激活血管內皮細胞乙酰膽堿作用靶標對抗血栓形成的影響及其分子機制

激活血管內皮細胞乙酰膽堿作用靶標對抗血栓形成的影響及其分子機制

1865年，他首先提出了內部皮細胞（ec）的概念。自血管內皮細胞（tc）的功能范圍僅限于阻止血管壁和物質交換的屏障。隨著分子生物學等先進技術的應用,尤其是血管內皮舒張因子(EDRF)發(fā)現后,對EC功能的研究已成為心血管領域的研究熱點?，F已證明,EC與血栓形成密切相關,生理狀態(tài)下,EC的非粘附的、抗凝的、纖溶的管腔內表面使其具有抗血栓形成特性。血栓狀態(tài)下,EC被激活,抑栓物質如NO合成降低,eNOS表達下降,PGI2合成減少,t-PA、u-PA及其受體系統功能降低;而促栓物質如ET、PAI-1、TXA2等合成增加或活性增強。1980年Furchgott等在《Nature》上首次報道,在兔離體胸主動脈上,外源性給予乙酰膽堿(Ach)所產生的血管舒張反應依賴于完整內皮的存在,提示血管內皮細胞上存在可被Ach激活的血管內皮細胞乙酰膽堿靶標(theendothelialtargetforacetylcholine)。在血栓形成的早期,動脈的近心端血管內皮細胞乙酰膽堿靶標的功能極度低下。內皮細胞包括血管內皮細胞乙酰膽堿靶標有無可能作為抗血栓藥物作用的新靶標?目前尚無相關的文獻報道,至今國內外尚未見調節(jié)血管內皮細胞功能的抗血栓藥物報道。本實驗通過觀察檳榔堿的抗血栓作用特點,旨在闡明激活血管內皮細胞乙酰膽堿靶標對血栓形成的影響并探討其可能的分子機制。1材料表面1.1動物Wistar大鼠,♀♂兼用,體重200～250g;昆明種小鼠,♂,體重18～22g。均由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。1.2凝血酶時間測定kappa型角叉菜膠,檳榔堿,鹽酸毛果蕓香堿(Sigma公司);凝血酶原時間、活化部分凝血活酶時間、凝血酶時間測定試劑盒(福建太陽生物技術公司);PAI-1活性測定試劑盒(上海醫(yī)科大學分子遺傳學研究室),血栓素B2和6-酮-前列腺素放免測定試劑盒(解放軍總醫(yī)院東亞放免所)。2adp活性測定2.1小鼠尾動脈血栓模型的制備小鼠腹腔注射kappa型角叉菜膠5mg·kg-1后,飼養(yǎng)于(20±1)℃的溫度和30%～50%的濕度環(huán)境中,于血栓啟動前24h、1h和啟動后24h分別ip受試藥物,48h后統計成栓率和血栓長度。2.2富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP)的制備Wistar大鼠,尾靜脈注射檳榔堿后2h,于下腔靜脈采血5ml(3.8g·L-1枸櫞酸鈉抗凝),800r·min-1離心10min,得PRP,再將下層3000r·min-1離心10min,得PPP。2.3血小板最大聚集率的測定取PRP,加20μmol·L-1的ADP外源性誘導血小板聚集,觀察藥物對最大聚集率的影響。2.4凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(KPTT)和凝血酶時間(TT)的測定取離心后的PPP,按試劑盒說明測定PT,KPTT和TT。2.5組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)含量和纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)活性的測定2.5.1t?PA2.5.1t-ΡA抗原的測定用ELISA方法測定血漿中t-PA的含量。2.5.2PAI?12.5.2ΡAΙ-1活性的測定采用發(fā)色底物法,依試劑盒說明操作。2.6血栓素A2(TXA2)和前列環(huán)素(PGI2)的含量測定在血栓模型上,ip檳榔堿1.0和4.0mg·kg-1后48h,動物眼球采血(消炎痛-EDTA-Na2抗凝),于4℃,3000r·min-1離心15min,取上層血漿依試劑盒說明測定TXB2和6-keto-PGF1α的含量。2.7統計學處理成栓率的統計χ2檢驗,其它數據以xˉ±sxˉ±s表示,采用成組t檢驗(SAS軟件,D2P8程序)。3結果3.1阿司匹林、檳榔堿和毛果英香堿對止血形成的影響3.1.1各組的84%對比阿司匹林25和50mg·kg-1,血栓發(fā)生率分別為32%和28%,與模型組的88%相比降低,P<0.01,(n=50);血栓長度分別為(6.4±1.2)mm和(9.6±2.2)mm,與模型組的(16.4±1.9)mm相比縮短,P<0.05及P<0.01(n=11～16),見Tab1。3.1.2血栓形成試驗結果檳榔堿0.01～0.05mg·kg-1,成栓率分別為100%和93%,與模型組的95%相比,差異無顯著性,P>0.05(n=40),血栓長度分別為(14.8±1.5)mm和(16.4±1.6)mm,與模型組的(19.5±2.2)mm相比也差異無顯著性,P>0.05(n=40);當劑量增至0.1mg·kg-1后,血栓發(fā)生率為58%,與模型組88%相比降低,P<0.01(n=23);劑量增至1.0～4.0mg·kg-1時,成栓率呈劑量依賴性降低,抗栓作用強度達到峰值。其中4.0mg·kg-1,成栓率由88%降低為30%,P<0.01(n=40),血栓長度由(16.4±1.9)mm縮短至(6.2±1.2)mm,P<0.05(n=12)。見Tab1。3.1.3成栓率和血栓長度毛果蕓香堿劑量為4.0mg·kg-1,比檳榔堿抗血栓的最低有效量0.1mg·kg-1高40倍后,使之充分激活M受體,成栓率和血栓長度分別為74%,(16.8±2.4)mm,與模型組的88%和(16.4±1.9)mm相比差異無顯著性,P>0.05(n=37～50)。見Tab1。3.2兩組t值的比較靜脈注射檳榔堿1.0mg·kg-1后,TT、PT和KPTT值分別為38.81s,1.38s,26.95s,與正常對照組的37.60s,1.21s和27.22s比較均差異無顯著性,P>0.05(n=4～15)。見Tab2。3.3大聚集率與正常對照組比較檳榔堿1.0mg·kg-1,血小板最大聚集率MAR為40.17%,與正常對照組的43.13%相比差異無顯著性,P>0.05(n=6～15)。見Tab2。3.4血漿t-pa含量的比較靜脈注射檳榔堿0.25和1.0mg·kg-1,血漿中t-PA的含量分別為116.23和107.10,與正常對照組的100.00相比升高,P<0.01和P<0.05(n=7～16)。見Fig1。3.5i-1的活性靜脈注射檳榔堿1.0mg·kg-1,PAI-1的活性為16.86kU·L-1,與正常對照組的18.89kU·L-1相比明顯降低,P<0.01(n=8)。見Fig2。3.6模型1:xb2含量檳榔堿1.0～4.0mg·kg-1,TXB2含量分別為356和346μg·L-1,與模型組的824μg·L-1相比降低,P<0.01(n=12～13)。見Fig3。3.7民法中的pge-pgf1含量檳榔堿0.25～1.0mg·kg-16-keto-PGF1α含量分別為488μg·L-1和428μg·L-1,與模型組的324μg·L-1相比明顯升高,P<0.01(n=12)。見Fig4。4抗血栓作用的激活途徑本實驗研究發(fā)現,檳榔堿在0.1～4.0mg·kg-1劑量下,可劑量依賴性地對抗血栓形成,其抗栓強度為阿司匹林的250～500倍;而相同條件下,毛果蕓香堿在劑量高達4.0mg·kg-1,較檳榔堿的最低有效劑量高40倍,使之充分激活M受體后,仍無抗血栓形成作用。本研究室近幾年的系列研究發(fā)現:內皮細胞乙酰膽堿作用靶標與經典的M受體既有相似性又有差異性。二者的相似性表現為:均可被Ach激活,被氧化震顫素、檳榔堿和氨甲酰膽堿所模擬;M受體拮抗劑阿托品抗M和抗內皮細胞乙酰膽堿作用靶標的作用是平行的。二者的差異性表現為:毛果蕓香堿不能激活內皮細胞乙酰膽堿作用靶標,但可激活M受體,阿托品不取代3H-Ach的特異性結合位點。在內皮完整的離體大鼠主動脈環(huán)上,檳榔堿可劑量依賴性地誘發(fā)內皮依賴性血管舒張反應,而在相同條件下毛果蕓香堿無明顯的舒血管作用,表明毛果蕓香堿不能激活血管內皮細胞乙酰膽堿作用靶標,此規(guī)律存在于大鼠、貓和兔的主動脈,也存在于貓的主動脈、腸系膜動脈、股動脈和腎動脈上,具有一定的組織普遍性。另外,檳榔堿和毛果蕓香堿均能激活平滑肌、神經元和腺體上的M受體。由此可見,毛果蕓香堿選擇性激活M受體,而無激活血管內皮細胞乙酰膽堿靶標的作用;而檳榔堿既激活血管內皮細胞乙酰膽堿靶標又激活M受體。因此,檳榔堿的抗血栓作用是激活血管內皮細胞乙酰膽堿靶標的結果,而不能用激活M受體來解釋。綜上所述,血管內皮細胞功能狀態(tài)與血栓形成之間密切相關,特異性作用于內皮細胞,并激活血管內皮細胞乙酰膽堿靶標的藥物,均可有效地對抗血栓形成。大量文獻報道,激活血管內皮細胞乙酰膽堿靶標可促進其釋放NO和PGI2,外源性激動劑如Ach、ATP、凝血酶等刺激血管內皮細胞后,L-精氨酸在NOS作用下生成NO,激活GC,使cGMP水平升高,引起平滑肌舒張,緩解血栓狀態(tài)下血管的痙攣狀態(tài),并加快淤滯的血流;NO還可抑制血小板的聚集,抑制血小板與EC的粘附,對抗血栓時血管壁細胞增殖;NO還可通過抑制PAI-1從血小板釋放而增加纖溶活性。Yao等在電刺激狗冠狀動脈誘發(fā)血栓形成的動物模型上發(fā)現,預先給予NOS抑制劑L-NNA可使血栓形成的誘發(fā)時間縮短約20%,而預先給予NO前體L-Arg或NO供體硝普鈉則血栓誘導時間延長1倍以上。一些機械刺激如血流剪切應力的變化;活性物質如5-HT、Ach、AA、凝血酶等均可使EC合成PGI2增多,EC攝取血液中的AA,經環(huán)氧合酶(COX)代謝途徑先生成內過氧化物(PGH2),再經血管壁細胞微粒體中的前列環(huán)素合成酶作用生成PGI2,后者激活AC,使胞內cAMP升高,cAMP通過升高ATP依賴的蛋白激酶(PKA),磷酸化PLC;抑制與Ca2+連接的蛋白激酶的活性,降低血小板與平滑肌細胞內Ca2+濃度;減少纖維素與激活血小板上連接位點的結合等途徑抑制血小板聚集,舒張血管平滑肌,抑制粘附分子與EC的粘附反應,PGI2還可引起t-PA從血管壁釋放而激活纖溶,發(fā)揮抗血栓作用。本實驗結果表明,檳榔堿可促進內皮細胞釋放PGI2,通過上述途徑抑制血栓形成。文獻報道,對多種血栓模型,PGI2有抗血栓形成作用:給金黃地鼠局部應用低濃度PGI2,可抑制ADP引起的微血栓形成,PGI2對靜注AA誘發(fā)的家兔肺微血栓有抑制作用,也可阻止電刺激家兔頸動脈壁所形成的血栓。除NO和PGI2外,激活血管內皮細胞乙酰膽堿靶標而發(fā)揮抗血栓作用還有其它途徑如t-PA、PAI-1、TXA2等。t-PA主要由血管EC合成,在纖維蛋白的存在下,通過形成t-PA、纖溶酶原和纖維蛋白的三元復合物進一步增加t-PA與纖溶酶原的接觸,也使激活的纖溶酶結合在復合物上,而不被α2-抗纖溶酶滅活;另外EC也合成t-PA的生理性抑制劑PAI-1,人們現已把血漿PAI-1視為血栓性疾病的獨立危險因子。纖溶系統損害主要表現在兩方面:一是血管EC釋放t-PA下降,二是血漿中PAI-1濃度增高,抑制了t-PA的活性,后者表現的更顯著。本實驗中,檳榔堿可促進內皮細胞釋放t-PA,抑制PAI-1的活性,通過上述環(huán)節(jié)發(fā)揮抗血栓作用。血小板的激活是動脈血栓形成的主要誘因,其粘附于受損血管部位與EC相互作用,始動血小板活化過程,并為瀑布式凝血反應提供場所,粘附的血小板變形并發(fā)生釋放反應,將胞漿中所含顆粒內含物如TXA2釋放到血漿,TXA2能強烈收縮血管,并誘導血小板聚集,TXA2與PGI2作用相反,二者之間的活性保持平衡,可控制正常的止血機制。檳榔堿可通過上述途徑抑制血栓時TXA2的生成,增加EC釋放PGI2,從而發(fā)揮抗血栓作用。目前現有的抗血栓藥物依作用機制可分為抗凝血藥、抗血小板藥和纖維蛋白溶解藥?？鼓幇ǜ嗡?AT-Ⅲ及直接抗凝血酶藥,組織因子通路抑制劑等。其中肝素不能抑制與纖維蛋白結合的凝血酶,已成為血栓復發(fā)的關鍵因素。近年來,低相對分子質量肝素及凝血酶抑制劑的研制,雖使抗凝血藥的療效與安全性有所提高,但總的來說,尚無理想的抗凝血藥供臨床使用;抗血小板藥包括環(huán)氧酶抑制劑,TXA2受體阻滯劑和TXA2合成酶抑制劑,血小板GPⅡb/Ⅲa受體阻滯劑等。此類藥物或作用不強,或半衰期太短,或無法口服等,限制其廣泛應用;纖維蛋白溶解藥包括第1代的鏈激酶、尿激酶等,第2代的t-PA、阿尼普酶等,第3代制劑如改造野生型t-PA、組建嵌合型溶栓劑、單克隆抗體導向溶栓劑、葡萄糖球菌激酶等。此類藥物雖經歷3代的研制和發(fā)展,溶栓效果和特異性逐漸有所改善,但尚未取得本質性和突破性進展,有不同程度的出血、再灌注損傷、過敏反應等副作用和溶栓后再栓塞等缺陷,以及用藥時機和劑量不宜掌握等問題。因此,研究有效、安全、適于長期使用的口服抗血栓藥物具有重要意義。本實驗結果表明,檳榔堿的抗血栓作用機制是促進內皮細胞釋放PGI2等抑栓物質而通過舒張血管、抑制血小板聚集,加快淤滯的血流等環(huán)節(jié)起到抗血栓形成作用;促進內皮細胞釋放t-PA,抑制PAI-1的活性,而間接激活纖溶系統