神經(jīng)干細(xì)胞移植治療顳葉癲癇的療效觀察

神經(jīng)干細(xì)胞移植治療顳葉癲癇的療效觀察

目前，癲癇的手術(shù)通常采用手術(shù)切除海瑞。海瑞是大腦的重要結(jié)構(gòu)，具有調(diào)節(jié)情緒和內(nèi)臟活動(dòng)，維持基本生活等功能。因此,手術(shù)切除會(huì)導(dǎo)致部分患者不同程度的神經(jīng)功能受損甚至缺失。因此,尚須探索新的方法以提高顳葉癲癇的治療效果。顳葉癲癇主要是由于海馬神經(jīng)元減少導(dǎo)致抑制性神經(jīng)遞質(zhì)氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)減少引起的,這一觀點(diǎn)目前已得到共識(shí)。因此,我們?cè)趪?guó)際上首先提出并利用神經(jīng)干細(xì)胞移植的方法增加海馬神經(jīng)元的數(shù)量,以恢復(fù)抑制性和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的平衡,達(dá)到治療顳葉癲癇的目的,現(xiàn)報(bào)告如下。材料和方法一、材料表面1.成年男性wirt大鼠的飼養(yǎng)孕17d的Wistar大鼠和體質(zhì)量200g的健康成年雄性Wistar大鼠,由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供并采取自由進(jìn)食水、自然晝夜的方法飼養(yǎng)。2.試劑和儀器海人酸(kainicacid,KA)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermalgrowthfactor,EGF)、5-溴脫氧尿苷(bromodeoxyuridine,BrdU)購于美國(guó)Sigma公司,堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)、腦源性神經(jīng)因子(brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)、NGF和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)抗體購于英國(guó)PeproTech公司。DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)為Gibco公司產(chǎn)品,神經(jīng)巢蛋白(nestin)、神經(jīng)元烯醇化酶(neuronspecificenolase,NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)和半乳糖腦苷脂酶(galactocerebrosidase,GalC)抗體購自Pharmingen公司,免疫組化染色試劑盒購于中山公司,B27、多聚賴氨酸和胰蛋白酶購于國(guó)內(nèi)生物試劑公司。PBS緩沖液自行配制。3.型連續(xù)變倍體視顯微鏡及立照鏡SA-300V型全自動(dòng)高壓滅菌儀(臺(tái)灣STURDY公司),EASYpureUV/UF型自動(dòng)超純水儀(美國(guó)BT公司),XTS20型連續(xù)變倍體視顯微鏡(北京泰克公司),BB5060UV型二氧化碳培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司),TE2000-U型相差倒置顯微鏡及全自動(dòng)照相裝置(日本Nikon公司)。立體定向儀為國(guó)營(yíng)西北光學(xué)儀器廠生產(chǎn),WZ-50型微量注射機(jī)由浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn),ML118型腦電圖儀為澳大利亞AD儀器公司生產(chǎn),1720DIGITAL型LEITZ冰凍病理切片機(jī)由德國(guó)生產(chǎn)。二、方法1.模型制備和分組用10%水合氯醛1ml腹腔內(nèi)注射麻醉后,將大鼠固定于立體定向儀上。確定海馬的三維坐標(biāo):X=-5.3mm,Y=4.0mm,Z=-6.0mm,即海馬區(qū)給藥點(diǎn)。按5μg/kg體質(zhì)量計(jì)算,微量注射器內(nèi)抽入濃度為0.4μg/μl的KA2.5μl。調(diào)整微量注射機(jī)的注射速度,使2.5μl的KA在10min內(nèi)緩慢勻速地注射完畢,留置3min后退出注射針。共制備大鼠癲癇模型140只,分為未移植癲癇大鼠30只,移植神經(jīng)干細(xì)胞的癲癇大鼠80只,移植培養(yǎng)基的癲癇大鼠30只。7只正常大鼠(用以測(cè)定大鼠海馬內(nèi)GABA的正常值)。2.馬組織病理學(xué)檢測(cè)取出孕17dWistar大鼠的胚胎,在連續(xù)變倍體視顯微鏡下快速分離出海馬組織,機(jī)械消化、胰蛋白酶消化后,通過100目的濾網(wǎng),用含F(xiàn)BS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止消化。用基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌離心后,用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。按1.5×104/ml的細(xì)胞接種密度,將細(xì)胞移入15cm2培養(yǎng)瓶中連續(xù)增殖培養(yǎng)。3.干預(yù)神經(jīng)干的誘導(dǎo)和標(biāo)記將前述分離培養(yǎng)3d的海馬神經(jīng)干細(xì)胞移入含NGF、EGF、bFGF和BDNF的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2d后,并用BrdU標(biāo)記。4.海馬區(qū)移植點(diǎn)的確定用10%水合氯醛1ml腹腔內(nèi)注射麻醉后,將大鼠固定于立體定向儀上。剪除大鼠頭頂部毛發(fā)并用75%酒精消毒處理。沿大鼠頭頂部正中線切開頭皮,用頭皮拉鉤將左右兩側(cè)的頭皮對(duì)稱地向兩側(cè)拉開并固定。按上述標(biāo)準(zhǔn)確定海馬區(qū)移植點(diǎn)。首先調(diào)整X軸和Y軸的坐標(biāo),使定位針的尖端位于三維坐標(biāo)系的H點(diǎn),H點(diǎn)的坐標(biāo)為:X=-5.3mm,Y=4.0mm,Z=0mm;第二步,在微量注射器內(nèi)抽入前述分離培養(yǎng)、預(yù)誘導(dǎo)和標(biāo)記BrdU的神經(jīng)干細(xì)胞單細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)為75000～125000/μl)10μl。然后調(diào)整Z軸的坐標(biāo),使Z軸的坐標(biāo)為-6.0mm,即向下進(jìn)針達(dá)海馬移植部位;第三步,調(diào)整微量注射機(jī)的注射速度,使10μl的神經(jīng)干細(xì)胞單細(xì)胞懸夜在10min內(nèi)緩慢勻速地注射完畢,留置3min后退出注射針。然后全層縫合頭皮。5.模型總癲癇測(cè)定移植后的癲癇大鼠分別在飼養(yǎng)1w、2w、3w和4w時(shí),隨機(jī)選取7只,向海馬內(nèi)定向注射KA誘發(fā)癲癇,測(cè)定引起發(fā)作所需KA的最低量值。6.海馬組織中g(shù)aba的測(cè)定移植后的癲癇大鼠在飼養(yǎng)1w、2w、3w和4w時(shí),隨機(jī)選取7只斷頭處死。完整分離出移植側(cè)的海馬組織,0.4mol/L的高氯酸勻漿、冰浴、離心處理后,取上清液,用20mol/LKHCO3中和、離心。采取反相高效液相色譜熒光法,利用熒光檢測(cè)器測(cè)定海馬組織中GABA的水平。同時(shí)在1w、2w、3w和4w時(shí)分別隨機(jī)選取7只未移植的癲癇大鼠和7只移植培養(yǎng)基的癲癇大鼠,測(cè)定GABA水平,作為對(duì)照。7.腦聚甲醛用量的測(cè)定移植后的癲癇大鼠在飼養(yǎng)1w、2w、3w和4w時(shí)心臟灌注生理鹽水100ml及4%多聚甲醛250ml后取腦,并保存在-75℃。常規(guī)冷凍切片,厚度25μm,進(jìn)行BrdU與nestin、GFAP、GABA、NSE、GalC的免疫組化雙染色,觀察移植的神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和存活情況。8.兩組統(tǒng)計(jì)學(xué)處理比較利用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理,組間比較采用方差檢驗(yàn)(F-test),P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果一、神經(jīng)干細(xì)胞癲癇模型移植后1w、2w、3w和4w的癲癇大鼠誘發(fā)癲癇發(fā)作的平均最低閾值分別為6.77、9.74、10.23和11.01μg/kg體質(zhì)量,變化曲線見圖1?？梢钥吹?移植神經(jīng)干細(xì)胞后,癲癇最低閾值均高于模型對(duì)照組,并隨移植時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步上升。但未達(dá)到正常水平。二、移植神經(jīng)干細(xì)胞組與移植培養(yǎng)基組、未移植組之間的相關(guān)性1w、2w、3w和4w時(shí),移植神經(jīng)干細(xì)胞、移植培養(yǎng)基及未移植的癲癇大鼠每克海馬組織內(nèi)GABA的測(cè)定結(jié)果如下:1w、2w、3w和4w時(shí),移植神經(jīng)干細(xì)胞組與移植培養(yǎng)基組、未移植組之間存在差異(P<0.05);2w時(shí)移植神經(jīng)干細(xì)胞組與移植培養(yǎng)基組、未移植組之間存在顯著性差異(P<0.01);而1w、2w、3w和4w時(shí),移植培養(yǎng)基組與未移植組之間均無明顯差異(P>0.05)。不同時(shí)間點(diǎn),三組海馬GABA含量的變化曲線見圖2。三、brd與nse和gaba的雙染雙染結(jié)果BrdU與Nestin、GFAP和GalC的雙染結(jié)果為陰性,BrdU與NSE和GABA的雙染結(jié)果為陽性。由此可見,移植后的預(yù)誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞在海馬內(nèi)全部發(fā)生分化為GABA能神經(jīng)元,即NSE和GABA陽性細(xì)胞(圖3)。神經(jīng)干細(xì)胞移植癲癇在我國(guó)的患病率為7‰,約有900余萬人。其中多數(shù)為部分性癲癇,而部分性癲癇中又以顳葉癲癇最為多見。目前對(duì)于顳葉癲癇多采用手術(shù)治療的方法,手術(shù)方法主要有選擇性杏仁-海馬切除術(shù)、前顳葉切除術(shù)、顳葉內(nèi)側(cè)結(jié)構(gòu)切除術(shù)等,手術(shù)的目的是切除產(chǎn)生癲癇放電的海馬結(jié)構(gòu)。眾所周知,海馬是腦內(nèi)的重要結(jié)構(gòu),具有參與記憶、調(diào)節(jié)情緒和內(nèi)臟活動(dòng)以及維持基本生存等功能。因此,手術(shù)切除海馬結(jié)構(gòu),雖然多數(shù)患者在術(shù)后配合抗癲癇藥物治療下,可由難治性癲癇變?yōu)樗幬锟芍涡园d癇,但會(huì)產(chǎn)生一定程度的神經(jīng)功能受損甚至缺失。不難看出,手術(shù)是一種治標(biāo)(切除非功能區(qū)癲癇放電結(jié)構(gòu))而非治本的方法。既然顳葉癲癇是由于海馬神經(jīng)元的變性、壞死、數(shù)量減少導(dǎo)致抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的減少引起的,我們?cè)O(shè)想能否用移植的方法增加海馬神經(jīng)元的數(shù)量,以恢復(fù)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的平衡,從而達(dá)到治療顳葉癲癇的目的。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)是一個(gè)相對(duì)的“免疫豁免區(qū)”,這為神經(jīng)組織、神經(jīng)細(xì)胞的腦內(nèi)移植打開了大門。神經(jīng)組織、神經(jīng)細(xì)胞腦內(nèi)移植的實(shí)驗(yàn)研究已開展多年,并且移植手段也比較成熟。但是由于移植物本身的性質(zhì)和移植物來源所帶來的倫理學(xué)問題,神經(jīng)組織、神經(jīng)細(xì)胞的移植一度陷入低潮。近十多年來,神經(jīng)干細(xì)胞的分離和成功培養(yǎng)是神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域最令人興奮的成就。神經(jīng)干細(xì)胞是一類具有多向分化潛能的細(xì)胞,可以自我復(fù)制,產(chǎn)生與自己相同的子代細(xì)胞,并且在一定的局部微環(huán)境中,在各種因素如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、生長(zhǎng)因子和粘附分子等作用下分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。目前,人們已成功從胎鼠、成年鼠以及人腦內(nèi)的海馬、室下區(qū)等部位分離培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞。成功分離和培養(yǎng)出的神經(jīng)干細(xì)胞被應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的移植。神經(jīng)干細(xì)胞的一個(gè)重要特點(diǎn)是:在腦內(nèi)根據(jù)其周圍微環(huán)境的誘導(dǎo)而分裂、分化為相應(yīng)的細(xì)胞類型,其形態(tài)和功能與附近的宿主細(xì)胞非常類似。此外,神經(jīng)干細(xì)胞在同種甚至異種之間移植也不會(huì)產(chǎn)生排斥反應(yīng)。因此大大擴(kuò)展了神經(jīng)干細(xì)胞的來源。國(guó)外的研究主要著眼于對(duì)神經(jīng)元損傷修復(fù)和退行性病變的治療上,尤其在神經(jīng)干細(xì)胞移植治療帕金森病方面已取得了許多成績(jī)。移植的神經(jīng)干細(xì)胞在腦內(nèi)可分化成多巴胺能神經(jīng)元,并能維持多巴胺的穩(wěn)定、高效表達(dá)。神經(jīng)干細(xì)胞移植治療帕金森病研究的成功為癲癇的治療提供了有益的借鑒。近十年的文獻(xiàn)檢索表明,神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)顳葉癲癇治療作用的研究國(guó)內(nèi)外尚無報(bào)道。美國(guó)學(xué)者利用基因工程技術(shù)建立了可分泌GABA的永生化細(xì)胞系,證明它可以控制癲癇發(fā)作。這也為神經(jīng)干細(xì)胞移植治療顳葉癲癇提供了有力的支持。因此,我們提出利用神經(jīng)干細(xì)胞移植來控制顳葉癲癇發(fā)作的新思路。我們從胚胎大鼠的海馬組織中分離和培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞,在實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定增殖的情況下,利用EGF、bFGF、BDNF、NGF等神經(jīng)因子,在體外誘導(dǎo)海馬神經(jīng)干細(xì)胞向GABA能神經(jīng)元的分化。經(jīng)過鑒定,海馬神經(jīng)干細(xì)胞在上述神經(jīng)因子的誘導(dǎo)下,完全分化形成了GABA能神經(jīng)元。說明在適宜的條件下,增加海馬神經(jīng)元的數(shù)量,以增加抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的數(shù)量,恢復(fù)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的平衡是可以實(shí)現(xiàn)的。從移植后的結(jié)果來看,癲癇大鼠的癲癇閾值在移植后開始逐步上升,說明神經(jīng)干細(xì)胞移植后,具有明顯的抗癲癇效果。為探討產(chǎn)生這種效果的內(nèi)在原因,我們對(duì)移植神經(jīng)干細(xì)胞后的癲癇大鼠海馬部位的GABA變化進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果顯示移植神經(jīng)干細(xì)胞后,海馬部位其含量逐漸增加,這種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)含量的增加使癲癇狀態(tài)下失去平衡的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)恢復(fù)了新的平衡,使癲癇的閾值逐漸增加,顳葉癲癇得到相當(dāng)?shù)目刂?。神?jīng)干細(xì)胞受微環(huán)境的誘導(dǎo)而分化形成不同的細(xì)胞類型,實(shí)際上,顳葉癲癇的海馬微環(huán)境中呈現(xiàn)的是海馬神經(jīng)元的調(diào)亡和膠質(zhì)細(xì)胞的增生,所以原始的神經(jīng)干細(xì)胞移植入顳葉癲癇的海馬后,因環(huán)境不利于神經(jīng)元的存活和生長(zhǎng),將主要分化形成膠質(zhì)細(xì)胞。因此,我們?cè)谝浦睬笆紫葘?duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行了向GABA能神經(jīng)元方向分化的體外預(yù)誘導(dǎo),然后再將其移植入顳葉癲癇大鼠的海馬部位。這些已經(jīng)啟動(dòng)了分化程序、并且被決定了分化命運(yùn)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞在顳葉癲癇的海馬部位將繼續(xù)分化下去,完成一個(gè)完整的分化過程。其體內(nèi)的分化結(jié)果實(shí)際上在移植前的體外就已經(jīng)被固定了。從細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)上的結(jié)果也證實(shí)了移植的海馬神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)全部分化形成了GABA能神經(jīng)元。從總體效果來看,神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)顳葉癲癇的治療是有效的。移植后的顳葉癲癇大鼠的癲癇閾值逐漸上升;海馬部位的GABA含量增加,在移植后2w達(dá)到最高,接近正常,然后略有下降,3w以后其含量呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢(shì)。在觀察期內(nèi),其值接近正常值,但尚未達(dá)到正常。其中可能有以下兩方面的原因,一方面可能是觀察的時(shí)間尚短,另一方面可能來源于顳葉癲癇的原因并非單一因素。雖然目前普遍認(rèn)為顳葉癲癇的原因主要是海馬神經(jīng)元的減少導(dǎo)致抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的減少,使抑制性神經(jīng)遞質(zhì)和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的比例失去平衡。但是,也有研究提示膠質(zhì)細(xì)胞增生、苔蘚發(fā)芽、異常興奮性環(huán)路(包括異常的自我興奮性環(huán)路)的形成也是顳葉癲癇的重要原因之一。實(shí)際上,正如癲癇的原因尚不完全清楚一樣,顳葉癲癇形成的原因也是觀點(diǎn)頗多,我們認(rèn)為顳葉癲癇的形成應(yīng)該是多種因素共同作用的結(jié)果。主要因素應(yīng)是普遍接受的海馬神經(jīng)元缺失,而苔蘚發(fā)芽和異常興奮性環(huán)路的形成也不可忽視。從本研究的結(jié)果來看,神經(jīng)干細(xì)胞移植實(shí)現(xiàn)了海馬神經(jīng)元的替代治療,起到了治療顳葉癲癇的作用,但并未達(dá)到根治的目的,考慮主要還是因?yàn)轱D葉