實(shí)驗(yàn)三 單向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)

單向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)江南大學(xué)微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室教學(xué)對(duì)象：強(qiáng)化班學(xué)生實(shí)驗(yàn)課時(shí)：3學(xué)時(shí)課程類型：專業(yè)實(shí)驗(yàn)課課程要求：必修每組人數(shù)：4人實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求掌握單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的原理、結(jié)果分析及應(yīng)用實(shí)驗(yàn)原理：將適量的抗體均勻混入瓊脂內(nèi)制成瓊脂板，打孔，在孔中加入一定量的待測(cè)抗原，抗原向四周呈輻射狀擴(kuò)散，與抗體相遇，在比例合適時(shí)形成白色沉淀環(huán)。沉淀環(huán)直徑的大小與抗原含量成正比，用標(biāo)準(zhǔn)抗原或國(guó)際參考蛋白制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上，可以查出待檢樣品中抗原的含量。本試驗(yàn)主要用于檢測(cè)標(biāo)本中各種免疫球蛋白和血清中各種補(bǔ)體成分的含量，敏感性很高。

單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)試劑與器材羊抗人IgG血清待檢人血清標(biāo)準(zhǔn)參考血清pH7.40.01MPBS緩沖液瓊脂粉載玻片、打孔器、37℃恒溫箱、濕盒、可調(diào)微量加樣器等；單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備1．制作瓊脂板所需要的1.5%離子瓊脂，首先分裝其1/2量的3%鹽水瓊脂，溶化后置56℃水浴中平衡溫度備用。2．稀釋抗體，用pH7.4的PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)抗人IgG抗體，使最終濃度為抗體效價(jià)的一倍，其分裝量應(yīng)與3%鹽水瓊脂量相等。3．制備瓊脂板：將已稀釋的抗人IgG抗體于56℃水浴中預(yù)熱，再傾注于已溶化并維持56℃的3%鹽水瓊脂中混勻，取5ml即刻傾注于玻片上，待凝固后即可。4．打孔：將瓊脂板置于模板上，在同一直線上用打孔器打孔4個(gè)，孔距10mm。單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備5．用PBS緩沖液稀釋不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)參考蛋白：濃度分別為800mg/L、400mg/L、200mg/L、100mg/L。6．加樣：將已稀釋的不同濃度的工作標(biāo)準(zhǔn)蛋白依次用微量加樣器每孔加入10ul。（注意：每一稀釋度均應(yīng)更換塑料吸頭）。7．將加樣的瓊脂板放濕盒中，置37℃溫箱，24小時(shí)后觀察結(jié)果。8．用尺子測(cè)量并記錄沉淀環(huán)直徑，然后以沉淀環(huán)