燒傷后淋巴細(xì)胞功能改變及il-2、il-10分泌機制的研究

燒傷后淋巴細(xì)胞功能改變及il-2、il-10分泌機制的研究

燒傷后的免疫功能變化包括兩個方面：免疫抑制和非特異性炎癥反應(yīng)，以及細(xì)胞免疫功能的受限制。此外，它也是燒傷后體免疫功能低下、并發(fā)癥和其他并發(fā)癥的重要原因。特異性細(xì)胞免疫功能受抑包括T細(xì)胞經(jīng)抗原刺激增殖能力下降,IL-2分泌降低等。但對其發(fā)生機制,目前尚不清楚。本研究從T細(xì)胞活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑入手,對傷后T細(xì)胞功能受抑和IL-2、IL-10分泌改變進(jìn)行探討。材料和方法一、小鼠格氏針病昆明小鼠60只,雌雄各半、體重23～26g,隨機分為正常對照、傷后2、12、24、96、168h共6組,每組10只。將小鼠背部剪毛,清醒狀態(tài)下高壓熱蒸汽造成18%TBSAⅢ度燙傷(病理切片證實)。傷后即腹腔注射等滲鹽水3ml預(yù)防休克,各組動物于相應(yīng)時相點腋動脈放血處死,無菌制備脾淋巴細(xì)胞懸液。二、t淋巴結(jié)分離參照文獻(xiàn)方法,以尼龍毛纖維分離細(xì)胞懸液中的T細(xì)胞,酸性α-醋酸萘酯酶染色,96%以上為T細(xì)胞,臺盼藍(lán)染色,95%以上為活細(xì)胞。三、采用ph7.2試驗,加二抗相應(yīng)基因型mdp-hamsterigg檢測1.流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞表面分子TCRα/β及CD28:取調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml分離純化的T細(xì)胞懸液1ml,以1400r/min離心5min,去上清,以冷磷酸鹽緩沖液(pH7.2)200μl洗滌,去上清,加入Anti-MiceTCRα/βFITC(美國,Sigma公司)4μl,陰性對照加入小鼠IgG,輕輕吹打混勻,置4℃避光孵育30min,離心,棄上清,反復(fù)洗滌2次,向壓積細(xì)胞中加入相同緩沖液1ml,吹打混勻后檢測。間接法測定CD28分子:一抗為Purifiedanti-mouseCD28(HamsterIgG),加二抗FITClabeledanti-hamsterIgG2μl,4℃下避光孵育30min后,以冷磷酸鹽緩沖液(pH7.2)200μl洗滌2次后,再加相同緩沖液1ml,吹打混勻后檢測。2.活化T細(xì)胞膜GTPase、膜PTK、轉(zhuǎn)膜PKC活性測定:取1ml分離純化調(diào)濃度至3×106/ml的T細(xì)胞懸液,ConA5×10-3g/L刺激15min,離心去上清液,加入GTPase分離液(10mmol/LHepes,1mmol/LEGTA,1mmol/LGDP,1mmol/LDFP,50×10-3g/Lleupeptin,0.25mol/L蔗糖,pH7.5)2ml,4℃下37000×g離心60min,棄上清,沉淀用4℃分離液1ml重新懸浮?？捡R斯亮藍(lán)G-250測定蛋白含量,參照文獻(xiàn)方法測定GTPase活性。活化T細(xì)胞膜PTK及轉(zhuǎn)膜PKC活性測定按文獻(xiàn)方法進(jìn)行。膜PTK分離液[20mmol/LMg(AC)2,5mmol/LNaF,0.2mmol/LEDTA,1.0mmol/LDTT,質(zhì)量濃度為0.5%的NP-40],膜PKC分離液(10mmol/LTris-HCl,50mmol/Lβ2-ME,1mmol/LPMSF,1mmol/LEGTA,2.5mmol/LMgCl2,體積分?jǐn)?shù)為0.1%TritonX-100,0.34mol/L蔗糖,pH7.5)。測定用γ-32P-GTP,γ-32P-ATP均為北京亞輝公司產(chǎn)品。3.T細(xì)胞分泌IL-2、IL-10含量測定:各取5×106/ml純化T細(xì)胞懸液0.5ml加入10g/LConA0.5ml混勻,在體積濃度為5%的CO2、37℃的孵箱中培養(yǎng)24h,離心收集上清,用ELISA法測定IL-2、IL-10含量,其試劑購自深圳晶美公司。4.MTT比色法測定T淋巴細(xì)胞增殖能力,按參考文獻(xiàn)進(jìn)行。四、處理數(shù)據(jù)結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示,以方差齊性檢驗結(jié)合t檢驗,進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果1.cd28傷前后cd2比較與正常對照相比,燒傷后T細(xì)胞表面分子TCRα/β呈不同程度降低,以傷后24～96h最為明顯,CD28傷后陽性表達(dá)亦降低,且降低時相明顯早于TCRα/β,傷后12h即已明顯降低,并持續(xù)到傷后96h(表1)。2.變化時，各變化均有變化與正常對照相比,燒傷后T細(xì)胞GTPase、PTK活性均出現(xiàn)降低,變化趨勢亦非常一致。傷后2h即明顯降低,傷后12、24h降低非常顯著,96h以后開始回升,但轉(zhuǎn)膜PKC活性卻出現(xiàn)先降低(傷后2～12h),后升高(96～168h)的雙相改變(表2)。3.傷后24h、97h與正常對照組相比較,燒傷后小鼠脾T細(xì)胞增殖能力減弱,明顯減弱出現(xiàn)于傷后12h,傷后24、96h顯著減弱。IL-2的分泌量傷后明顯降低,傷后24～168h降低有非常顯著性意義(P<0.001),IL-10的分泌出現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢,降低出現(xiàn)于傷后2～96h,升高出現(xiàn)在傷后168h以后(表3)?？缒ば盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)嚴(yán)重?zé)齻蓪?dǎo)致機體嚴(yán)重免疫紊亂,即特異性細(xì)胞功能受抑和非特異性炎性反應(yīng)亢進(jìn)兩方面。其中特異性細(xì)胞免疫功能受抑以T細(xì)胞功能受抑為顯著,可表現(xiàn)為T細(xì)胞經(jīng)絲裂原活化后的增殖能力降低,IL-2生成減少。IL-10又稱為細(xì)胞因子合成阻抑因子,它能阻止TH1細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ、IL-2和其它細(xì)胞因子,能通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)單核細(xì)胞MHCII類抗原表達(dá),抑制單核細(xì)胞的抗原呈遞能力,從而阻止抗原特異性T細(xì)胞的增殖。T細(xì)胞經(jīng)TCR和CD28接受抗原呈遞細(xì)胞(APC)傳導(dǎo)刺激后,經(jīng)跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo),在胞內(nèi)通過第二信使或(/和)多種信號途徑將信號傳入核內(nèi),開放或關(guān)閉、增強或減弱基因表達(dá),從而影響細(xì)胞功能活性。由此可知,T細(xì)胞表面分子和跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是T細(xì)胞活化和執(zhí)行功能所需的必經(jīng)信號通路,其發(fā)生改變將導(dǎo)致T細(xì)胞的功能異常。本實驗結(jié)果表明,燒傷T細(xì)胞重要的胞外信號接收和傳遞分子TCRα/β及T細(xì)胞活化必不可少的共刺激分子CD28的表達(dá)均明顯降低,尤其是CD28分子,傷后2h即已明顯降低。提示燒傷后早期T細(xì)胞功能受抑和IL-2、IL-10分泌降低與此相關(guān)。參與跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的GTPase、PTK及轉(zhuǎn)膜PCK傷后早期活性降低,同樣也是傷后IL-2分泌降低和傷后早期IL-10分泌降低的重要原因;傷后96h膜PKC活性升高,主要由兩方面的原因造成:(1)轉(zhuǎn)膜PKC的酶量增加,(2)轉(zhuǎn)膜PCK本身活性增加。無論何種原因,96h后膜PKC活性升高,可活化更多的PKC下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,則可能是形成96h后IL-10分泌異常升高的重要原因之一。信