腫瘤的分子診斷 完整版

腫瘤的分子診斷2第一節(jié)腫瘤的分子診斷一、腫瘤的發(fā)病機(jī)制(還不清楚)多階段：增生→非典型增生→原位癌→早期浸潤癌→中晚期癌多因素：多種致癌因素,環(huán)境因素和遺傳因素相互作用多基因：原癌基因激活、抑癌基因失活、凋亡調(diào)控基因的改變、DNA修復(fù)基因失活3２.基因變異-腫瘤發(fā)生的內(nèi)因

腫瘤發(fā)生機(jī)理癌基因的激活

抑癌基因的失活6（１）癌基因oncogenes

細(xì)胞基因組中具有能夠使正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的基因Cellularoncogenec-oncViraloncogenev-oncProto-oncogene,activatedbymutationtoc-onc癌基因在正常細(xì)胞的基因組中存在不表達(dá)狀態(tài)表達(dá)水平不足以引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化7１）生長因子類Growthfactor

此類癌基因蛋白質(zhì)產(chǎn)物與某些生長因子結(jié)構(gòu)相似，通過自分泌，刺激細(xì)胞過度增殖而導(dǎo)致癌．包括SIS(PDGF)，int-2(FGF)，F(xiàn)GF-3等8２）酪氨酸激酶類跨膜蛋白erbB1,erbB2／HER-2,EGFR膜結(jié)合蛋白ablsrc-1Growthfactorreceptor

e.g.tyrosinekinasereceptors10３）GTP結(jié)合蛋白膜結(jié)合蛋白H-ras,K-ras,N-rasRas能水解GTP為GDPRas氨基酸12，13，61為點突變降低水解酶活性，使ras持續(xù)活化ras11４）核蛋白類Nucleartranscriptionfactors轉(zhuǎn)錄因子e.g.MYCmycmybfosjun腫瘤擴(kuò)增12５）端粒端粒(telomere)是位于細(xì)胞染色體末端的一種有2-20kb串聯(lián)的短片段重復(fù)序列(TTAGGG)n及一些結(jié)合蛋白組成的特殊結(jié)構(gòu)。13５）端粒酶端粒序列的復(fù)制依賴于端粒酶（telomerase）端粒酶為一種特殊的DNA聚合酶,由RNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白復(fù)合物(RNP)，含有端粒重復(fù)序列的模板，即以自身RNA組分為模板，復(fù)制合成端粒序列。14人的端粒長度約15kb，隨著細(xì)胞的每次分裂，逐漸縮短，每次丟失50-200個核苷酸。端粒的縮短限制了細(xì)胞增殖能力，對端粒長度的計算是計數(shù)細(xì)胞分裂次數(shù)的生物鐘。15（２）癌基因的活化機(jī)制１）轉(zhuǎn)導(dǎo)漫長進(jìn)化過程中,逆轉(zhuǎn)錄病毒感染正常細(xì)胞,通過重組將細(xì)胞的原癌基因整合入病毒基因組,使原癌基因活化.帶有此種基因的病毒感染合適的動物時,可使其發(fā)生腫瘤.轉(zhuǎn)座逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄RetrovirusRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)－逆轉(zhuǎn)錄病毒16２）點突變

17３）插入突變逆轉(zhuǎn)錄病毒本身不含有癌基因,但是當(dāng)其插入宿主細(xì)胞原癌基因鄰近,使原癌基因活化.18４）易位

染色體出現(xiàn)易位、重排等改變時，可使細(xì)胞癌基因與正常的抑制子分開而被置于活化DNA序列的控制之下，其中具有代表性的例子為Burkitt淋巴瘤。19AcuteMyelogenousLeukemiaiscausedbythistranslocation2021５）基因擴(kuò)增DNA拷貝數(shù)增加形成雙微體(DM)和均染區(qū)(HSR)22６）甲基化改變1.癌基因去甲基化,抑癌基因高甲基化.2.甲級化致突變：脫氨基作用是DNA自發(fā)損傷的一種普遍形式，未甲基化的胞嘧啶脫氨基產(chǎn)物是尿嘧啶，細(xì)胞內(nèi)的尿嘧啶DNA糖基化酶特異性識別U:G錯配，能及時修復(fù)DNA突變。而5-甲基胞嘧啶的脫氨基產(chǎn)物胸腺嘧啶（T）是一正常的DNA堿基，此時尿嘧啶DNA糖基化酶的修復(fù)作用喪失，最終導(dǎo)致基因突變的存在.23（２）癌基因的活化機(jī)制總結(jié)24（３）抑癌基因定義:一對等位基因由于其功能喪失,從而使細(xì)胞過度增殖,導(dǎo)致腫瘤的形成,這對等位基因即為抑癌基因.特點：1.癌細(xì)胞中一對等位基因同時失活;

2.能夠抑制細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化或抑制細(xì)胞異常增殖的基因.目前研究較多的有p53基因、RB基因、p16蛋白、p15蛋白、p21等。25１）Ｒb基因視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)易感基因,定位于13q14.兩個等位基因缺失或一個等位基因缺失,另外一個因突變而失活,造成RB基因功能喪失.基因產(chǎn)物及功能:p105，控制生長.RB基因功能喪失常見腫瘤:RB、成骨肉瘤、胃癌、SCLC、乳癌、結(jié)腸癌.2627２）p53定位與17p13,11個外顯子組成,393個氨基酸.蛋白有5保守區(qū),分別位于13-19,117-142,171-192,236-258,270-282位氨基酸.腫瘤突變大多發(fā)生在這些保守區(qū).野生型p53(wtp53)半衰期為20分鐘,而突變型p53（mp53）半衰期為1.4-7.0小時．

p53突變常見相關(guān)腫瘤:星狀細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、乳癌、成骨肉瘤、SCLC、胃癌、磷狀細(xì)胞肺癌28野生型P53生物學(xué)活性當(dāng)DNA損傷的時候,P53基因就明顯表達(dá)使細(xì)胞在G1期生長阻滯，修復(fù)DNA;或不能修復(fù),促使細(xì)胞凋亡。抑制腫瘤細(xì)胞生長保持DNA完整性29

p53P53p21BAX303)APC基因APC基因克隆自腺瘤性多發(fā)性息肉病(adenomatouspolyposiscoli,APC)，定位于5q21，編碼2842個氨基酸．APC的功能：促進(jìn)癌基因β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的降解抑制腫瘤的形成．APC失活導(dǎo)致細(xì)胞增殖乃至惡性轉(zhuǎn)化．APC失活見于：腺瘤性多發(fā)性息肉，散發(fā)性結(jié)直腸癌，肺癌等腫瘤．314)BRCA1BRCA1是乳腺癌易感基因１(breastcancersusceptibilitygenetype1,BRCA1),是遺傳性乳腺癌／卵巢癌綜合癥的易感基因．定位于17q12-13，含22個外顯子，編碼1863個氨基酸．BRCA1功能：基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，DNA損傷修復(fù)．失活引起基因組不穩(wěn)定．BRCA1基因突變或雜和性丟失，導(dǎo)致其失活，常見于乳腺癌和卵巢癌．325)p16INK4ap16INK4a是INK4(inhibitorofCDK4andCDK6)基因的一種蛋白產(chǎn)物，是一種細(xì)胞周期抑制蛋白(CKI)功能：p16INK4a與cylinD1競爭結(jié)合G1期激酶CDK4／CDK6，抑制其對Rb蛋白的磷酸化，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2F-1，結(jié)果依賴E2F-1轉(zhuǎn)錄的基因不能轉(zhuǎn)錄，從而抑制DNA合成，阻止細(xì)胞分裂．33p16INK4a胰腺癌，非小細(xì)胞肺癌，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤，急性白血病，鼻咽癌常見p16INK4a基因純合性缺失．食管鱗癌，膽管癌常見p16INK4a基因突變．大腸癌，乳腺癌常見p16INK4a基因啟動子部位CpG島高甲基化．34６)p21p21是一種廣泛細(xì)胞周期激酶抑制蛋白．功能：p21與多種cylinD／CDK復(fù)合物結(jié)合，使其喪失磷酸激酶活性，使pRb不能磷酸化，從而使細(xì)胞周期停止在G1期；還與PCNA（細(xì)胞核增殖抗原）結(jié)合，抑制其與DNA聚合酶結(jié)合，抑制DNA合成．（１）依賴p53途徑．DNA受損，p53上調(diào)，誘導(dǎo)p21表達(dá)上升．（２）非依賴p53途徑．生長因子（EGF，F(xiàn)GF，PDGF等）通過細(xì)胞分裂素活化的蛋白激酶（MAPK）途徑上調(diào)p21表達(dá)．多數(shù)腫瘤見其表達(dá)異常（尤其黑色素瘤），未見其突變．35７)其他抑癌基因WT1１WT1：腎惡性胚胎瘤易感基因，負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，常表現(xiàn)為雜合性丟失．２DCC（deletedincolorectalcancer,DCC)：結(jié)直腸癌缺失基因，其缺失與結(jié)直腸癌進(jìn)展有關(guān)．３PTEN:抑制腫瘤細(xì)胞酪氨酸激酶FAK活性，抑制腫瘤細(xì)胞生長．通常以雜和性缺失，基因突變，甲基化改變見于多種腫瘤（乳腺癌，卵巢癌，肺癌，腎癌，膀胱癌等）363.表觀遺傳學(xué)的改變表觀遺傳學(xué)：即不是指DNA質(zhì)與量的改變，而是DNA修飾改變，如甲基化改變，乙?；淖?，小RNA(microRNA)調(diào)節(jié)．很多抑癌基因的失活是甲基化表觀遺傳學(xué)改變和突變，缺失等遺傳學(xué)改變聯(lián)合作用的結(jié)果．374.DNA損傷及其分子改變1物理化學(xué)因素（紫外線，電離輻射，致癌物）．２DNA分子自發(fā)改變發(fā)生于DNA復(fù)制，DNA修復(fù)，基因重排過程中，DNA分子自身的化學(xué)改變而導(dǎo)致的水解，氧化和甲基化．385.基因組不穩(wěn)定性

正?；蚪M保持驚人的穩(wěn)定性和完整性，反映高保真復(fù)制基因突變積累到一定程度，造成染色體畸變，從而造成染色體不穩(wěn)定．396.染色體異常染色體的結(jié)構(gòu)的改變40染色體數(shù)目的改變1）整倍體多倍體;具有兩套以上的染色體三倍體：具有三套染色體2)非整倍體：增加或減少一條或幾條染色體417微衛(wèi)星不穩(wěn)定性微衛(wèi)星DNA指簡單重復(fù)序列(1-4bp),在體內(nèi)是不能表達(dá)的。原位雜交實驗表明，衛(wèi)星DNA定位于染色體的異染色質(zhì)區(qū)，與染色體著絲點相連。腫瘤表現(xiàn)為簡單重復(fù)序列的增加或丟失．結(jié)腸癌，胃癌，肺癌，胰腺癌ＰＣＲ檢測肺癌-分子診斷42MolecularsubsetofNSCLC(10~16.6%)(19~21%)(5%)(1.9%)(forHER2,Shigematsu,CancerRes2005)RET(1~2%)肺癌—基因診斷和個體化治療45EGFRT790M~250kb~300kbt(2;5)ALKgenebreakpointregion2p23regionTelomereCentromere3’5’Shawetal.,JCO,inpressBreak-ApartFISHAssayforALKFusionGenes

54結(jié)直腸癌分子模型56３乳腺癌（１）BRCA1，BRCA2基因突變：家族性乳腺癌患者．（２）抑癌基因：p53，PTEN突變（3）癌基因：c-erbB2，c-myc（擴(kuò)增），

nm23（腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，ＬＯＨ）57白血病:染色體易位和重排影響分子病理診斷的關(guān)鍵因素?良好的標(biāo)本組織?嚴(yán)格的質(zhì)量控制?規(guī)范的實驗操作?適當(dāng)?shù)募夹g(shù)選擇?結(jié)果的可靠驗證59分子診斷在腫瘤診斷中注意事項用于腫瘤早期診斷或癌