啤酒酵母蔗糖酶提取、分離純化、性質(zhì)鑒定及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

3,5-二硝基水楊酸比色定糖法工作曲線的制作葡萄糖含量（mg）0.000.40.81.22.02.83.64.0A5400.0000.0580.1620.2610.4370.6030.7370.8683,5-二硝基水楊酸比色定糖法工作曲線+A540一線性（A540）Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量工作曲線的制作標(biāo)準(zhǔn)液蛋白質(zhì)濃度（Ag/ml）0.004.178.3316.6725.0033.3341.67A6500.0000.0980.1690.3390.4510.5920.704Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量工作曲線.A650—線性（A650）0.8000.7000.6000.8000.7000.6000.5000.4000.3000.2000.1000.0000.005.0010.0015.0020.0025.0030.0035.0040.0045.00標(biāo)準(zhǔn)液蛋白質(zhì)濃度（Ag/ml）米氏常數(shù)1/A4.8763.9853.3702.8312.4602.0321.8311/S100.080.066.750.040.026.720.0正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：啤酒酵母蔗糖酶提取、分離純化、性質(zhì)鑒定及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、熟悉工作曲線的制作方法及注意事項(xiàng)；2、掌握3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色定糖的原理和方法；3、掌握Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法；4、掌握酶蛋白分離提純的原理；5、掌握酶的比活力測(cè)定及其計(jì)算方法；6、掌握酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)中用雙倒數(shù)法測(cè)定Km的方法；7、運(yùn)用正交試驗(yàn)法確定溫度、pH值、離子濃度的最適條件。二、實(shí)驗(yàn)原理1、蔗糖酶的提取細(xì)胞破壁：就酶在生物體內(nèi)的分布，可分為胞內(nèi)酶和胞外酶，蔗糖酶系胞內(nèi)酶。提取胞內(nèi)酶時(shí)，要破碎組織和細(xì)胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料稱為無細(xì)胞抽提液。材料不同，破壁的方法也不同。我們用的酵母菌細(xì)胞破壁方法有機(jī)械（勻漿）法、超聲波處理法、反復(fù)凍融法、化學(xué)處理法、溶胞作用（酶溶解法）、自溶法，本實(shí)驗(yàn)采用自溶法。自溶法即將新鮮的生物材料存放于一定的pH和適當(dāng)?shù)臏囟认拢?xì)胞結(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。2、蔗糖酶的純化（1）酶的蛋白屬性兩性電離：蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。大分子(膠體)：分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達(dá)1~100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。①改變離子強(qiáng)度；鹽析、硫酸銨分級(jí)沉淀(反抽提法)反抽提法(BackExtraction)例：E.colRNA聚合酶42%-50%硫酸銨飽和度時(shí)沉淀通常方法：先33%再50%反抽提法：再42%將包含待分離酶在內(nèi)的多種蛋白一起先沉淀出來，然后再選擇適當(dāng)?shù)倪f減濃度的硫酸銨溶液來抽提沉淀物。蛋白從溶液中沉淀析出十分容易，沉淀在溶液中溶解有高特異性。改變pH或溫度；酶在未純化之前pl也是未知的，pH不宜變化過大，以免失活。Cu,Zn-SOD的純化可在70oC，10min改變介電常數(shù)；有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀：向水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。親水性有機(jī)溶劑加入溶液后降低介質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀。親水性有機(jī)溶劑的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了表面水化膜的厚度，降低其親水性，導(dǎo)致脫水凝集。有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀操作條件的控制：常用的溶劑是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亞砜也可做沉淀劑。沉淀用有機(jī)溶劑的選擇主要應(yīng)考慮沉淀作用強(qiáng)、對(duì)生物分子的變性作用小、毒性小以及揮發(fā)性適中。使用有機(jī)溶劑沉淀生物大分子時(shí)應(yīng)控制在低溫下進(jìn)行。一般認(rèn)為蛋白質(zhì)的初始濃度為0.5-2%為好。3）根據(jù)酶分子大小、形狀不同的分離方法離子交換層析：以離子交換劑為固定相，以特定的離子溶液為流動(dòng)相，利用離子交換劑對(duì)待分離的各種離子結(jié)合力的差異，而將混合物中不同離子進(jìn)行分離的層析技術(shù)。離子交換分離的基本步驟---平衡-上樣-吸附-洗脫-再生。選擇離子交換介質(zhì)時(shí)應(yīng)注意對(duì)pI=5的某酸性蛋白質(zhì)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陰離子時(shí)在pH5.5-9.0的范圍內(nèi)應(yīng)選陰離子交換劑；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陽離子時(shí)，在pH3.5-4.5的范圍內(nèi)應(yīng)首選陽離子交換劑。本實(shí)驗(yàn)我們選用DEAE-52離子交換層析。3、各純化級(jí)別蔗糖酶的活力測(cè)定酶活力（enzymeactivity）：酶催化某一反應(yīng)的能力，位時(shí)間內(nèi)單位體積中底物（substrate）的減少量或產(chǎn)物（product）的增加量，也稱為比活性，一般用U/mg蛋白質(zhì)來表示，有時(shí)也可用每g或每ml酶含多少個(gè)活力單位來表示?；盍Γɑ蚩偦盍Γ┥婕霸跇悠分忻傅目倖挝?，而比活力是酶純度的量度，是每毫克酶的催化活力數(shù)（U/mg蛋白）。在酶的純化過程中它的比活力逐漸升高，當(dāng)酶提純時(shí)，其比活力值成為最大和恒定。本實(shí)驗(yàn)中采用DNS法測(cè)定蔗糖酶活力。3,5-二硝基水楊酸比色定糖的原理：DDNS試劑-D■葡萄糖，氨基化合物（還原糖）游”（棕紅色）2）在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度成一定比例關(guān)系（可于比色測(cè)定），所以可用DNS比色法測(cè)定還原糖的含量：蔗糖酶活力測(cè)定的原理：1）蔗糖酶催化的反應(yīng)是：蔗糖盛璽D?果糖+葡萄糖2）蔗糖酶活力的規(guī)定：在本實(shí)驗(yàn)條件下，每3分鐘釋放1毫克還原糖所需的酶量定義為一個(gè)活力單位。3）該方法是半微量定糖法，操作簡便、快速、雜質(zhì)干擾較少。4、蔗糖酶的蛋白濃度測(cè)定①紫外吸收法：原理：大多數(shù)蛋白質(zhì)由于有酪氨酸和色氨酸的存在，在紫外光280nm有收峰，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定優(yōu)點(diǎn)：樣品不需要經(jīng)過預(yù)先處理，即可直接進(jìn)行測(cè)定。方法簡單而快速，又不損害樣品中的蛋白質(zhì)，測(cè)定之后的樣品仍可作他用。樣品中有硫酸或其他鹽類存在也不影響測(cè)定。在柱層析分離酶或蛋白質(zhì)時(shí)，常為人們所采用。缺點(diǎn)：核酸在280nm也有吸收，干擾測(cè)定，但核酸的最大吸收峰在260nm。不同蛋白質(zhì)的氨基酸組成也不同，因而光吸收也不盡相同，這就會(huì)帶來誤差。計(jì)算公式：蛋白質(zhì)含量(mg/ml)=1.55A280—0.76A260②Folin-酚法(Lowry法)這是測(cè)定蛋白質(zhì)含量最靈敏的經(jīng)典方法之一，由于方法簡便，靈敏度高，常為實(shí)驗(yàn)室所采用，也是文獻(xiàn)上用得最多的方法之一。原理:(A)凡含有兩個(gè)及兩個(gè)以上肽鍵(-CO-NH-)的化合物在堿性溶液中(如Folin-甲試劑)都能與Cu2+作用，形成紫色的復(fù)合物；所有的蛋白質(zhì)均可與Folin-甲試劑反應(yīng)形成紫色的銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物；銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物在pH=10的堿性溶液中可將磷鉬酸-磷鎢酸(Folin-乙試劑)還原成蘭色的鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物，其顏色的深淺(在一定范圍內(nèi))與蛋白質(zhì)的含量成正比。5)、蔗糖酶酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(Kineticsofenzyme-catalyzedreaction)是研究酶促反應(yīng)的速度以及影響此速度的各種因素的科學(xué)，是酶工程研究中的一個(gè)重要內(nèi)容。其影響因素有：pH值、溫度、酶濃度、底物濃度、激活劑、抑制劑等。酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式——米氏學(xué)說[S]：底物濃度、Km：米氏常數(shù)、Vmax:最大反應(yīng)速度、V：不同[S]時(shí)的反應(yīng)速度米氏常數(shù)(Km)的意義①Km值是酶的特征常數(shù)之一，只與酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶的濃度無關(guān)。②Km值作為常數(shù)只是對(duì)一定的底物、一定的pH、一定的溫度條件而言，測(cè)定酶的Km值可以作為鑒別酶的一種手段。1/Km可以表示酶對(duì)底物親和力的大小,1/Km越大，表明親和力越大，多底物酶有不同的Km值，最適底物的Km值最小。實(shí)驗(yàn)中采用雙倒數(shù)法計(jì)算米氏常數(shù)：將米氏方程兩邊取倒數(shù)，可轉(zhuǎn)化為下列形式：以1/V對(duì)1/[S]作圖得一直線，其斜率是Km/Vmax,在縱軸上的截距為1/Vmax,橫軸上的截距為-1/Km。Slope/]交試驗(yàn)法測(cè)定不同條件對(duì)蔗糖酶活性的影響ogonalexperj/]交試驗(yàn)法測(cè)定不同條件對(duì)蔗糖酶活性的影響ogonalexperjesign)：是研究多因素多水平的一種設(shè)(6)、正交試驗(yàn)設(shè)氓軌rthKm計(jì)方法，它是從全面試驗(yàn)中挑選出部分有代表性的點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，這些有代表性的點(diǎn)具備了“均勻分散，齊整可比”的特點(diǎn)。是一種高效率、快速、經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。日本著名的統(tǒng)計(jì)學(xué)家田口玄一將正交試驗(yàn)選擇的水平組合列成表格，稱為正交表。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，因素可以定量的，也可以是定性的，定量因素各水平間的距離可以相等也可以不等。正交試驗(yàn)法優(yōu)點(diǎn)：(1)試驗(yàn)點(diǎn)代表性強(qiáng)，試驗(yàn)次數(shù)少。(2)不需做重復(fù)試驗(yàn)，就可以估計(jì)試驗(yàn)誤差可以分清因素的主次。可以使用數(shù)理統(tǒng)計(jì)的方法處理試驗(yàn)結(jié)果正交試驗(yàn)(表)法的特點(diǎn)：(1)均衡分散性一代表性。(2)整齊可比性一可以用數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理。

因素水平A溫度因素水平A溫度（°c）BpH值C離子濃度（mol/L）1402.60.052504.60?103606.60?15本實(shí)驗(yàn)因素水平表用正交實(shí)驗(yàn)法只需要9次實(shí)驗(yàn)三、本實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)1、這個(gè)實(shí)驗(yàn)較大，涉及到的理論知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)都比較多用的時(shí)間也很長，要求同學(xué)們一定做好預(yù)習(xí)，把預(yù)習(xí)過程中有問題的部分記下，實(shí)驗(yàn)之前和老師或同學(xué)討論。2、寫好預(yù)習(xí)報(bào)告，要求簡潔明了（并留出記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的位置），否則將嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)