DB6528T191-2023大蒜品種純度SSR分子標(biāo)記鑒定法

ICS67.080.01CCSB31

6528巴音郭楞蒙古自治州地方標(biāo)準(zhǔn)DB6528/T191—2023大蒜品種純度SSR分子標(biāo)記鑒定法PurityidentificationofgarlicvarietybySSRmolecularmarkers20232023080120230815巴音郭楞蒙古自治州市場監(jiān)督管理局??發(fā)布DB6528/T191DB6528/T191—2023DB6528/T191DB6528/T191—2023目 次前言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1原理 1儀器設(shè)備和試劑 1儀器設(shè)備 2試劑 2方法步驟 2取樣 2DNA提取 2分子標(biāo)記篩選 2PCR擴(kuò)展反應(yīng)體系 3PCR擴(kuò)展反應(yīng)程序 3非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 4純度計算 4附錄A（規(guī)范性）溶液配制 5A.1溶液配制 5附錄B（規(guī)范性）制膠及電泳過程 6B.1制膠及電泳過程 6參考文獻(xiàn) 7I前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由新疆巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出、歸口并組織實施。本文件起草單位：新疆巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。本文件實施中的疑問，請咨詢新疆巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。（庫爾勒市石化大道64號（新疆庫爾勒市英下路巴州農(nóng)科院新疆巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局聯(lián)系電話郵編：841000新疆巴郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院聯(lián)系電話郵編：841000新疆巴音郭楞蒙古自治州市場監(jiān)督管理局聯(lián)系電話郵編：841000IIII大蒜品種純度SSR分子標(biāo)記鑒定法范圍本文件規(guī)定了大蒜品種純度SSRPCR本文件適用于焉耆盆地巴音郭楞蒙古自治州大蒜品種純度鑒定。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程扦樣GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法術(shù)語和定義3.13.13.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction利用單鏈寡核苷酸引物對特異DNA片段進(jìn)行體外快速擴(kuò)增的一種方法。3.33.4 SSRsimplesequencerepeats（1個～6個為重復(fù)單位聚集而成的長達(dá)幾十個至幾百個一般為100bp～200bp）的串聯(lián)重復(fù)序列，又稱微衛(wèi)星序列或短串聯(lián)重復(fù)序列，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。3.53.6分子標(biāo)記molecularmarker以蛋白質(zhì)、核酸分子的多態(tài)性為基礎(chǔ)，鑒定生物在遺傳上的差異。3.73.8品種純度varietypuritySSR4原理SSRPCR技術(shù)將多態(tài)的SSR6.05儀器設(shè)備和試劑1儀器設(shè)備PCR儀：垂直電泳槽；水平電泳槽；高壓電泳儀（3000V，400mA，400W）；核酸濃度測定儀；萬分之一電子天平；組織研磨儀；微量加樣器；臺式高速離心機(jī)；紫外可見成像系統(tǒng)；醫(yī)用膠片觀察燈；水平搖床；高壓滅菌鍋；微波爐；冰箱；數(shù)碼相機(jī)。試劑EDT-Na2TrsHC3％NaC；（TEMED）；（37％）；TaqDNA（含Mg2+的10×PCR緩沖液NTPs）；SSR引物；瓊脂糖；GoldView染料；DNA提取試劑盒；實驗用水為雙蒸水或符合GB/T6682規(guī)定的一級水。除特殊說明外，所用試劑均為分析純試劑。相關(guān)溶液配制方法見附錄A。方法步驟GB/T3543.230頭、60瓣，樣品質(zhì)量應(yīng)不少于500g。在玻璃培養(yǎng)皿底部墊上一層厚度3mm照培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度3000Lx條件下16h、35℃光照培養(yǎng)；無補(bǔ)光條件下8h、28℃暗培養(yǎng)。相對濕度70％。待鱗莖長出鱗葉后備用。稱取鱗葉200mg左右用植物基因組DNA提取試劑盒內(nèi)步驟提取DNA，所提取DNA濃度和純度用核酸濃度檢測儀測定，DNA完整性用DNA凝膠電泳檢測。DNA溶液的OD260/OD280值應(yīng)在1.7～2.0之間，或質(zhì)量能符合檢測要求。最終于—20℃冰箱中保存。注：以上為推薦的DNA提取方法。其他能夠達(dá)到PCR擴(kuò)增質(zhì)量要求的DNA提取方法也適用于本文件。6.3分子標(biāo)記篩選在玻璃培養(yǎng)皿底部墊上一層厚度3mm照培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度3000Lx條件下16h、35℃光照培養(yǎng)；無補(bǔ)光條件下8h、28℃暗培養(yǎng)。相對濕度70％。待鱗莖長出鱗葉后備用。稱取鱗葉200mg左右用植物基因組DNA提取試劑盒內(nèi)步驟提取DNA，所提取DNA濃度和純度用核酸濃度檢測儀測定，DNA完整性用DNA凝膠電泳檢測。DNA溶液的OD260/OD280值應(yīng)在1.7～2.0之間，或質(zhì)量能符合檢測要求。最終于—20℃冰箱中保存。注：以上為推薦的DNA提取方法。其他能夠達(dá)到PCR擴(kuò)增質(zhì)量要求的DNA提取方法也適用于本文件。6.3分子標(biāo)記篩選宜選擇編號1號～81PCR10SSR8對引物仍未達(dá)到篩選效果的，可選擇表1另外22對擴(kuò)展輔助引物進(jìn)行篩選。表1純度鑒定引物2編號標(biāo)記名稱上游引物下游引物1GB-ASM-040CACAGCAACATGCACCATTGCCGGAACTCGATATT2GB-ASM-053ACAAGGTCGACATCGTTTGGGGCTTCACCTGAACACA3GB-ASM-072CACGCGAATCTTTCTTGGTGCAAAGCAATATGGCAG4GB-ASM-109GGTCTCCTCATCCACCGTGTGTGGGGCATGATTGAC5SSR7ATGCCGCCATTAAGCACTTGGCAAACAGGATTGGCACCAGPCRPCR總體積10μl，包括稀釋濃度為30ng/μl的檢測樣品DNA1μl、純度測定加入正反引物各0.5μl、2TaqPCRMix5l3μlddHO補(bǔ)充。PCR3表1純度鑒定引物（續(xù)）編號標(biāo)記名稱上游引物下游引物6SSR8AGGATGGATGGACTTGCAAGGTGTGGTATCTGTGCCTGCTG7SSR11AACCATTTGATGCAGTGCGGCTGGCGGTAGAATGCGTTTG8ACM0318TCCTCCTTCCAAACCACATCGATCAGAAACAGCAGCGTC9AMS25GCAACCTTTCCCCGAGAGGAGGGCAGTGTTAGCATTCC10ACM326AAACCAGCAACAACCAATGAAAATTGGAGAGCAGGCAAA11ACM065GCTCTGATGGAGGATGGTTCCTTGCCATCTTTGTCGGT12ACM046TCCTCGTCACCACCACAGCTGAAAGGGAGTAGCGGAG13AMS26TTGTCCAAGTAGTTGTGAATCTAATCAAAGCATAGTTG14ACM187GTACTCGGGCAGTGGAGGTAGGAGCTGTCCAAATGCTAGG15ASESSR-14CCCCTTCGGTTGTTTTTCTTCTGGGTACGGTCGTTATTGG16ASESSR-30GCAGCAGTAGAAGAACCTGCTAACCTCTTTTGGTGCCTCCT17ASESSR-83CCAAAGCTCCCATCTTCATCCGTCGGCTCTCTTATTTTGC18ASESSR-91GTTCTCCGTTGCGTCAATCGAATTTGCATCTTTCCCCTTC19ACM086GCGGATTGGATCATCAGATTTTCTTGATTCCTCCGTTTGG20Asa06GGGGTGTTACATTCTCCCCTACCGCCTGATTTTGCATTAG21Asa07CTCGGAACCAACCAGCATACCCAAACAAGGTAGGTCAGC22Asa08TGATTGAAACGAATCCCACAGGGGGTTACCTGAACCTGTTA23Asa10TTGTTGTTCTGCCATTTTGATCTAAGCCGAGAGAAA24Asa59CGCTTACTATGGGTGTGTGTCCAAGTGGGAGACTGTTGGAG25SSR18GAGCTGAAGCAAAACCAACTTCGTCAGTGTATGGGAAAAGAGCC26SSR32ATTCCTAAGAGAGGACGAAGGCCTACTTCTGTGTGGATAAACGGC27SSR34AACTCTTTTCAAGCTCTGGACGTCACAGGTAATGTCAAGGATGG28SSR37CTTTAGCTGTTTGGTCGTTGTGACCTCGGCTCTTAAATCATACG29SSR68ATGTTGGATACTTCAGGCAGGTCGTTTTCTGCTCTCCTTCTCTC30SSR86AGAAGAGGCTAAAGGCCAAAGTTTTCCATCATCCCCATCATC943min；9430s，不同引物最佳退火溫度退火45s，7290s；30次循環(huán)的最后一個循環(huán)延伸設(shè)定為10min，4℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物。6.6非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳按照附錄B規(guī)定的方法，進(jìn)行6％非變性聚丙烯酰胺凝膠制作及電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。純度計算以篩選出來的SSR式中：C——品種純度，單位為％。T——

C=T

×100％···················································(1)N——非本品種供檢樣品數(shù)，單位為個。44附錄 A附錄 B（規(guī)范性）附錄 C溶液配制溶液配制引物稀釋按照引物合成單說明先配制100μmol/L402.5μmol/L的使用液。10％過硫酸銨加過硫酸銨1g溶解并定量稀釋至10mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。5×TBE緩沖液Tri108g，硼酸55gEDT·2·N27.44g2000m。330%聚丙烯酰胺膠溶液加丙烯酰胺290g，甲叉雙丙烯酰胺10g溶解并定量稀釋至1000mL。6%聚丙烯酰胺膠5×TBE1013.525.5750μL混合溶液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。0.5×TBE用5×TBE緩沖液200mL稀釋至2L。固定液用無水乙醇50mL，冰乙酸2.5mL，稀釋至500mL?，F(xiàn)配現(xiàn)用。滲透液加硝酸銀1g溶解并定量稀釋至400mL?，F(xiàn)配現(xiàn)用。顯色液加氫氧化鈉5.5g溶解并定量稀釋至400mL，使用時加入甲醛1.5mL?，F(xiàn)配現(xiàn)用。5附錄 D附錄 E（規(guī)范性）附錄 F制膠及電泳過程制膠及電泳過程凝膠制作將玻璃板洗凈，用無水乙醇擦兩遍，晾干。待玻璃板徹底干燥后，將其組裝好。取5×TBE緩沖液10mL，30％聚丙烯酰胺膠溶液13.5mL，超純水25.5mL，TEMED30μL，10％APS750μL，迅速混勻后灌膠。灌膠過程中防止氣泡產(chǎn)生。灌膠結(jié)束后，將梳子齒向外，輕輕的插入膠中，使其聚合1h以上。電泳用洗耳球吹洗加樣槽，清除氣泡和雜質(zhì)。每個加樣孔加入3μL的檢測樣品PCR產(chǎn)物。100W恒功率電泳至上部的指示帶（二甲苯青）到達(dá)膠板的中部。銀染電泳結(jié)束后，小心分開兩塊玻璃板，凝膠緊貼在長板上。將長板置于固定液中輕輕晃動3min，雙電泳結(jié)束后，小心分開兩塊玻璃板，凝膠緊貼在長板上。將長板置于固定液中輕輕晃動3min，雙蒸水快速漂洗1次，不超過10s；滲透液中染色5min，雙蒸水快速漂洗1次，不超過10s，顯色液中輕輕晃動直至帶紋清晰，雙蒸水漂洗1min。6參考文獻(xiàn)［1］BarbozaK，SalinasMC，Acu?aCV，etal．Assessmentofgeneticdiversityandpopulationstructureinagarlic(AlliumsativumL．)germplasmcollectionvaryinginbulbcontentofpyruvate，phenolics，andsolids［J］．ScientiaHorticulturae，2020，261：1089-1100.［2］BarbozaK，BerettaV，KozubPC，etal．Microsatelliteanalysisandmarkerdevelopmentingarlic：dis