實時熒光定量PCR技術的研究進展及應用

實時熒光定量PCR技術的研究進展及應用摘要:實時熒光定量PCR技術通過檢測PCR產(chǎn)物中熒光訊號強度來達成定量的目的,該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，并且與常規(guī)PCR相比，它含有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點,現(xiàn)在已在動植物基因工程，微生物和醫(yī)學領域中得到廣泛應用.本文對實時熒光定量PCR技術的原理，檢測辦法的原理、優(yōu)缺點進行了評述,重點及創(chuàng)新點是對實時熒光定量PCR技術在醫(yī)學領域，食品行業(yè)，植物方面的應用進行了比較全方面的綜述，并對實時熒光定量PCR技術的普及應用及領域的前景做了進一步的展望.核心詞：實時熒光定量PCR；應用;展望Researchprogressandapplicationofreal—timePCRtechnologyAbstract：Real—timePCRtechnologytodetectPCRproductbyfluorescencequantitativesignalstrengthtoachievethepurpose,thetechnologynotonlytoachievethePCRfromqualitativetoquantitativeleap，andcomparedwithconventionalPCR，itismorespecific,effectivesolutiontoPCRcontaminationproblem,degreeofautomation,hasbeenwidelyusedingeneticengineeringofplantsandanimals，microbesandmedicinefields。Inthispaper，theprincipleofreal—timePCRtechnology，principles，testingmethods，advantagesanddisadvantagesarereviewed，thefocusandinnovationisareal—timePCRtechnologyinthefieldofmedicine,foodindustry，plantaspectsoftheapplicationofamorecomprehensiveoverview，prospectsandreal—timePCRtechnologyinthefieldofuniversalapplicationandmadeafurtheroutlook.Keywords:Real-timequantitativePCR；application;Outlook聚合酶鏈反映(PCR）技術自1985年問世以來，以其敏捷性高、特異性強和速度快在分子生物學等科研領域得到了廣泛應用。但是，由于傳統(tǒng)的PCR技術不能精擬定量,在操作過程中易受污染而使假陽性率偏高；因此，使其應用受到限制。實時熒光定量PCR技術擁有特異性強、敏捷度高、重復性好、定量精確、速度快、全封閉反映等優(yōu)點，已成為了分子生物學研究的重要工具.文章對實時熒光定量PCR技術的原理、檢測辦法、定量辦法及其應用進行了綜述。1。實時熒光定量PCR技術概述1.1實時熒光定量PCR技術的原理所謂實時熒光定量PCR技術,是指在PCR反映體系中加入熒光基團,運用熒光積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過原則曲線對未知模板進行定量分析的辦法[1].實時熒光定量PCR是在反映體系中加入熒光基團，使產(chǎn)物的數(shù)量與檢測到的熒光強度成線性關系，從而得出產(chǎn)物的擴增曲線如圖1.在PCR反映早期,不能將產(chǎn)生熒光的水平與背景明顯區(qū)別，之后熒光的產(chǎn)生進入指數(shù)期、線性期和最后的平臺期，因此能夠在指數(shù)期的某一點上檢測PCR產(chǎn)物的量,并由此推斷起始模板含量。為了精確判斷樣品中某基因產(chǎn)物的起始拷貝數(shù)，熒光定量PCR采用參數(shù)“Ct”值，Ct值也稱閾值循環(huán)(thresholdcycle），指PCR循環(huán)過程中，熒光信號開始由本底進入指數(shù)增加階段的拐點所對應的循環(huán)次數(shù),也就是每個反映管內(nèi)的熒光信號達成設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù).研究成果表明,每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系,起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小[2］。運用已知起始拷貝數(shù)的原則樣品可作出原則曲線,因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從原則曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)［3］。圖1實時熒光定量PCR的原則擴算曲線1.2實時熒光定量PCR技術的檢測辦法實時熒光技術PCR是在擴增產(chǎn)物聚集的過程中持續(xù)檢測，即“實時”檢測,根據(jù)在指數(shù)擴增期的產(chǎn)物量來推算初始模板的拷貝數(shù)。實時熒光定量PCR涉及探針類和染料類兩種,探針類是運用與靶序列特異雜交的探針來批示擴增產(chǎn)物的增加。染料類如SYBRGreenI則是運用與雙鏈DNA小溝結合發(fā)光的理化特性批示擴增產(chǎn)物的增加。前者由于增加了探針的識別環(huán)節(jié)特異性更高；但后者則簡便易行、成本較低。1.2。1熒光標記探針按其基團標記和能量轉(zhuǎn)移的方式，現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)出幾個有關的技術，大致能夠分為水解探針和雜交探針兩類。如TaqManTM探針（水解探針)、TaqmanMGB（水解探針)（Dual—oligoFRETpairs(雙雜交探針)、Molecularbeacons(雜交探針)、UniversalprobelibraryLNA(lockednucleicacids（水解探針)、Simpleproble探針等[4］。（1）TaqMan探針該探針是長度為20—24b的寡核苷酸,在其5’末端標記1個熒光報告基團,3'末端標記1個熒光淬滅基團，其序列與2個引物包含序列內(nèi)的1段DNA模板完全互補。該辦法是當探針保持完整時運用Taq酶(5'→3'外切酶)的活性淬滅基團吸取發(fā)射的熒光。當有特異的PCR發(fā)生時，Taq酶發(fā)揮其5’→3’外切酶活性，將與模板雜交的探針切碎，報告基團與淬滅基團分離，淬滅作用被解除，熒光信號釋放，通過檢測系統(tǒng)就能夠觀察到信號的變化，熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成呈正有關。每擴增1條DNA鏈，就有1個游離的熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同時.運用原則模板系列繪制出原則曲線，結合各樣品的Ct值,能夠擬定樣品的起初模板量［5]。由于探針與目的片段之間的特異雜交產(chǎn)生熒光信號,因而此辦法可通過探針增強檢測的特異性,且能夠提供多重檢測功效.（2）TaqmanMGBTaqmanMGB探針是Taqman探針的基礎上改善的，在探針的3'端增加了MGB（minorgroovebinder)分子,這種物質(zhì)能夠結合在雙鏈DNA小溝部位；MGB提高了探針的TM值，從而使它能夠分辨1個堿基的差別：完全配對，有熒光信號；一種堿基不匹配,則沒有信號；并且連在MGB分子后的是非熒光物質(zhì)的淬滅基團，因此這種探針含有更加好的淬滅效果且無背景熒光、熒光標記靈活、提高熒光信號的信噪比、提高退火溫度、探針短、提高SNP識別率等優(yōu)點。從而含有了更加廣泛的應用前景。（3)分子信標分子信標是一種呈發(fā)夾構造的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，環(huán)部大小為15—35bp,能與靶DNA序列互補，莖部由GC含量較高的與靶DNA無序列同源性的互補序列構成，探針的5'端與3’端分別標記熒光報告基團和熒光淬滅基團。當分子信標處在自由狀態(tài)時,發(fā)夾構造的2個末端靠近，使熒光報告基團與淬滅熒光基團靠近，產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET）效應，熒光信號被淬滅;因此,檢測不到熒光信號［6］.當有靶序列存在時，分子信標與靶序列結合，使分子信標的發(fā)夾構造打開呈線型，熒光報告基團與淬滅基團彼此在空間上產(chǎn)生足夠的距離，此時熒光報告基團不能被淬滅，熒光檢測儀器可檢測到熒光。隨著每次擴增產(chǎn)物的積累，熒光強度增加，可反映出每次擴增末擴增產(chǎn)物積累的量.分子信標法的特點是探針可循環(huán)運用，合用于檢測點突變，特異性更明顯.但探針標記較復雜，并且規(guī)定其游離在溶液中時探針能無選擇性折疊,當莖構造的熱力學溫度過高時還會影響探針與靶序列雜交.（4）雙雜交探針雙雜交探針技術是Roche公司開發(fā)的一種PCR定量技術，使用2個雜交探針，能提高特異性。該技術是將2條探針中的1條在5'端標記熒光,1條在3'端標記熒光，其中一種為受體熒光基團，另一種為供體熒光基團，2個探針可與模板同1條鏈相鄰的序列雜交。在自由狀態(tài)時,供體熒光基團的發(fā)射光譜覆蓋受體熒光基團的激發(fā)光譜;因此，只能檢測到供體熒光基團發(fā)出的熒光.在PCR退火階段中2條探針與目的基因特異性結合，首尾連接，使供體和受體熒光距離非?？拷瑑烧弋a(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，使受體熒光基團發(fā)出熒光.由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針是靠近發(fā)光，因此檢測信號是實時信號，而非累積信號。該辦法的特點是淬滅效率高，但由于2個探針結合于模板上；因此，會影響擴增效率，并且需要合成2個較長的探針，合成成本相對較高.(5）Universalprobelibrary-LNA（lockednucleicAcids）新近Roche公司研發(fā)并建立了人類和鼠的通用探針庫,其探針是由鎖定核酸構成。他們通過分析人的轉(zhuǎn)錄組中全部不同的可能的8至9堿基序列,按照他們在轉(zhuǎn)錄組中出現(xiàn)的頻率分類，找出最普便的8至9堿基序列模式制備成通用探針；每一種探針能夠與7000個轉(zhuǎn)錄子雜交。這種探針的特異性由探針和引物共同實現(xiàn)。LNA是一種雙RNA聚合的類似物，其2p—位的氧原子與核糖4p—碳原子形成亞甲基的橋鍵,并分別在5p和3p標記上熒光報告基團和淬滅基團；LNA單體摻入寡核苷序列能夠增加形成體的Tm值，其穩(wěn)定性比PNA高（PNAS,97：5633—5638)1因LNA與DNA雜交較DNA與DNA、DNA與RNA甚至PNA與DNA雜交有更高的親和性，故這種探針穩(wěn)定性最佳；并且探針實現(xiàn)了設計快速簡樸、低成本的水解探針特點。普通上其公司網(wǎng)站后,輸入基因序列號，就能訂制，無需檢測引物二聚體和非特異性片段。因此LNA技術實現(xiàn)了高熔點和高特異性結合特點;能夠用于全部的熒光定量PCR儀。（6）Simple探針近來Roche公司生產(chǎn)一種簡樸探針，這種探針只在5'端標有報告熒光，在報告熒光和5’端之間連接一種稱作“l(fā)inker”的構造，只有在變性階段,探針與目的序列互補結合時,引發(fā)“l(fā)inker”構造發(fā)生變化,從而報告熒光基團的熒光得以顯現(xiàn)。這種探針的好處是不用淬滅基團，從而無背景熒光。1。2.2雙鏈DNA（現(xiàn)在用于實時PCR的dsDNA結合染料，重要有SYBRGreenI和LCGreenTMI［7］。（1)SYBRGreenI是一種非飽和菁類熒光素,能夠嵌合于DNA雙鏈構造的小溝中.其處在游離狀態(tài)時，檢測不到熒光信號,當結合dsDNA后熒光強度明顯增強,即被熒光探測系統(tǒng)檢測到,熒光強度的增加與初始模板量有關，能夠進行定量DNA分析,已有應用于臨床診療和科學研究中的報道。SYBRGreen染料法與探針法相比,其優(yōu)勢在于檢測辦法簡便，同時減少了檢測成本。但是,由于該染料能夠結合任何dsDNA分子，因此不能確保PCR的特異性。能夠通過優(yōu)化PCR的反映條件，減少或去除非特異性產(chǎn)物和引物二聚體的產(chǎn)生,另外,也能夠借助融解曲線分析法來分辨非特異性產(chǎn)物和引物二聚體而進行定性診療。(2）LCGreenTMI是最新出現(xiàn)的一種dsDNA結合染料,與SYBRGreenI相比,該染料是一種飽和結合染料，能夠完全結合dsDNA分子，可直接加入PCR反映體系中，高濃度的LCGreenTMI不會克制PCR反映。已有文獻報道在PCR反映體系中加入LCGreenTMI，使用一對引物，一種不作標記的探針,結合常規(guī)融解曲線或僅使用一對引物,PCR結束后通過分析融解曲線的形狀和融解溫度(Tm值）的大小，對純合子和雜合子以及寡核苷酸序列多態(tài)性（SNP）進行鑒別。LCGreenTMI染料法簡便、快速、精確性高，預期將會有較好的應用前景。1.3實時熒光定量PCR技術的發(fā)展PCR技術發(fā)明以來，研究人員始終致力于用其進行核酸精擬定量。1991年Holland等[8］初次運用不可延伸的寡核苷酸雜交探針與模板結合，然后運用DNA聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性將探針切斷，使探針的能量傳遞構造被破壞發(fā)出熒光來定量PCR產(chǎn)物。1992年Higuchi等［9，10]在PCR反映管中加入EB,反映進行過程中，PCR產(chǎn)物增加，EB與DNA雙鏈結合發(fā)出熒光強度也逐步增加.他們通過持續(xù)攝影動態(tài)觀察熒光強度的變化,并以此定量PCR產(chǎn)物的多少，成為最早的實時定量PCR。1996年Heid［11］等首先報道了TaqmanPCR的原理及辦法。同年,美國AppliedBiosystems公司推出商用實時定量PCR（TaqmanPCR）系列。之后,人們又設計出不同的熒光探針,如分子信標技術(molecularbeacon）[12］、LightcyclerPCR［13，14］等。隨著研究的不停進展,研究人員不僅定量DNA分子，還定量RNA分子,從而進一步定量基因的體現(xiàn)［15]。1.4實時熒光定量PCR的定量辦法實時熒光定量PCR的定量辦法有2種,即絕對定量法和相對定量法［16]。絕對定量法是用已知的原則曲線來推算未知的樣本量;相對定量法是在一定樣品中靶序列相對于另一參考序列量的變化，由于每個模板Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，運用已知起始DNA濃度的原則品即可繪制出原則曲線.1。4。1絕對定量法絕對定量法指的是用已知的原則曲線來推算未知樣本的量，此辦法要預先懂得原則品的濃度。將原則品稀釋成不同濃度并作為模板進行PCR反映，以原則品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，以測得的Ct值為縱坐標繪制出原則曲線。對未知樣品進行定量時根據(jù)未知樣品的Ct值，即可從原則曲線中推出樣品的起始拷貝數(shù).1.4。2相對定量法（1)比較原則曲線的相對定量法相對定量法指的是在一定樣本中靶序列相對于另一參考樣本量的變化。由于該辦法中量的體現(xiàn)是相對于某個參考物而言的；因此，相對定量法的原則曲線比較容易制備，對于所用的原則品只需懂得其稀釋度即可。在整個實驗中,待測樣本靶序列的量來自原則曲線，最后必須除以參考物的量，其它的樣本為參考物量的n倍.在實驗中為了精確加入反映體系的RNA或DNA，普通在反映中擴增1個內(nèi)源管家基因作為參考基因，由于管家基因在多個組織中的恒定體現(xiàn)，因此可用來作為原則,比較來源不同的樣本目的基因體現(xiàn)量的差別.管理基因是用于比較目的基因拷貝數(shù)，根據(jù)內(nèi)參考賠償待測樣本核酸抽提過程中造成的目的基因損失，反映體系內(nèi)與否存在擴增克制因素及參考物原則化等［17].（2）比較Ct值的相對定量法該辦法是同時擴增待測靶基因片段和內(nèi)參考基因片段。這2個擴增反映能夠在2個反映管中分別進行，也能夠在同1個反映管中進行，測得兩者的Ct值之差即ΔCt。該辦法不需要原則曲線，與原則曲線法不同之處在于其運用了數(shù)學公式來計算相對量，前提是假設每個循環(huán)增加1倍的產(chǎn)物,以PCR反映的指數(shù)期得到Ct值來估算起始模板的量，一種循環(huán)（Ct=1)相稱于起始模板數(shù)的2倍。此辦法節(jié)省試劑,操作簡便，但由于是以靶基因和內(nèi)源控制物的擴增效率基本一致為前提的,效率的偏移會影響對實際拷貝數(shù)的預計；因此，如何優(yōu)化反映體系,使得目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率相等是該辦法的難點.2．實時熒光定量PCR技術的應用。2.1醫(yī)學研究領域的運用應用實時熒光定量PCR檢測病原DNA不僅能夠定性,還能夠檢測出病原量的多少,為臨床診療提供了強有力的根據(jù).現(xiàn)在實時熒光定量PCR已經(jīng)應用于許多病原體的檢測，例如乙型肝炎病毒DNA［18］、鋒利濕疣皮損中HPVD—NA[19］、與鼻咽癌關系親密的EB病毒（Epstein-Banvirus)［20]、豬內(nèi)生逆轉(zhuǎn)錄酶病毒［21]。Andersen等［22]用定量PCR的辦法測定了結直腸癌淋巴結的癌胚抗原（CEA)mRNA的體現(xiàn)量，可作為診療癌癥微轉(zhuǎn)移的重要根據(jù)。Cassinat等[23]應用RQ-PCR對t（15;17）NB4白血病細胞進行了研究,其敏感性達10-6.Pongers-Willemse等［24]首先應用RQ—PCR對4例前B細胞ALL中IgH/TCR重排進行了研究,他們針對每個病例設計一種與連接區(qū)互補的等位基因特異性寡核苷酸(ASO）探針和各自特異性的一對引物，比較了RQ-PCR與斑點雜交和液相雜交檢測的敏感性.成果發(fā)現(xiàn)其敏感性與斑點雜交相似(10—3~10-5),但低于液相雜交.劉敬忠等報道使用dsDNA結合染料SYBRGreenI，結合融解曲線分析對A-地中海貧血純合子、雜合子作出診療［25]。使用雙色熒光標記探針,結合不同的引物設計，能夠?qū)崿F(xiàn)對某些先天性疾病的定量檢測.趙衛(wèi)東等［26］通過熒光定量的辦法對各細胞株的轉(zhuǎn)錄因子T-boxex—pressioninTcells（T-bet）、GATA3的體現(xiàn)水平進行檢測，建立了腫瘤細胞株轉(zhuǎn)錄因子基因體現(xiàn)的熒光定量PCR檢測辦法，較常規(guī)PCR辦法更為簡便、快速、精確,有較好的應用前景。2.2食品研究運用實時熒光定量PCR技術能夠?qū)κ称分兄虏【M行檢測。李光偉［27]等采用沙門菌fimY基因序列，設計特異引物和探針，建立了檢測食品中沙門菌的FQ—PCR辦法。胡建華等根據(jù)Grenbank公布的志賀菌ipaH基因的保守序列設計特異性引物，篩選適宜的DNA模板制備辦法嗎,以SABHGreen染料監(jiān)控熒光變化的FQ-PCR與常規(guī)PCR結合，檢測培養(yǎng)液和牛奶陽性樣品中的志賀菌［28]。FQ—PCR技術除了在微生物檢測中應用廣泛，也是食品微生物研究中不可缺少的工具，是作為微生物生理代謝、菌群分布、菌株鑒定等的研究工具.同時PCR技術是檢測轉(zhuǎn)基因食品最方便快捷的辦法，基于轉(zhuǎn)基因特異DNA片段的FQ-PCR篩選辦法已被某些國家作為有關食品法規(guī)的原則檢測辦法。日本和美國等13個實驗室聯(lián)合采用FQ—PCR辦法對5種轉(zhuǎn)基因玉米和1種轉(zhuǎn)基因大豆進行了定量研究。成果表明這種辦法能夠應用于轉(zhuǎn)基因作物標記制度的實際檢測[29］。2。3植物研究上的運用傳統(tǒng)的病原菌檢測辦法依賴于癥狀觀察、孢子或菌落計數(shù)等手段.與傳統(tǒng)辦法相比，實時定量PCR技術含有快速、敏捷、特異等優(yōu)點，不受植物癥狀的限制，能分辨細微差別。現(xiàn)在該技術在植物病原菌檢測中得到越來越廣泛的應用。如伍永明等[30］根據(jù)西瓜細菌性果斑病菌（Acidovoraxavenaesubsp。citrulli)與有關細菌16SrDNA序列差別，設計出對西瓜細菌性果斑病菌含有穩(wěn)定點突變特異性探針Aac-probe,運用該探針對23種供試菌株進行了實時熒光PCR檢測實驗.植物抗病性及其機制研究始終是當今植物病理學和植物抗病育種研究工作中的熱點和焦點問題。而抗病基因的研究是植物抗病性及其機制研究的基礎，運用熒光定量PCR技術可檢測轉(zhuǎn)入抗病基因的植株中病毒的積累［31]，從而比較抗病植株與感病植株之間的病毒復制和積累的差別,為抗病基因克制病毒的復制和運動提供強有力的分子證據(jù)。3．實時熒光定量PCR的展望實時熒光定量PCR技術自1996面世以來,短短的幾年就被廣泛應用到生物學各個領域,涉及到的范疇涉及DNA、mRNA和病毒荷載量的定量，核酸多態(tài)性分析,基因突變分析等多個領域。但隨著該技術應用的領域范疇不停擴大延伸,研究的層次不停進一步,它也開始顯現(xiàn)出局限性:（1)減少探針制備的成本或發(fā)掘新的熒光染料；（2)進一步提高分析的敏捷度及實驗重復性；(3)樣品制備簡樸化，程序化和機械化以節(jié)省時間減少成本.相信，實時熒光定量PCR將以其獨特的優(yōu)勢在分子生物學、生物學和醫(yī)學的基礎研究和應用研究方面發(fā)揮更多更大的作用。另外，基因分析的定量化和均相化是將來基因診療的發(fā)展趨勢,現(xiàn)在在該領域的研究剛剛開始，仍有許多問題需要解決,如分析敏捷度及重復性問題、自動化儀器和試劑成本、樣品解決及多基因同時分析等問題.生物芯片技術與熒光探針定量技術的結合將有助于上述問題的解決[32］，屆時將大大推動該技術在生命科學領域的應用普及,特別是臨床診療領域的推廣.隨著科學技術與科學知識的增加，實時熒光定量PCR技術將繼續(xù)被改善，新的問題被攻克，從而建立更新、更便捷、更完善的PCR體系,并應用到更廣、更深的科學領域。參考文獻[1］歐陽松應,楊冬，歐陽紅生等.實時熒光定量PCR技術及其應用[J].生命的化學,,24(1):742－761.［2]VerderioP，PizzaMiglioS，GalloF，etal.FCI:anR－basedalgorithmforevaluatinguncertaintyofabsolutereal－timePCRquantification［J］.BMCBioinformatics，，9:13.［3]WolfgangK，JonathanN，KarasS，etal1Fluorogenicprimersforreal-timePCRAmericanBiotechnologyLaboratory,,(7）：52—56[4]王愛民。實時熒光定量PCR(TaqMan)法測定外源基因的拷貝數(shù)［J］。廣西植物,，29(3）:408－412。［5］BonnetG,TyagiS，LibchaberA，etal。ThermodynamicbasisoftheenhancedspecificityofstructuredDNAprobes［J]。ProcNatlAcadSciUSA,1999,96：6171－6176。［6］BrechtbuehlK，WhalleySA,DusheikoGM，etal.Arapidreal－timequantitativepolymerasechainreactionforhepat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