實(shí)驗(yàn)七 植物染色體標(biāo)本制作和組型分析

植物染色體標(biāo)本制作和組型分析綜合性實(shí)驗(yàn)6h一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)植物染色體制片的基本原理和方法。 2.了解細(xì)胞周期中染色體的動(dòng)態(tài)變化。3.掌握植物染色體組型分析的方法；了解染色體組型分析的意義二、實(shí)驗(yàn)原理常規(guī)壓片染色體常不能完全散開,容易重疊、變形、斷裂，影響顯帶結(jié)果，核型分析較困難。20世紀(jì)70年代以來(lái)，參照動(dòng)物染色體標(biāo)本制備技術(shù)，對(duì)植物細(xì)胞去壁、低滲、火焰干燥方法，取得了很好的結(jié)果。分散良好的標(biāo)本片用于染色體計(jì)數(shù)、組型分析、顯帶、顯微操作、原位雜交等分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究領(lǐng)域。染色體作為遺傳物質(zhì)——DNA的載體，對(duì)生物的遺傳、變異、進(jìn)化和個(gè)體的發(fā)生，以及細(xì)胞增殖和生理過(guò)程的平衡控制等都具有十分重要的意義。染色體組在細(xì)胞分裂中期的表型稱為染色體組型或稱核型，包括染色體數(shù)目、形態(tài)、大小、著絲粒位置及帶型等等。染色體組型分析就是通過(guò)對(duì)染色體標(biāo)本或其照片進(jìn)行測(cè)量、對(duì)比分析、配對(duì)、分組、排列，對(duì)組內(nèi)各染色體的形態(tài)進(jìn)行測(cè)量、描述，從而闡明生物染色體組成的過(guò)程。進(jìn)行染色體組型分析主要依據(jù)一下幾個(gè)參數(shù)：1、相對(duì)長(zhǎng)度：指單個(gè)染色體的長(zhǎng)度與包括X染色體在內(nèi)的單倍體染色體總長(zhǎng)度之比，即相對(duì)長(zhǎng)度=單個(gè)染色體的長(zhǎng)度*100%/(單倍常染色體+X染色體)的總長(zhǎng)度2、臂指數(shù)=長(zhǎng)臂長(zhǎng)度（q）/短臂長(zhǎng)度（p）3、著絲粒指數(shù)=短臂長(zhǎng)度*100%/整個(gè)染色體長(zhǎng)度4、染色體臂數(shù)：端部著絲粒染色體，臂數(shù)為1，其他為2三、實(shí)驗(yàn)材料器具：顯微鏡，恒溫培養(yǎng)箱試劑：0.02％秋水仙素溶液，70%酒精，改良苯酚品紅染色液，1mol/LHCl材料：常用分生區(qū)組織，如根尖、莖尖和嫩葉做材料。可用大麥(2ｎ=14)、黑麥(2ｎ=14)、玉米(2ｎ=20)、蠶豆(2ｎ=12)、洋蔥(2ｎ=16)根尖。四、實(shí)驗(yàn)方法一）根尖培養(yǎng)和預(yù)處理取材：將玉米/蠶豆種子/洋蔥鱗莖放在25℃溫箱中發(fā)芽，待根長(zhǎng)到1cm左右。前處理：剪下根尖用0.05％秋水仙素溶液處理3～4h?；?qū)⒓粝碌母夥旁?～3℃蒸餾水中，置冰箱中24小時(shí)，使分裂的細(xì)胞盡可能集中于分裂中期。固定：用水洗凈處理過(guò)的根尖，經(jīng)（乙醇）甲醇—冰醋酸（3:1）固定2～24小時(shí)。使細(xì)胞的分裂活動(dòng)處于停滯狀態(tài)。二）壓片法制片解離：取出根尖，用蒸餾水洗凈，切取根冠組織0.5～1mm長(zhǎng)，放入1mol/LHCl室溫解離12、14、16、18min，軟化去除細(xì)胞壁及果膠物質(zhì)，使細(xì)胞易于分散。再用蒸餾水洗凈。染色：清水漂洗去除殘留鹽酸后，用改良苯酚品紅染色液染色5～10min。壓片：取組織，用鑷子搗碎，蓋上蓋玻片，覆以吸水紙，輕輕敲打蓋片，使細(xì)胞和染色體分散。鏡檢。附：去壁低滲火焰干燥法制片酶解：倒去固定液，用蒸餾水充分洗干凈，切取分生區(qū)放到青霉素小瓶中，加入混合酶液（2.5%纖維素酶+2.5%果膠酶），25℃酶解1-2h（28℃，20min）。低滲：倒去酶液，用蒸餾水慢慢沖洗2次，然后在蒸餾水中浸泡30min。制備細(xì)胞懸液：倒去蒸餾水，用鑷子將材料夾碎。向細(xì)胞液中加入2～3ml新鮮固定液，吹打制成細(xì)胞懸液。去組織塊：靜置片刻，使大塊組織沉淀，吸取上層細(xì)胞懸液靜置30min左右，使細(xì)胞沉淀，輕輕吸去上清液，留約1ml左右細(xì)胞懸液制備標(biāo)本。冷凍滴片—染色—鏡檢。四）染色體組型分析1、根據(jù)染色體的長(zhǎng)短和形態(tài)特征進(jìn)行同源染色體的目測(cè)配對(duì)。在顯微鏡下找出染色體分散良好、姐妹染色單體清楚的中期分裂相進(jìn)行顯微拍攝。選取顯微照片上的一個(gè)細(xì)胞的全部染