醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實驗：實驗五 細(xì)胞的傳代、復(fù)蘇與凍存實驗

實驗五細(xì)胞的傳代、復(fù)蘇與凍存實驗實驗?zāi)康牧私夂驼莆占?xì)胞傳代培養(yǎng)的方法及技術(shù)，觀察體外細(xì)胞的形態(tài)及生長情況。了解和掌握細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的原理和方法，能獨立完成操作。細(xì)胞穿代實驗原理一些血清蛋白和培養(yǎng)細(xì)胞的膜表面黏附蛋白參與了細(xì)胞與細(xì)胞之間及細(xì)胞與培養(yǎng)瓶的黏附，使細(xì)胞貼壁生長及互相連接成片。用胰蛋白酶分解這些蛋白可以使細(xì)胞間連接斷裂，細(xì)胞與培養(yǎng)瓶底部分開。細(xì)胞凍存與復(fù)蘇實驗原理在低于-70℃的超低溫條件下，細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極為緩慢，甚至終止。因此，采取適當(dāng)?shù)姆椒▽⑸锊牧蠝囟冉抵脸蜏貤l件，即可使生命活動固定在某一階段而不衰老死亡。當(dāng)以適當(dāng)?shù)姆椒▽龃娴纳矬w恢復(fù)至常溫時，其內(nèi)部的生化反應(yīng)又可恢復(fù)正常。細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的原則是“慢凍快融”，這樣可以使細(xì)胞較好的存活。溫度由-1℃、-25℃、-80℃之后放入液氮內(nèi)（-196℃）。凍存時為了減少冰晶對細(xì)胞的損傷，常常加入5%～15%的甘油或二甲亞砜（DMSO）。這兩種物質(zhì)在低溫下對細(xì)胞沒有明顯毒性，而且分子小，溶解度大，易于穿透細(xì)胞，可以使冰點下降，提高細(xì)胞膜對水的通透性；加上緩慢冷凍方法可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲透到細(xì)胞外，在細(xì)胞外形成冰晶，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少形成冰晶所造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇時把裝有細(xì)胞的凍存管直接放入37℃水浴中迅速解凍，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)融化，避免緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損害。細(xì)胞凍存與復(fù)蘇實驗原理實驗用品和材料

材料：融合度達(dá)到80%~90%的貼壁生長細(xì)胞。試劑：（1）DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液（2）DMEM完全培養(yǎng)液（DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液90%，小牛血清10%，雙抗1%）（3）胰蛋白酶（4）凍存保護(hù)液（血清：DMEM：DMSO=2:7:1）用品：普通冰箱、-20℃低溫冰箱、-80℃超低溫冰箱、液氮凍存罐、離心機、水浴鍋、凍存管（滅菌）操作步驟

1.準(zhǔn)備工作：（1）用酒精擦拭生物安全柜的操作臺面（2）將實驗中所需要物品（如加樣槍、槍頭盒、移液管、電動移液槍、培養(yǎng)品等）置于生物安全柜中，開紫外線燈照射20min

（3）關(guān)紫外燈，并通風(fēng)5min操作步驟

2.清洗去除培養(yǎng)液及死亡細(xì)胞：取出培養(yǎng)瓶，先吸棄原有的培養(yǎng)液，用5mLPBS清洗培養(yǎng)物2次，以盡量去除培養(yǎng)液中的血清成分和死亡細(xì)胞。操作步驟

3.酶消化：加入2ml含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液，置于37度培養(yǎng)箱中孵育0.5～1min左右，取出并于倒置顯微鏡下監(jiān)測消化情況，待細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞之間間隙增大、細(xì)胞近乎縮成圓球形時即可。注意細(xì)胞不要消化過度操作步驟

4.終止消化：當(dāng)確認(rèn)消化完全時，加入5ml新鮮的完全培養(yǎng)液終止消化。操作步驟

5.收集細(xì)胞：用吸管吸取培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，有次序地沖洗培養(yǎng)瓶底部，使90%以上的細(xì)胞與培養(yǎng)容器底部脫離，并充分分散成團(tuán)細(xì)胞（成團(tuán)細(xì)胞生長不良）。但吹打動作不宜過猛，吹出液體力度適中，并避免產(chǎn)生氣泡，否則會損傷細(xì)胞。操作步驟

6.分割培養(yǎng)：一般按1:2或1:3接種（即一個培養(yǎng)瓶中消化下來的細(xì)胞接種于2個或3個同樣大小的培養(yǎng)瓶中），置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，寫記號。注意：將第5步收集的細(xì)胞一半用于傳代，一半用于細(xì)胞凍存。操作步驟

傳代具體操作：一半細(xì)胞于1000rpm，離心5min，離心結(jié)束后棄去上清，加新鮮培養(yǎng)液DMEM5mL重懸細(xì)胞，然后置于培養(yǎng)瓶中，于安全柜臺面仔細(xì)回復(fù)搖勻細(xì)胞，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。明日1:30~2:30觀察細(xì)胞生長貼壁情況。操作步驟

細(xì)胞凍存實驗1、收集細(xì)胞。取1支15mL離心管，將培養(yǎng)瓶中細(xì)胞收集另一半細(xì)胞，1500r/min離心8min，棄上清液。操作步驟

2、用1mL凍存保護(hù)液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入經(jīng)檢查無破裂的凍存管中。凍存液的配置：20%血清、10%DMSO、70%培養(yǎng)液;或90%血清、10%DMSO

操作步驟3、封口。一般用Parafilm封口膜，撕開纏繞幾圈。操作步驟4、寫標(biāo)簽，寫上細(xì)胞名稱，凍存日期，姓名。操作步驟5、凍存。4℃冰箱20~30min；-20℃低溫冰箱30min~1h；-80℃冰箱中或液氮罐中。液氮罐保存時先放在液氮灌口蒸汽中1~2min，再沉入液氮中，封好液氮灌口，將液氮罐放置在陰涼處。也可用20層紗布包裹或放入厚壁泡沫盒中，直接置于-80℃冰箱中凍存24h再投入液氮中。學(xué)生實驗用-80℃冰箱保存即可，保存時間超過一個月不會引起活力下降。操作步驟

細(xì)胞復(fù)蘇實驗1、復(fù)溫。從液氮中取出凍存管，立即在37℃溫水中快速晃動1~2min，直至凍存液完全溶解。操作步驟

2、吸取凍存保護(hù)液。將細(xì)胞凍存懸液移入帶蓋離心管中；加入約5mL培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻；1000r/min離心5min，棄去上清液。操作步驟

3、檢查細(xì)胞活率。用1mL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，取90uL細(xì)胞液，加10uL臺盼藍(lán)染料，用臺盼藍(lán)檢查細(xì)胞存活率，并計算存活率。操作步驟

收尾：（1）將廢液倒掉，用過的移液管與槍頭丟棄（2）將生物安全柜中其它物品擺放整齊（2）用酒精噴壺消毒，并擦拭干凈（3）開紫外燈滅菌20min注意事項注意操作的規(guī)范，避免污染，心中有無菌操作概念使用酒精燈，注意安全，特別要防止手套著火移液槍的使用方法，避免液體倒吸消化過度會損傷細(xì)胞，使其不能再次貼壁生長；消化不足則導(dǎo)致細(xì)胞難以從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣會損傷細(xì)胞思考題用酶消