質(zhì)量。1.2.7防治效果評價共設置10個處理,3次重復,于玉米拔節(jié)后期玉米紋枯病和褐斑病未發(fā)病時第1次施藥,后每隔7d噴藥1次,使用木霉可濕性粉劑300、500、800倍稀釋液連續(xù)噴施3次,在第3次施藥后7d調(diào)查玉米紋枯病(參照GB/T17980.20-2000)和玉米褐斑病(參照GB/T17980.86-2004)發(fā)病情況,計算防治效果。2結(jié)果與分析2.1結(jié)果表明，木霉菌l24菌株的生殖器素含量為采用血球計數(shù)板計數(shù)法測得每克木霉孢子粉中分生孢子數(shù)量為4.03×1011。2.2量濃度對量濃度的影響由表1可以看出,硅藻土對木霉分生孢子的萌發(fā)影響不明顯,各潤濕劑和分散劑對木霉L24菌株分生孢子的萌發(fā)隨質(zhì)量濃度增加影響明顯。當萘磺酸鈉甲醛縮合物、木質(zhì)素磺酸鈉、拉開粉和十二烷基硫酸鈉大于50μg/mL時,孢子萌發(fā)率顯著降低,因此在木霉L24菌株可濕性粉劑助劑篩選時,為避免助劑對木霉L24菌株孢子萌發(fā)的影響,萘磺酸鈉甲醛縮合物、十二烷基苯磺酸鈉、木質(zhì)素磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉和拉開粉的質(zhì)量濃度不高于50μg/mL。2.3濕劑和分散劑的最佳配合選擇2.3.1酸酯溶液和木質(zhì)素磺酸鈉配伍由表2可見,不同的潤濕劑和分散劑與載體和孢子粉混合后,其潤濕時間和懸浮率差異較大。其中,當萘磺酸鈉甲醛縮合物和十二烷基硫酸鈉配伍及拉開粉和木質(zhì)素磺酸鈉配伍,其懸浮率較高(分別為69.44%和69.13%),潤濕時間較短(分別為75和98s),與其他處理相比,差異顯著。因此選取萘磺酸鈉甲醛縮合物和木質(zhì)素磺酸鈉為正交設計的分散劑,選擇十二烷基硫酸鈉和拉開粉為正交設計的潤濕劑。2.3.2正交試驗結(jié)果根據(jù)潤濕劑和分散劑選擇結(jié)果,選擇潤濕時間較短、懸浮率較高者作為正交因素,并選擇不同因素助劑按常用質(zhì)量分數(shù)用量設計3個水平,結(jié)果見表3。通過正交設計,所得試驗結(jié)果見表4,對表4數(shù)據(jù)進行方差分析結(jié)果見表5。由表4和表5可知,木霉L24菌株分生孢子可濕性粉劑的較優(yōu)配方為A3B3C1D1,即木霉分生孢子粉30%、萘磺酸鈉甲醛縮合物7%、十二烷基硫酸鈉3%、木質(zhì)素磺酸鈉5%、拉開粉2%、硅藻土加齊至100%。經(jīng)方差分析,影響因素依次為A>B>C>D。其中萘磺酸鈉甲醛縮合物和十二烷基硫酸鈉對制劑懸浮率有顯著影響。2.4不同質(zhì)量懸浮率對芽孢桿菌s木霉分生孢子可濕性粉劑的潤濕時間為58s,質(zhì)量懸浮率為68.94%,孢子懸浮率達到83.44%,pH為7.7,含水量0.98%,98.23%通過200目篩。2.5不同處理對西瓜紅白茶苷及其他“黃金”蔬菜鮮質(zhì)量指標的影響從表6可以看出,木霉制劑3種處理都對2種白菜有明顯的促生作用。且增長程度與木霉制劑用量有明顯關系,在木霉制劑稀釋800倍處理下,2種白菜的株高、根長、葉面積、鮮質(zhì)量指標均明顯高于對照和其他處理,除“黃金”品種鮮質(zhì)量指標與木霉制劑稀釋400倍處理差異不顯著外,其他指標差異均達到顯著水平。表明木霉制劑稀釋800倍是促進植物生長的最佳處理。2.6木霉制劑對玉米紋枯病的防治效果由表7可知,木霉制劑不同處理對玉米紋枯病和玉米褐斑病均有一定的防治效果,其中木霉制劑稀釋300倍液對玉米紋枯病的防治效果為52.88%,低于對照井岡霉素稀釋800倍防治效果,差異顯著;木霉制劑稀釋300倍液對玉米褐斑病的防治效果為56.28%,與井岡霉素稀釋800倍防治效果相當,差異不顯著。3木霉二氮制劑對玉米生長和生理指標的影響以微生物活體作為農(nóng)藥開發(fā)利用是生物農(nóng)藥研究的熱點之一,其大量開發(fā)利用可有效降低和消除目前化學農(nóng)藥普遍存在的殘留、毒性和抗藥性等諸多負面作用。在微生物活體農(nóng)藥開發(fā)研究中,其配套制劑研究是微生物活體農(nóng)藥實際開發(fā)和推廣應用的重要基礎。但微生物活體制劑加工與化學制劑相比,相對復雜,要考慮到菌株活體孢子的大量制備,潤濕劑和分散劑對孢子萌發(fā)的影響及特殊的加工方法等因素。綠色木霉L24菌株具有廣泛的殺菌生物活性,實際推廣應用價值較大,因此其制劑加工研究尤為重要。但目前木霉菌株制劑的加工研究相對較少,僅見張敏等的報道。本研究在測試供試潤濕劑和分散劑對分生孢子影響的前提下,通過正交設計,對木霉L24菌株的分生孢子進行制劑加工,首次制備30%木霉L24菌株分生孢子可濕性粉劑。該制劑各項指標均達到國家可濕性粉劑檢測標準,為進一步推廣應用該菌株奠定了基礎。拮抗木霉菌可有效防治多種作物常見病害,但利用綠色木霉防治玉米紋枯病和玉米褐斑病相關研究較少。本試驗結(jié)果表明,綠色木霉L24菌株制劑對玉米紋枯病和玉米褐斑病有較好的防治效果。玉米紋枯病和玉米褐斑病是兩