雞堆型艾美耳球蟲的分離鑒定

雞堆型艾美耳球蟲的分離鑒定

雞球蟲是影響雞場健康發(fā)展的最重要寄生蟲。蠕蟲是1929年飼養(yǎng)雞場最常見的昆蟲之一，分布廣泛。為對(duì)堆型艾美耳球蟲的生物學(xué)特性有進(jìn)一步的了解,我們從長春市區(qū)某雞場采集的混合感染球蟲樣品中,分離獲得了堆型艾美耳球蟲純種,并對(duì)其致病性進(jìn)行了觀察,建立的純種毒株既為藥物的療效試驗(yàn)和免疫研究中的提供攻毒蟲體,也為球蟲致弱苗研究提供原代種蟲。本文就來自長春市堆型艾美耳球蟲純種的分離鑒定和致病性觀察情況進(jìn)行報(bào)道。1材料和方法1.1球卵囊的分離培養(yǎng)從長春市某雞場死于球蟲病的雞腸道內(nèi)容物中,按常規(guī)方法分離出球蟲卵囊,加入2.5%重鉻酸鉀溶液置于29℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)至孢子化,獲得混合球蟲卵囊。1.2試驗(yàn)動(dòng)物海蘭公雞,購自長春市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。出殼后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,飼養(yǎng)在經(jīng)火焰消毒的籠具中。飼料、飲水、食槽等用具均高溫消毒。1.3引物、培養(yǎng)、分離取混合種卵囊液離心洗凈重鉻酸鉀,計(jì)數(shù),按每只雞1個(gè)孢子化卵囊經(jīng)口接種于10日齡雛雞,接種后7d剖殺雞,取十二指腸和小腸前段內(nèi)容物,分離卵囊,培養(yǎng)至孢子化備用。1.4個(gè)卵囊的確定和喂給參照黃兵等報(bào)道方法,制備1%的瓊脂,溶解后澆在載玻片上,厚約1.5mm。用牙簽沾取初次分離卵囊稀釋液輕輕涂在瓊脂塊表面,在10×10倍鏡下確定為單個(gè)卵囊時(shí),后用自制的安裝在顯微鏡上的打孔器切割瓊脂,用細(xì)針頭將切割的小塊瓊脂移置另一載玻片上,再次用10×40鏡檢確定單個(gè)卵囊后,經(jīng)口喂給2日齡無球蟲雛雞,并滴入1-3滴蒸餾水,促其吞咽。感染后5d逐只查糞便,發(fā)現(xiàn)卵囊即為單卵囊后代,分離培養(yǎng)至孢子化。1.5腸道生殖發(fā)育特點(diǎn)對(duì)單卵囊繁殖的后代,接種無球蟲雛雞進(jìn)行增殖,并根據(jù)其在腸道寄生部位、肉眼病變、潛伏期(卵囊最早排出時(shí)間),卵囊最短孢子化發(fā)育時(shí)間。卵囊和孢子囊的大小、形狀、結(jié)構(gòu)等指標(biāo)。對(duì)照國內(nèi)外文獻(xiàn),確定蟲種,進(jìn)行繁殖。1.6組堆型艾美爾球蟲子化卵囊感染后1周后情況比較選擇2周齡無球蟲感染、體重相近的海蘭公雞50只,隨機(jī)分成5組,即1個(gè)不感染組和4個(gè)感染組。除不感染組外,其余4組,每只口服感染1×104,2×104,5×104和10×104個(gè)堆型艾美爾球蟲孢子化卵囊。感染后1周結(jié)束試驗(yàn),以平均增重、死亡率、病變記分作為試驗(yàn)指標(biāo),并對(duì)各組增重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。腸道病變記分參照J(rèn)ohnson和Reid(1970)標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果2.1感染雞卵囊的鑒定分離獲得的球蟲主要寄生在十二指腸和小腸前段,致病力中等,引起腸壁增厚。嚴(yán)重感染時(shí)亦擴(kuò)展到小腸,從十二指腸到小腸前段漿膜面可見到成片多量灰白色橫紋狀白斑,外觀呈現(xiàn)階梯狀,腸黏膜面和漿膜面有大量的出血點(diǎn)。腸內(nèi)含有大量粘稠的分泌物。取腸內(nèi)容物和腸黏膜刮取物鏡檢,卵囊為卵圓形,卵囊壁光滑,呈淡綠黃色,囊壁分二層,厚約1.01μm。卵囊窄端內(nèi)壁變薄,形成極孔,1個(gè)折光性強(qiáng)的極粒在其附近,少數(shù)2個(gè),無卵囊殘?bào)w。測(cè)200個(gè)卵囊的平均大小為(13.5-21)×(11-17.5)μm,平均為17.5×14.5μm,形態(tài)指數(shù)為1.21。測(cè)200個(gè)孢子囊大小為(4.6-9.5)×(3.5-6.5)μm,孢子囊有斯氏體,無殘?bào)w。用此卵囊人工感染雛雞,在感染后97h糞中查到少量卵囊,此卵囊在2.5%重鉻酸鉀溶液中,置于29℃恒溫培養(yǎng)18h,見到孢子化完全的卵囊,并感染雛雞獲得成功。根據(jù)上述結(jié)果,對(duì)照國內(nèi)外文獻(xiàn),確定該種為堆型艾美耳球蟲(EimeriaacervulinaTyzzer1929)。2.2疾病觀察2.2.1雞的一般情況感染初期,各組試驗(yàn)雞精神、飲食欲無明顯的異常。感染后84h,接種堆型艾美耳球蟲卵囊5×104和10×104兩組雞表現(xiàn)為飲食欲減少,羽毛逆立,糞便變稀,其它組試驗(yàn)雞無明顯癥狀;感染后144h,感染各組均出現(xiàn)明顯的臨床癥狀,糞便開始變稀不成形,帶有大量粘液,部分試驗(yàn)雞糞便帶血。除感染10×104組雞死亡2只外,整個(gè)試驗(yàn)其它各組雞未發(fā)生死亡。2.2.2組患者各感染組間比較試驗(yàn)各感染組雞在感染后7d內(nèi)的平均增重量不一,試驗(yàn)各感染組的平均增重都不同程度地低于對(duì)照組。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,1×104、2×104組與對(duì)照組之間差異顯著(P<0.05),5×104和10×104組與對(duì)照組之間差異極顯著(P<0.01)。各感染組間相比,1×104、2×104組與5×104和10×104組之間差異顯著(P<0.05)。由此可見堆型艾美耳球蟲對(duì)增重影響比較明顯,隨著感染劑量的增加,增重明顯減少。2.2.3腸道病變的程度試驗(yàn)各組感染雞,病理剖檢均觀察到不同程度的腸道病變,隨著感染劑量的增加,病灶數(shù)量也相對(duì)增多,十二指腸和小腸前段腫脹,粘膜明顯增厚。病變記分結(jié)果見表1。3種球蟲屬e.常見艾美耳球蟲3.1堆型艾美耳球蟲(E.acervulina)顯著的特征是寄生在十二指腸和小腸前段,嚴(yán)重感染時(shí)漿膜面可見到成片多量灰白色橫紋狀白斑,外觀呈現(xiàn)階梯狀。我們分離獲得的這株球蟲具有此特征,其卵囊結(jié)構(gòu)、測(cè)得的卵囊和孢子囊大小、卵囊形狀指數(shù)、潛隱期和孢子發(fā)育最早時(shí)間均在文獻(xiàn)記錄的范圍。因此,可鑒定這株純種球蟲為堆型艾美耳球蟲(EimeriaacervulinaTyzzer1929)。3.2堆型艾美耳球蟲(E.acervulina)的致病性在不同地方株之間有明顯差異。本次分離獲得的純種堆型艾美耳球蟲,是雞場最常見的球蟲種類之一,有一定的致