單克隆抗體手冊

單克隆抗體技術(shù)第一節(jié)單克隆抗體的研制一、單克隆抗體的概念抗體是機體在抗原刺激下產(chǎn)生的能與該抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。常規(guī)的抗體制備是通過動物免疫并采集抗血清的辦法產(chǎn)生的，因而抗血清普通含有針對其它無關(guān)抗原的抗體和血清中其它蛋白質(zhì)成分。普通的抗原分子大多含有多個不同的抗原決定簇，因此常規(guī)抗體也是針對多個不同抗原決定簇抗體的混合物。即使是針對同一抗原決定簇的常規(guī)血清抗體，仍是由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的異質(zhì)的抗體構(gòu)成。因而，常規(guī)血清抗體又稱多克隆抗體（polyclonalantibody），簡稱多抗。由于常規(guī)抗體的多克隆性質(zhì)，加之不同批次的抗體制劑質(zhì)量差別很大，使它在免疫化學(xué)實驗等使用中帶來許多麻煩。因此，制備針對預(yù)定抗原的特異性均質(zhì)的且能確保無限量供應(yīng)的抗體是免疫化學(xué)家長久夢寐以求的目的。隨著雜交瘤技術(shù)的誕生，這一目的得以實現(xiàn)。1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，他們把用預(yù)定抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞與能在體外培養(yǎng)中無限制生長的骨髓瘤細(xì)胞融合，形成B細(xì)胞雜交瘤。這種雜交瘤細(xì)胞含有雙親細(xì)胞的特性，既像骨髓瘤細(xì)胞同樣在體外培養(yǎng)中能無限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴細(xì)胞那樣合成和分泌特異性抗體。通過克隆化可得到來自單個雜交瘤細(xì)胞地單克隆系，即雜交瘤細(xì)胞系，它所產(chǎn)生的抗體是針對同一抗原決定簇的高度同質(zhì)的抗體，即所謂單克隆抗體（monoclonalantibody），簡稱單抗。與多抗相比，單抗純度高，專一性強、重復(fù)性好、且能持續(xù)地?zé)o限量供應(yīng)。單抗技術(shù)的問世，不僅帶來了免疫學(xué)領(lǐng)域里的一次革命，并且它在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的各個領(lǐng)域獲得極廣泛的應(yīng)用，增進了眾多學(xué)科的發(fā)展。Kohler和Milstein兩人由此杰出奉獻而榮獲1984年度諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。二、雜交瘤技術(shù)（一）、雜交瘤技術(shù)的誕生淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的誕生是幾十年來免疫學(xué)在理論和技術(shù)兩方面發(fā)展的必然成果，抗體生成的克隆選擇學(xué)說、抗體基因的研究、抗體構(gòu)造與生物合成以及其多樣性產(chǎn)生機制的揭示等，為雜交瘤技術(shù)提供了技術(shù)儲藏。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英國《自然》雜志上發(fā)表了題為“分泌含有預(yù)定特異性抗體的融合細(xì)胞的持續(xù)培養(yǎng)”（Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity）的著名論文。他們大膽地把以前不同骨髓瘤細(xì)胞之間的融合延伸為將喪失合成次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hypoxanthineguanosinephosphoribosyltransferase，HGPRT）的骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進行融合。融合由仙臺病毒介導(dǎo)，雜交細(xì)胞通過在含有次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培養(yǎng)基（HAT）中生長進行選擇。在融合后的細(xì)胞群體里，盡管未融合的正常脾細(xì)胞和互相融合的脾細(xì)胞是HGPRT+，但不能持續(xù)培養(yǎng)，只能在培養(yǎng)基中存活幾天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤細(xì)胞和互相融合的HGPRT-骨髓瘤細(xì)胞不能在HAT培養(yǎng)基中存活，只有骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞因得到分別來自親本脾細(xì)胞的HGPRT和親本骨髓瘤細(xì)胞的持續(xù)繼代特性，而在HAT培養(yǎng)基中存活下來。實驗的成果完全像起始設(shè)計的那樣，最后得到了諸多分泌抗綿羊紅細(xì)胞抗體的克隆化雜交瘤細(xì)胞系。用這些細(xì)胞系注射小鼠后能形成腫瘤，即所謂雜交瘤。生長雜交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同質(zhì)的抗體，即單克隆抗體。這一技術(shù)建立后很快，在融合劑和所用的骨髓瘤細(xì)胞系等方面即得到改善。最早仙臺病毒被用做融合劑，后來發(fā)現(xiàn)聚乙二醇（PEG）的融合效果更加好，且避免了病毒的污染問題，從而得到廣泛的應(yīng)用。隨即建立的骨髓瘤細(xì)胞系如SP2/0-Ag14，和NSO/1都是既不合成輕鏈又不合成重鏈的變種，因此由它們產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞系，只分泌一種針對預(yù)定的抗原的抗體分子，克服了骨髓瘤細(xì)胞MOPC-21等的局限性。再后來又建立了大鼠、人和雞等用于細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞系，但其基本原理和辦法是同樣的。（二）、基本程序和辦法雜交瘤技術(shù)在具體操作上，各實驗室使用的程序不盡一致。本節(jié)中介紹的辦法是作者所在實驗室采用的、實踐證明成熟的程序，該程序適合國內(nèi)大多數(shù)實驗室。在開展雜交瘤技術(shù)制備單抗之前，培養(yǎng)骨髓瘤和雜交瘤細(xì)胞必須含有下列重要儀器設(shè)備：超凈工作臺、CO2恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱（-70℃）、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機（水平轉(zhuǎn)子，4000r/min）、37℃水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。其需要的重要器械涉及：100ml、50ml、25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，10ml、1ml刻度吸管，試管，滴管（彎頭、直頭），平皿，燒杯，500ml、250ml、100ml鹽水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，融合管（50ml圓底帶蓋玻璃或塑料離心管），眼科剪刀，眼科鑷，血細(xì)胞計數(shù)板，可調(diào)微量加樣器（~50ul，~200ul，~1000ul），彎頭針頭，200目篩網(wǎng)，小鼠固定裝置等。另外，雜交瘤細(xì)胞的篩選與檢測的儀器設(shè)備，根據(jù)檢測單抗的辦法不同而各異，請參閱本節(jié)有關(guān)部分。淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的重要環(huán)節(jié)涉及：動物免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選與單抗檢測、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存、單抗的鑒定等，圖6-1概括了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)研制單抗的重要過程。1、動物免疫（1）抗原制備制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不規(guī)定很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機會增加，同時能夠減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應(yīng)根據(jù)所研究的抗原和實驗室的條件來決定。普通來說，抗原的來源有限，或性質(zhì)不穩(wěn)定，提純時易變性，或其免疫原性很強，或所需單抗是用于抗原不同組分的純化或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物諸多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強時，則必須對抗原進行純化。檢測用抗原能夠是與免疫抗原純度相似，也可是不同的純度，這重要決定于所用篩檢辦法的種類及其特異性和敏感性。（2）免疫動物的選擇根據(jù)所用的骨髓瘤細(xì)胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動物。由于，全部的供雜交瘤技術(shù)用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系均來源于BALB/c小鼠，全部的大鼠骨髓瘤細(xì)胞都來源于LOU/c大鼠，因此普通的雜交瘤生產(chǎn)都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是，有時為了特殊目的而需進行種間雜交，則可免疫其它動物。種間雜交瘤普通分泌抗體的能力不穩(wěn)定，由于染色體容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，雌性鼠較便于操作。（3）免疫程序的擬定免疫是單抗制備過程中的重要環(huán)節(jié)之一，其目的在于使B淋巴細(xì)胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利于細(xì)胞融合形成雜交細(xì)胞，并增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機會。因此在設(shè)計免疫程序時，應(yīng)考慮到抗原的性質(zhì)和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數(shù)與間隔時間、佐劑的應(yīng)用及動物對該抗原的應(yīng)答能力等。沒有一種免疫程序能使用于多個抗原?，F(xiàn)用的免疫程序中多數(shù)是參考制備常規(guī)多克隆抗體的辦法。表6-1列舉了現(xiàn)在慣用的免疫程序。免疫途徑慣用體內(nèi)免疫法涉及皮下注射、腹腔或靜脈注射，也采用足墊、皮內(nèi)、滴鼻或點眼。最后一次加強免疫多采用腹腔或靜脈注射，現(xiàn)在特別推崇后者，由于可使抗原對脾細(xì)胞作用更快速而充足。在最后一次加強免疫后第3天取脾融合為好，許多實驗室的成果表明，初次免疫和再次免疫應(yīng)答反映中，取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應(yīng)答時獲得的雜交瘤重要分泌IgM抗體，再次免疫應(yīng)答時獲得的雜交瘤重要分泌IgG抗體。筆者體會陽性雜交瘤出現(xiàn)的高峰與小鼠血清抗體的滴度并無明顯的平行關(guān)系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達(dá)成最高的雜交瘤形成率需要有盡量多的漿母細(xì)胞，這在最后一次加強免疫后第3天取脾進行融合較適宜。已有人報道采用脾內(nèi)免疫，可提高小鼠對抗原的免疫反映性，且節(jié)省時間，普通免疫3天后即可融合。體內(nèi)免疫法使用于免疫原性強、來源充足的抗原，對于免疫原性很弱或?qū)C體有害（如引發(fā)免疫克制）的抗原就不合用了。如果制備人單克隆抗體幾乎不大可能采用體內(nèi)免疫法。因此，針對這些狀況，可采用體外免疫。所謂體外免疫就是將脾細(xì)胞（或淋巴結(jié)細(xì)胞，或外周淋巴細(xì)胞）取出體外，在一定條件下與抗原共同培養(yǎng)，然后再與骨髓瘤細(xì)胞進行融合。其基本辦法是取4-8周齡BALB/c小鼠的脾臟，制成單細(xì)胞懸液，用無血清培養(yǎng)液洗滌2-3次，然后懸浮于含10%小牛血清的培養(yǎng)液中，再加入適量抗原（可溶性抗原ml，細(xì)胞抗原105-106個細(xì)胞/ml）和一定量的BALB/c小鼠胸腺細(xì)胞培養(yǎng)上清液；在37℃，6%CO2濃度下培養(yǎng)3-5天，再分離脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。表6-1不同免疫抗原的免疫程序免疫原特性抗原量接種次數(shù)間隔時間單抗的特性抗體滴度親和性免疫原性強（如細(xì)胞、細(xì)菌和病毒等）106-107個細(xì)胞或1-10ug2-42-4周高中檔至強免疫原性中檔10-100ug2-42-4周中檔或高中檔或強免疫原性弱2-4隨即2-3每月2-3月中檔強其后200-400ug2其后4每月每天中檔中檔2其后4其后“休息”最后加強每月10天1-2月中檔中檔或強（引自劉秀梵，1994）2、細(xì)胞融合（1）重要試劑的配制A、細(xì)胞培養(yǎng)基雜交瘤技術(shù)中使用的細(xì)胞培養(yǎng)基重要有RPMI-1640或DMEM（DulbercoModifiedEaglesMedium）兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，具體配制辦法按廠家規(guī)定的程序，配好后過濾除菌（），分裝，4℃保存。不完全RPMI-1640培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基原液96ml，100×.溶液1ml，雙抗溶液1ml，%NaHCO3溶液1-2ml，HEPES溶液1ml。不完全DMEM培養(yǎng)基：DMEM，超純水或四蒸水980ml，NaHCO3，雙抗溶液10ml，100×.溶液10ml，用1NHCl調(diào)試PH至，過濾除菌，分裝4℃保存。完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基：不完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基80ml，小牛血清15-20ml。用于骨髓瘤細(xì)胞SP2/0和建株后的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)。HT培養(yǎng)基：完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基99ml，HT貯存液1ml。HAT培養(yǎng)基：完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基98ml，HT貯存液1ml，A貯存液1ml。a、氨基喋呤（A）貯存液（100×，4×10-5mol/L）稱取氨基喋呤（AminopterinMW），溶于90ml超純水或四蒸水中，滴加1mol/LNaOH中和，再補加超純水或四蒸水至100ml。過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。b、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）貯存液(100×,H:10-2mol/L，T：×10-3mol/L）稱取次黃嘌呤(Hypoxanthine,MW和胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW，加超純水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20℃凍存。用前可置37℃加溫助溶。c、L-谷氨酰鞍（.）溶液（100×，L）稱取L-谷氨酰鞍（L-glutamine，MW），用100ml不完全培養(yǎng)液或超純水（或四蒸水）溶解，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20℃凍存。d、青、鏈霉素（雙抗）溶液（100×）取青霉素G（鈉鹽）100萬單位和鏈霉素（硫酸鹽）1g，溶于100ml滅菌超純水或四蒸水中，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20℃凍存。e、%NaHCO3溶液稱取分析純NaHCO3，溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），蓋緊瓶塞，4℃保存。f、HEPES溶液（1mol/L）稱取HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonicacid，N-2-羥乙基哌嗪-N，-2-乙基磺酸，MW）溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），4℃保存。g、8-氮鳥嘌呤貯存液（100×）稱取200mg8-氮鳥嘌呤（8-azaguanine，MW），加入4mol/LNaOH1ml，待其溶解后，加入超純水或四蒸水99ml，過濾除菌；分裝小瓶，-20℃凍存。使用時按1%濃度加入到培養(yǎng)液中（即終濃度為20ug/ml）。h、50%PEG稱取PEG1000或400020-50g于三角瓶中，蓋緊，60-80℃水浴融化，分裝于青霉素小瓶中，蓋緊，8磅高壓蒸汽15分鐘，-20℃寄存?zhèn)溆?。臨用前加熱融化，加等量不完全培養(yǎng)基，用少量%NaHCO3調(diào)PH至，或購置Sigma或Gibco公司現(xiàn)成產(chǎn)品。（2）骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備融合前骨髓瘤細(xì)胞維持的方式，對成功地得到雜交瘤是最為重要的。目的是使細(xì)胞處在對數(shù)生長的時間盡量長，融合前必定不能少于1周。凍存的細(xì)胞在復(fù)蘇后要2周時間才干處在適合于融合的狀態(tài)，長過了的骨髓瘤細(xì)胞最少幾天才可能恢復(fù)。在實驗室中處在對數(shù)生長的骨髓瘤細(xì)胞維持在含10%小牛血清的培養(yǎng)基中，辦法是用6個裝5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，接種10倍系列稀釋的骨髓瘤細(xì)胞。1周后到細(xì)胞相稱密而又未長過的一瓶重新移植。典型的倍增時間為14-16小時。骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備辦法以下：a、于融合前48-36小時，將骨髓瘤細(xì)胞擴大培養(yǎng)（普通按一塊96孔板的融合實驗約需2-3瓶100ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞進行準(zhǔn)備）。b、融合當(dāng)天，用彎頭滴管將細(xì)胞從瓶壁輕輕吹下，收集于50ml離心管或融合管內(nèi)。c、1000r/min離心5-10分鐘，棄去上清。d、加入30ml不完全培養(yǎng)基，同法離心洗滌一次。然后將細(xì)胞重懸浮于10ml不完全培養(yǎng)基，混勻。e、取骨髓瘤細(xì)胞懸液，加%臺酚藍(lán)染液作活細(xì)胞計數(shù)后備用。細(xì)胞計數(shù)時，取細(xì)胞懸液加入中，混勻，用血球計數(shù)板計數(shù)。計算細(xì)胞數(shù)目的公式為：每毫升細(xì)胞數(shù)=4個大方格細(xì)胞數(shù)×105/4；或每毫升細(xì)胞數(shù)=5個中方格細(xì)胞數(shù)×106/2（3）脾細(xì)胞的準(zhǔn)備取已經(jīng)免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分離血清作為抗體檢測時的陽性對照血清。同時通過頸脫位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分鐘，于解剖臺板上固定后掀開左側(cè)腹部皮膚，可看到脾臟，換眼科剪鑷，在超凈臺中用無菌手術(shù)剪開腹膜，取出脾臟置于已盛有10ml不完全培養(yǎng)基的平皿中，輕輕洗滌，并細(xì)心剝?nèi)ブ苓吔Y(jié)締組織。將脾臟移入另一盛有10ml不完全培養(yǎng)基的平皿中，用彎頭鑷子或裝在1ml注射器上的彎針頭輕輕擠壓脾臟（也可用注射器內(nèi)芯擠壓脾臟），使脾細(xì)胞進入平皿中的不完全培養(yǎng)基。用吸管吹打多次，制成單細(xì)胞懸液。為了除去脾細(xì)胞懸液中的大團塊，可用200目銅網(wǎng)過濾。收獲脾細(xì)胞懸液，1000r/min離心5-10分鐘，用不完全培養(yǎng)基離心洗滌1-2次，然后將細(xì)胞重懸于10ml不完全培養(yǎng)基混勻，取上述懸液，加臺酚藍(lán)染液作活細(xì)胞計數(shù)后備用。普通每只小鼠1××108個脾細(xì)胞，每只大鼠脾臟可得5×108-10×108脾細(xì)胞。（4）喂養(yǎng)細(xì)胞的制備在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過程中，由于大量骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡，此時單個或少數(shù)分散的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，普通必須加入其它活細(xì)胞使之繁殖，這種被加入的活細(xì)胞稱為喂養(yǎng)細(xì)胞（Feedercells）。喂養(yǎng)細(xì)胞增進其它細(xì)胞增殖的機制尚不明了，普通認(rèn)為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子，為雜交瘤細(xì)胞提供必要的生長條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細(xì)胞對細(xì)胞密度的依賴性。慣用的喂養(yǎng)細(xì)胞有胸腺細(xì)胞、正常脾細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞。其中以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的來源及制備較為方便，且有吞噬去除死亡細(xì)胞及其碎片的作用，因此使用最為普遍。其制備辦法以下：按上述采小鼠脾細(xì)胞的辦法將小鼠致死、體表消毒和固定后，用消毒剪鑷從后腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培養(yǎng)基至腹腔，注意避免穿入腸管。右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內(nèi)，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1分鐘，隨即吸出注入的培養(yǎng)液。1000r/min離心5-10分鐘，棄上清。先用5mlHAT培養(yǎng)基將沉淀細(xì)胞懸浮，根據(jù)細(xì)胞計數(shù)成果，補加HAT培養(yǎng)基，使細(xì)胞濃度為2×105/ml，備用。普通對巨噬細(xì)胞來說，96孔培養(yǎng)板每孔需2×104個細(xì)胞，24孔板每孔需105細(xì)胞。每只小鼠可得3-5×106個細(xì)胞，因此一只小鼠可供兩塊96孔板喂養(yǎng)細(xì)胞。也可在細(xì)胞融合前1-2天制備并培養(yǎng)喂養(yǎng)細(xì)胞，這樣使培養(yǎng)板孔底先鋪上一層喂養(yǎng)細(xì)胞層。做法是，將上述細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔（相稱于2滴），然后置37℃6%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（5）細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)細(xì)胞融合的程序已報道的有諸多個，這里介紹的是作者所在實驗室慣用的一種。a、將1×108脾細(xì)胞與2×107-5×107骨髓瘤細(xì)胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合管中，補加不完全培養(yǎng)基至30ml，充足混勻。b、1000r/min離心5-10分鐘，將上清盡量吸凈。c、在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻;置40℃水浴中預(yù)熱。d、用1ml吸管在1分鐘左右（最佳時間為45秒）加預(yù)熱至40℃的50%PEG（PH）1ml，邊加邊輕輕攪拌。e、用10ml吸管在90秒內(nèi)加20-30ml預(yù)熱至37℃的不完全培養(yǎng)基；20-37℃靜置10分鐘。f、1000r/min5分鐘；棄去上清。g、加入5mlHAT培養(yǎng)基，輕輕吹吸沉淀細(xì)胞，使其懸浮并混勻，然后補加含腹腔巨噬細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基至80-100ml。h、分裝96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔；分裝24孔板，每孔；然后將培養(yǎng)板置37℃，6%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。i、5天后用HAT培養(yǎng)基換出1/2培養(yǎng)基。j、7-10天后用HT培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基；（第14天后可用普通完全培養(yǎng)基）。l、經(jīng)常觀察雜交瘤細(xì)胞生長狀況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測。3、雜交瘤細(xì)胞篩選雜交瘤細(xì)胞在融合后2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來，普通也稱為抗體檢測?？贵w檢測的辦法諸多，普通根據(jù)所研究的抗原和實驗室的條件而定。但作為雜交瘤篩選的抗體檢測辦法必須含有快速、準(zhǔn)備、簡便，便于一次解決大量樣品等特點。由于往往有幾百個樣品需要在短短幾個小時就報告成果，方便決定雜交瘤細(xì)胞的取舍。因此選用抗體檢測辦法的原則是快速、敏感、特異、可靠、耗費小和節(jié)省人力。普通說來，在融合之前就必須建立好抗體檢測辦法，并克服可能存在的問題。另一種重要問題是抗體檢測辦法所需要的“動力學(xué)范疇”，即檢出背景以上的最強與最弱信號之比，依所用的檢測抗原與否純凈而定。如雜交瘤抗體是針對純化的蛋白質(zhì)抗原的，100%的抗原參加反映，一種陽性/陰性鑒別系統(tǒng)就夠了。另首先，如果雜交瘤抗體是針對細(xì)胞表面微量的蛋白抗原，檢測系統(tǒng)可能需要能測出微弱信號，則動力學(xué)范疇最少應(yīng)為10：1，最佳為100：1。另外，檢測辦法的選擇還受所需雜交瘤細(xì)胞抗體的類型和預(yù)定的用途的影響。結(jié)合補體的抗體能夠用基于細(xì)胞毒性反映的檢測辦法來選出。如需結(jié)合A蛋白的雜交瘤抗體，就要用結(jié)合蛋白A的檢測辦法。下面簡要介紹幾個慣用的抗體檢測辦法：（1）免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反映的特異性和酶對底物顯色反映的高效催化作用有機結(jié)合而成的免疫學(xué)技術(shù)。由于它特異性高，敏捷度高，現(xiàn)已廣泛用于篩選和鑒定單抗。A、器材和試劑a、包被緩沖液：碳酸鹽緩沖液：取LNa2CO38ml，LNaHCO317ml混合，再加75ml蒸餾水，調(diào)PH至。Tris-HCl緩沖液（，L）：取LTris100ml，LHCl混合，蒸餾水至1000ml。b、洗滌緩沖液（的PBS）：KH2PO4，KCl，Na2HPO4·12H2O，NaCl，Tween-20，加蒸餾水至1000ml。c、稀釋液和封閉液：牛血清白蛋白（BSA），加洗滌液至100ml；或用洗滌液將小牛血清配成5-10%使用。d、酶反映終止液（2mol/LH2SO4）：取蒸餾水，滴加濃硫酸（98%）。e、底物緩沖液（，磷酸鹽-檸檬酸緩沖液）：取LNaHPO4，L檸檬酸，再加50ml蒸餾水。檸檬酸溶液及配成的底物緩沖液不穩(wěn)定，易形成沉淀，因此一次不適宜配制過多。f、底物使用液：OPD底物使用液（測490nm的OD值）：OPD5mg，底物緩沖液10ml，3%H2O2。TMBS或TMB底物使用液（測450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml），底物緩沖液10ml，1%H2O225ul。ABTS底物使用液（測410nm的OD值）：ABTS，底物緩沖液1ml，3%H2O22ul。g、抗體對照：以骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陰性對照，以免疫鼠血清作為陽性血清。h、抗原：可溶性抗原：盡量純化，以獲得高特異性。病毒感染的傳代細(xì)胞或全菌抗原。淋巴細(xì)胞等懸液。i、酶標(biāo)抗鼠抗體或酶標(biāo)SPA或其它類似試劑。j、細(xì)胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4100mg，KH2PO4500mg，蒸餾水150ml，丙酮225ml；或丙酮-甲醛溶液（1;1）；或-20℃甲醇。k、聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或條孔；硬板或軟板均可使用。l、酶聯(lián)免疫閱讀儀；或光鏡。m、吸管、加樣器及水浴箱、離心機等。B、用可溶性抗原的酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）a、純化抗原用包被液稀釋至1-20ug/ml。b、以50-100ul/孔量加入酶標(biāo)板孔中，置4℃過夜或37℃吸附2小時。c、棄去孔內(nèi)的液體，同時用洗滌液洗3次，每次3-5分鐘，拍干。d、每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃封閉2小時；該環(huán)節(jié)對于某些抗原，可省略。e、洗滌液洗3次；此時包被板可-20℃或4℃保存?zhèn)溆谩、每孔加50-100ul待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，同時設(shè)立陽性、陰性對照和空白對照；37℃孵育1-2小時；洗滌，拍干。g、加酶標(biāo)第二抗體，每孔50-100ul，37℃孵育1-2小時，洗滌，拍干。h、加底物液，每孔加新鮮配制的底物使用液50-100ul，37℃10-30分鐘。i、以2mol/LH2SO4終止反映，在酶聯(lián)免疫閱讀儀上讀取OD值。j、成果鑒定：以P/N≧，或P≧N+3SD為陽性。若陰性對照孔無色或靠近無色，陽性對照孔明確顯色，則可直接用肉眼觀察成果。C、用全菌抗原的ELISAa、新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌用蒸餾水或PBS懸浮，并調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度至1Χ108個/ml。必須指出，對于人畜共患病病原體需注意安全操作，最佳是滅活解決。b、每孔中加100ul5%戊二醛溶液（LNaHCO395ml+25%戊二醛溶液5ml，37℃作用2小時，蒸餾水洗滌3次；加上述細(xì)菌懸液50ul/孔；37-56℃烘干；每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃2小時封閉。c、環(huán)節(jié)b也可采用先每孔加50ul細(xì)菌懸液，37℃-56℃烘干，然后用-20℃預(yù)冷的無水甲醇室溫作用15分鐘，蒸餾水洗滌3次；每孔加200ul封閉液4℃過夜或37℃2小時封閉。d、洗滌液洗3次；此時包被板可在-20℃或4℃保存?zhèn)溆?。e、以上環(huán)節(jié)同上法。D、用全細(xì)胞抗原的ELISAa、按常規(guī)辦法培養(yǎng)細(xì)胞，接種病毒，收獲感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞，進行細(xì)胞計數(shù)，用PBS制成適宜濃度懸液。b、淋巴細(xì)胞懸液的制備采用新鮮外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴細(xì)胞分離液之上，1500rpm離心30分鐘，吸取界面細(xì)胞洗滌二次，即為新鮮淋巴細(xì)胞懸液。該細(xì)胞懸液中若仍混有紅細(xì)胞，離心后加%的氯化銨溶液，室溫10分鐘，洗滌一次即可。將該細(xì)胞懸液稀釋至適宜濃度。c、每孔加100ul上述a或b的細(xì)胞懸液，使每孔含5Χ104個；1500r/min15分鐘，甩去上清；室溫干燥或吹干后用丙酮-甲醇（1：1）4℃固定10分鐘；可4℃或-20℃保存?zhèn)溆谩、以上環(huán)節(jié)同上法。E、抗體捕獲ELISA實驗本法用抗BALB/c小鼠IgG的多克隆抗體捕獲待檢樣品中的McAb，再依次加抗原、酶標(biāo)多克隆抗體及底物顯色。該法是慣用的ELISA中較抱負(fù)的一種；其操作環(huán)節(jié)以下：a、以適宜濃度的純化抗鼠IgG抗體包被酶標(biāo)板，每孔加100ul，37℃2小時或4℃過夜。b、洗滌、拍干后加待測的McAb樣品，37℃1-2小時。c、洗滌后加適量的抗原，37℃1-2小時。d、洗滌后加入酶標(biāo)多克隆抗體，37℃1-2小時。洗滌后加底物顯色，鑒定成果。F、ABC-ELISA實驗ABC-ELISA是在常規(guī)ELISA原理的基礎(chǔ)上，增加了生物素（Biotin）與親和素（Avidin）間的放大作用。親和素有4個亞單位構(gòu)成，對生物素有高度的親合力。生物素很易與蛋白質(zhì)共價結(jié)合。因此，結(jié)合了酶的親和素與結(jié)合有抗體的生物素發(fā)生反映即起到了多極放大作用。其操作環(huán)節(jié)以下：a、已知抗原的包被及加待檢McAb樣品，同間接ELISA實驗。b、加生物素化抗鼠Ig抗體，每孔100ul，37℃1小時；洗滌。c、加酶標(biāo)親和素，每孔100ul，37℃30分鐘洗滌；加底物顯色，鑒定成果。G、Dot-ELISA實驗免疫斑點實驗（Dot-ELISA）是以硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜為固相載體，進行抗原抗體反映的免疫檢測手段。該法采用不溶性底物（如DAB，或4-氯萘酚或AgNO3等），其與對應(yīng)標(biāo)記物（HRP、AP、膠體金）作用形成不溶性產(chǎn)物，呈現(xiàn)斑點狀著色，從而易于鑒定成果。根據(jù)所用的標(biāo)記物不同，可分為HRP免疫斑點實驗、AP免疫斑點實驗和免疫金銀斑點法等。其操作環(huán)節(jié)大致以下：a、將抗原液2-5ul點加于纖維素膜上，室溫37℃干燥。b、將纖維膜浸入封閉液中，37℃30分鐘。c、用洗滌液洗2次，吸干后加待檢McAb樣品，37℃1小時；用洗滌液振蕩洗滌三次，每次5分鐘，加HRP或AP或膠體金標(biāo)記的抗鼠Ig抗體，37℃作用30分鐘。d、同法洗滌，吸干，用新配的對應(yīng)底物溶液顯色，然后水洗終止反映，觀察成果。H、免疫組化染色法該法重要用于檢測針對細(xì)胞抗原成分的McAb，慣用的辦法是間接免疫過氧化物酶實驗（IIP，indirectimmunoperoxidase）及APAAP技術(shù)。其成果用光鏡或倒置顯微鏡檢查。（2）免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)可用于多個抗原的雜交瘤抗體檢測，如細(xì)胞性抗原（涉及細(xì)菌和動物細(xì)胞）、感染細(xì)胞中的病毒抗原和膜抗原等。其操作簡樸、敏感性高，可直接觀察抗原定位等優(yōu)點，在McAb的篩選與鑒定上含有重要的應(yīng)用價值。A、器材和試劑a、供檢測抗體用的抗原制備—固定細(xì)胞片或板，活細(xì)胞懸液。b、PBS（，L）c、待檢的McAb樣品。d、冷丙酮e、FITC（異硫氰酸熒光素）或TRITC（四甲基異硫氰酸羅丹明熒光素）標(biāo)記的抗鼠Ig抗體等f、熒光顯微鏡，磁力攪拌器，離心機，水浴箱等。B、間接免疫熒光法a、固定細(xì)胞片的制備：生長在蓋片上的細(xì)胞（接種或未接種病毒），可直接受獲蓋片，在PBS中洗滌，用4℃丙酮固定10分鐘，空氣干燥，置密封容器于-20℃保存?zhèn)溆?；單?xì)胞懸液可在蓋片上制成涂片，固定辦法同上。細(xì)胞涂片的制備：將10ul細(xì)菌懸液（1×108個/ml）涂抹7×21mm蓋片上，自然干燥后，用-20℃丙酮固定10-15分鐘，于-20℃保存?zhèn)溆?。b、蓋片在去離子水中濕潤后置架上滴加10-20ul雜交瘤上清或其它待檢樣品；設(shè)立陽性、陰性對照；置37℃水浴孵育小時。c、取出蓋片置PBS中用磁力攪拌器洗滌15分鐘。d、將蓋片置架上，滴加工作濃度的抗鼠Ig的熒光抗體10-20ul，37℃孵育小時。e、同法洗滌15分鐘；取出蓋片，用延緩熒光碎滅的封載劑（如緩沖甘油，9份甘油加1份PBS）封于干凈載玻片上。f、在熒光顯微鏡上觀察，陽性成果可見特異性熒光（FITC為黃綠色熒光，TRITC為桔紅色熒光）。g、細(xì)胞固定片的制備，也可改在培養(yǎng)板上進行，其它環(huán)節(jié)同上，在觀察成果時，將培養(yǎng)板翻轉(zhuǎn)置于熒光顯微鏡下，判斷原則不變。C、活細(xì)胞的膜熒光染色完整的活細(xì)胞的細(xì)胞膜，抗體不能透過。如果細(xì)胞在4℃操作，則熒光染色僅限于細(xì)胞膜。必須注意死細(xì)胞常以非特異性吸附大量熒光抗體，因此實驗過程中要確保細(xì)胞的高活力。活細(xì)胞的膜熒光染色大致環(huán)節(jié)以下：a、制備活性較好的細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)濃度至107個/ml。b、在小試管（5×50mm）中加入100ul細(xì)胞懸液，再加入100ul待檢McAb的樣品，混勻，4℃作用30-90分鐘。c、用洗滌液（PBS900ml，小牛血清50ml，4%NaN350ml）洗二次，每次加洗滌液1-5ml，1000r/min離心5分鐘，棄上清。加入100ul熒光抗體，4℃作用30-90分鐘。d、同法洗滌，將細(xì)胞重新懸于20-30ul含10%甘油和10-100ug苯二胺/ml的溶液中；滴加于載玻片上，加蓋片封載。e、立刻在熒光顯微鏡上檢查。f、細(xì)胞也可在染色后用1%多聚甲醛生理鹽水固定，或最少在4℃可保存一周。（3）間接血凝實驗間接血凝實驗又稱被動血凝實驗（PHA），是現(xiàn)在應(yīng)用較廣的檢測辦法之一。本實驗是以包被可溶性抗原的紅細(xì)胞作為批示系統(tǒng)，當(dāng)被檢抗體與包被在紅細(xì)胞上的抗原產(chǎn)生特異性反映時，造成紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象?？梢?，該法含有敏捷、快速、容易操作和無需昂貴儀器等優(yōu)點，并且經(jīng)改用醛化紅細(xì)胞后來，克服原來重復(fù)性差的缺點。A、器材和試劑a、綿羊抗凝血，或人“O”型抗凝血。b、緩沖液：PBS（）；醋酸緩沖液。c、甲醛，丙酮醛，NaN3，抗凝劑等。d、血凝板，振蕩器等。B、用多糖抗原的間接血凝實驗a、甲醛化綿羊紅細(xì)胞的制備：無菌采集綿羊頸靜脈血50ml，用枸櫞酸鈉作抗凝劑；用5倍于紅細(xì)胞壓積的PBS（Na2HPO4·12H2O，KH2PO4，NaCl，蒸餾水1000ml）充足洗滌5次，每次1500r/min5-10分鐘，直至上清測定無蛋白質(zhì)（用飽和硫酸銨滴定上清，觀察有無白色沉淀），再以相似緩沖液配成25%紅細(xì)胞懸液；將25%紅細(xì)胞懸液與20%甲醛以：1的比例混勻，37℃水浴作用2小時，每15分鐘振蕩一次，紅細(xì)胞顏色逐步由鮮紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣?；以PBS洗滌4次，每次r/min10分鐘，再以同樣的PBS制成25%紅細(xì)胞懸液；其后，重復(fù)醛化一次，辦法同前；最后配成20%醛化綿羊紅細(xì)胞懸液，加甲醛至%防腐，4℃保存?zhèn)溆谩、脂多糖抗原致敏甲醛化綿羊紅細(xì)胞的制備：取脂多糖（LPS），以LPBS液，調(diào)節(jié)多糖濃度至120ug/ml，然后100℃水浴解決1小時；將冷卻至37℃的熱解決LPS與6%醛化紅細(xì)胞等量混合，37℃攪拌作用45分鐘；取出離心r/min10分鐘，以LPBS洗滌4次；配制成4%致敏血球，分裝，保存于4℃?zhèn)溆茫騼龈杀４?。c、McAb的篩選：取待測McAb樣品25ul，加入V型微量血凝板孔中，同時設(shè)立陰性、陽性對照；再加入%致敏紅血球懸液25ul，在振蕩器上混勻30秒；置室溫或37℃30-60分鐘觀察成果。陰性對照孔應(yīng)呈緊縮的圓點。C、用可溶性蛋白抗原的間接血凝實驗a、紅細(xì)胞醛化：采用雙醛法。采綿羊或人“O”型抗凝血，每次加10倍于紅細(xì)胞壓積的PBS洗滌4-6次，然后配成8%紅細(xì)胞懸液；向此8%紅細(xì)胞懸液緩慢加入等量含有3%丙酮醛和3%甲醛的PBS，于室溫緩慢攪拌17小時；其后洗滌3次，配成20%雙醛化紅細(xì)胞懸液，加10%NaN3防腐，4℃保存?zhèn)溆?。b、致敏紅細(xì)胞：取20%雙醛化紅細(xì)胞，1500r/min10分鐘，棄上清，沉積紅細(xì)胞加L醋酸-醋酸鈉緩沖液1ml，并加最適濃度（應(yīng)預(yù)先測定，蛋白抗原為50ug/ml左右）的抗原1ml，混勻，于45℃致敏30分鐘，有時輕輕搖動，使紅細(xì)胞不下沉。然后離心去上清，并用20倍于紅細(xì)胞壓積的PBS洗3-4次，最后用PBS配成%致敏紅細(xì)胞，4℃保存?zhèn)溆?。c、McAb測定：同上法。（4）放射免疫測定放射免疫測定是用放射性同位素標(biāo)記抗原或抗體，以檢測對應(yīng)抗原或抗體的定量辦法。在篩選和鑒定單抗時慣用抗原固相法，即用抗原包被聚乙烯微板，借以檢測樣品中的McAb，其操作環(huán)節(jié)以下：a、用碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋至適宜的濃度（1-100ug/ml），滴加聚乙烯微板孔內(nèi)，100ul/孔，4℃過夜或37℃2小時。b、棄去抗原液，每孔加100ul含%BSA的PBS，4℃1-2小時封閉。c、用BSA-PBS洗滌3次，每次3分鐘。d、加待檢樣品，每孔100ul，設(shè)立陰性孔、陽性孔和空白孔；37℃1-2小時，同法洗滌。e、每孔加125I標(biāo)記的抗鼠Ig抗體工作液100ul，37℃1-2小時，同法洗滌。f、用γ-射線閃爍計數(shù)儀分別測定各孔放射性。普通規(guī)定樣品孔和陽性對照孔的放射性脈沖分別超出本底5倍和10倍。若以空白孔的放射性為基準(zhǔn)，凡樣品孔與陰性孔放射性之比不不大于3的樣品定為陽性。4、雜交瘤細(xì)胞的克隆化從原始孔中得到的雜交瘤細(xì)胞，可能來源于二個或多個雜交瘤細(xì)胞，因此它們所分泌的抗體是不同質(zhì)的。為了得到完全同質(zhì)的單克隆抗體，必須對雜交瘤細(xì)胞進行克隆化。另首先，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的早期是不穩(wěn)定的，有的細(xì)胞丟失部分染色體，可能喪失產(chǎn)生抗體的能力。為了除去這部分已不再分泌抗體的細(xì)胞，得到分泌抗體穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞系（又稱亞克?。?，也需要克隆化。另外，長久液氮凍存的雜交瘤細(xì)胞，復(fù)蘇后其分泌抗體的功效仍有可能丟失，因此也應(yīng)作克隆化，以檢測抗體分泌狀況。普通在得到針對預(yù)定抗原的雜交瘤后來需持續(xù)進行2-3次克隆化，有時還需進行多次。所謂克隆化是指使單個細(xì)胞無性繁殖而獲得該細(xì)胞團體的整個培養(yǎng)過程?？寺』霓k法諸多，如有限稀釋法、軟瓊脂法、單細(xì)胞顯微操作法、單克隆細(xì)胞集團顯微操作法和熒光激活細(xì)胞分類法（FACS）分離法。這里介紹最簡樸也是使用最廣泛的前兩種辦法。（1）有限稀釋法材料：a、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板等；b、HT培養(yǎng)基；c、活力強的雜交瘤細(xì)胞；d、小鼠腹腔細(xì)胞。辦法：a、制備小鼠腹腔細(xì)胞。同“細(xì)胞融合”一節(jié)中的辦法。b、制備待克隆的雜交瘤細(xì)胞懸液，用含20%血清的HT培養(yǎng)基稀釋至每毫升含、15和50個細(xì)胞3中不同的稀釋度。c、按每毫升加入5×104-1×105細(xì)胞的比例，在上述雜交瘤細(xì)胞懸液中分別加入腹腔巨噬細(xì)胞。d、每種雜交瘤細(xì)胞分裝96孔板一塊，每個稀釋度32孔，每孔量為，每孔的雜交瘤細(xì)胞數(shù)分別為、3和10。e、37℃、%CO2濕潤培養(yǎng)7-10天，出現(xiàn)肉眼可見的克隆即可檢測抗體；在倒置顯微鏡下觀察，標(biāo)出只有單個克隆生長的孔，取上清作抗體檢測。f、取抗體檢測陽性孔的細(xì)胞擴大培養(yǎng)，并凍存。g、本法中（b）、（c）、（d）也可簡化為將計數(shù)后的雜交瘤細(xì)胞精確地進行系列稀釋，直至每毫升含10個細(xì)胞，按每孔接種細(xì)胞懸液，即每孔含1個細(xì)胞。（2）軟瓊脂法材料：a、HT培養(yǎng)基（雙倍濃度）。b、用LNaCl配制的%瓊脂糖：稱取細(xì)胞培養(yǎng)用瓊脂糖，懸浮于100mlLNaCl，121℃高壓滅菌15分鐘，分裝10ml小瓶，冷卻后4℃保存。c、小鼠腹腔細(xì)胞。d、滅菌平皿。e、45℃水浴。f、活力較好的雜交瘤細(xì)胞。辦法：a、在培養(yǎng)皿中制備喂養(yǎng)細(xì)胞（小鼠腹腔細(xì)胞）單層。b、臨用前將%瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的HT培養(yǎng)基混勻，配成1%瓊脂糖培養(yǎng)液，45℃水浴中溫育。c、吸去平皿上層培養(yǎng)液，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液3ml，室溫10分鐘。d、取雜交瘤細(xì)胞懸液1ml，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液1ml混勻，鋪于上層。e、37℃、%濕潤培養(yǎng)7-14天；克隆生長至2mm時，用毛細(xì)吸管吸出克隆，直接轉(zhuǎn)種于含有喂養(yǎng)細(xì)胞的24孔板，擴大培養(yǎng)。f、吸取上清，檢測抗體，陽性孔可繼續(xù)克隆化，或擴大培養(yǎng)、凍存。5、雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇（1）雜交瘤細(xì)胞的凍存在建立雜交瘤細(xì)胞的過程中，有時一次融合產(chǎn)生諸多“陽性”孔，來不及對全部的雜交瘤細(xì)胞作進一步的工作，需要把其中一部分細(xì)胞凍存起來；另首先，為了避免實驗室可能發(fā)生的意外事故，如停電、污染、培養(yǎng)箱的溫度或CO2控制器失靈等給正在建立中的雜交瘤帶來困難，普通盡量早地凍存一部分細(xì)胞作為種子，以免遭到不測。在雜交瘤細(xì)胞建立后來，更需要凍存一大批，以備此后隨時取用。細(xì)胞凍存的原理是細(xì)胞在加血清和二甲基亞砜的培養(yǎng)基中以一定的緩慢速度下降溫度（0℃——-20℃，每分鐘下降1℃；-20℃——-40℃每分鐘下降2℃），可在-196℃液氮或液氮蒸氣中長久保存。下面介紹我們實驗室的細(xì)胞凍存辦法，經(jīng)幾年來對多個細(xì)胞的使用，細(xì)胞復(fù)蘇存活率在80%以上。A、材料a、帶蓋吸管筒一只（鋁質(zhì)或洋鐵皮制），內(nèi)壁（涉及筒底和蓋）襯1-2層石棉紙或石棉布。b、含10-20%血清、5-10%DMSO的HT培養(yǎng)基，冰浴降溫至0℃左右（用作凍存液）。c、滅菌安瓶或帶蓋小瓶。d、-70℃冰箱。e、液氮及液氮罐。f、處在對數(shù)生長中期、健康而活力好的雜交瘤細(xì)胞。B、辦法a、將雜交瘤細(xì)胞（或其它細(xì)胞）離心，重新懸浮于預(yù)冷的凍存液中，濃度為106-107左右/ml，分裝安瓶，每瓶1ml，置冰浴上；安瓶上表明細(xì)胞名稱、凍存日期、批號等。b、安瓶封口后仍置冰浴上。c、將安瓶放入一帶收口繩的小布袋內(nèi)，布袋上表明凍存號、細(xì)胞名稱等，立刻將布袋放入吸管筒內(nèi)，置-70℃冰箱。d、2-4小時后或過夜后從-70℃冰箱取出吸管筒，將盛有細(xì)胞布袋移入液氮罐；在布袋的線繩上作好標(biāo)記或代碼；最后在液氮凍存簿上作具體統(tǒng)計。e、液氮罐應(yīng)定時補充液氮（最佳是專人管理）；補充液氮及存取細(xì)胞時應(yīng)帶保護眼鏡和手套，以免因液氮凍傷等。（2）雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞或其它細(xì)胞在液氮中保存，若無意外狀況時，可保存數(shù)年至數(shù)十年。復(fù)蘇時融解細(xì)胞速度要快，使之快速通過最易受損的-5℃—0℃，以防細(xì)胞內(nèi)形成冰晶引發(fā)細(xì)胞死亡。普通狀況下，凍存時細(xì)胞數(shù)量多，生長狀態(tài)好的雜交瘤細(xì)胞系以及其它細(xì)胞的復(fù)蘇可采用下列辦法，這也是各個實驗室普遍采用的程序。即復(fù)蘇時，從液氮中取出安瓶，立刻在37℃水浴融化，待最后一點冰塊將近融化時，從水浴中取出，置冰浴上。用5-10mlHT培養(yǎng)基稀釋，1000r/min10分鐘，棄上清，再懸浮于適量HT培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶或24孔板，置37℃，%CO2培養(yǎng)。如果細(xì)胞存活力不高，死細(xì)胞太多，可加104-105/ml小鼠腹腔細(xì)胞進行培養(yǎng)。但是，凍存的細(xì)胞并不都能100%復(fù)蘇成功，其因素較多，如凍存時細(xì)胞數(shù)量少或生長狀態(tài)不良，或復(fù)蘇時培養(yǎng)條件變化或辦法不當(dāng)，也可能細(xì)胞受細(xì)菌或支原體污染，以及液氮罐保管不善等。在出現(xiàn)上述狀況時，可采用某些補救辦法復(fù)蘇這些細(xì)胞，如小鼠皮下形成實體瘤法，脾內(nèi)接種法，小鼠腹腔誘生腹水和實體瘤法，以及96孔板培養(yǎng)法等。6、單抗特性的鑒定（1）單克隆性的擬定涉及雜交瘤細(xì)胞的染色體分析、單抗免疫球蛋白重鏈和輕鏈類型的鑒定和單抗純度鑒定等。A、雜交瘤細(xì)胞的染色體分析對雜交瘤細(xì)胞進行染色體分析可獲得其與否是真正的雜交瘤細(xì)胞的客觀指標(biāo)之一，雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目應(yīng)靠近兩種親本細(xì)胞染色體數(shù)目的總和，正常小鼠脾細(xì)胞的染色體數(shù)目為40，小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0為62-68，NS-1為54-56；同時骨髓瘤細(xì)胞的染色體構(gòu)造上反映兩種親本細(xì)胞的特點，除多數(shù)為端著絲點染色體外，還出現(xiàn)少數(shù)標(biāo)志染色體。另首先，雜交瘤細(xì)胞的染色體分析對理解雜交瘤分泌單抗的能力有一定的意義，普通來說，雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目較多且較集中，其分泌能力則高，反之，其分泌單抗能力則低。檢查雜交瘤細(xì)胞染色體的辦法最慣用秋水仙素法，其原理是應(yīng)用秋水仙素特異的破壞紡錘絲而獲得中期分裂相細(xì)胞；再用LKCl溶液等低滲解決，使細(xì)胞膨脹，體積增大，染色體松散；經(jīng)甲醇-冰醋酸溶液固定，即可觀察檢查。其操作環(huán)節(jié)以下：a、在加秋水仙素前48-36小時將雜交瘤細(xì)胞傳代。b、秋水仙素解決：在培養(yǎng)瓶中加入秋水仙素（100ug/ml，除菌，-20℃保存），使最后濃度為（若改用秋水仙胺則最后濃度為）；繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時，然后吹打細(xì)胞，移入離心管中，1000r/min10分鐘，棄上清。c、加入已預(yù)溫到37℃的LKCl溶液5ml，將沉淀細(xì)胞懸浮并混勻，37℃水浴15-20分鐘。d、向懸液中加入新配制的固定液（甲醇與冰醋酸3：1混合）1ml，混勻，然后1000r/min10分鐘，棄去上清液；本環(huán)節(jié)的目的是使細(xì)胞表面輕微固定，可避免固定后細(xì)胞粘連成團塊。e、加入固定液5ml，將細(xì)胞懸液并混勻，室溫靜置20-30分鐘，然后1000r/min10分鐘，棄去上清液；重復(fù)操作一次；其后加5ml固定液，將細(xì)胞懸液并混勻，封上管口，置4℃過夜。f、取出離心管，1000r/min5分鐘，輕輕吸去上清液，根據(jù)細(xì)胞壓積多少而留下固定液，將細(xì)胞懸浮并混勻后，吸取細(xì)胞懸液1-2滴，滴在剛從冰水中取出的載玻片上，用口吹散，并在火焰上通過多次，使細(xì)胞平鋪于載玻片上，自然干燥。g、用新配制的10%Giemsa染液染色10-20分鐘，然后用自來水洗去染液，自然干燥。（Giemsa染液配方：Giemsa粉，甘油33ml，55-60℃保溫2小時，加甲醇33ml混勻，保存于棕色瓶內(nèi)作為原液；取原液1份，加1/15mol/LPBS9份，即成10%Giemsa染液）。h、鏡檢：選擇染色體分散好，無重疊，無失散的細(xì)胞進行觀察分析。每份標(biāo)本應(yīng)計數(shù)100個完整的中期核細(xì)胞，并注意觀察與否有標(biāo)志染色體。8、單抗免疫球蛋白的類別和亞類鑒定抗體的類和亞類對決定提純的辦法有很大的協(xié)助。除采用特殊的免疫辦法和檢測辦法，最經(jīng)常得到的單抗是IgM和IgG，分泌IgE的雜交瘤細(xì)胞極少見，而分泌IgA的雜交瘤普通只有在用于融合的淋巴細(xì)胞來自腸道有關(guān)淋巴組織才干得到。如在抗體檢測中使用葡萄球菌A蛋白試劑，則不可能得到IgG以外的其它類的抗體。鑒定單抗Ig類和亞類的辦法重要有兩種，一種是免疫擴散，另一種是ELISA。（A）免疫擴散法這種辦法簡便、精確，最慣用。被檢的McAb樣品普通為雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，由于其中單抗的濃度較低，應(yīng)先將其濃縮10-20倍左右再檢測。小鼠腹水中的單抗?jié)舛入m很高，但也含有小鼠本身的各類Ig，它們也會與對應(yīng)抗血清發(fā)生反映，使鑒定成果出現(xiàn)混亂，即使將腹水稀釋10-20倍后再檢測也不能完全避免上述狀況的發(fā)生，因此普通不用腹水型單抗作為被檢樣品。材料：a、小鼠IgG及其亞類IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM、IgA的抗血清。b、L巴比妥鈉-鹽酸緩沖液（）。c、1%瓊脂糖凝膠：1g瓊脂糖加入100mlL巴比妥鈉-鹽酸緩沖液中，隔水煮沸溶解，加%NaN3防腐，4℃保存?zhèn)溆?。d、干凈載玻片，打孔器（直徑3mm），濕盒，酒精燈。辦法：a、雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液的濃縮：取該上清液10ml裝入透析袋中，用線扎緊，放在小燒杯中，透析袋周邊堆置PEG6000或蔗糖或PVP（聚乙烯吡咯烷酮polyvinylpyrrolidone），放數(shù)小時，待透析袋內(nèi)液體量濃縮至約時，吸出，可于-20℃保存?zhèn)溆?；也可采用吹風(fēng)蒸發(fā)濃縮。b、加熱溶化1%瓊脂糖凝膠，鋪制瓊脂糖板，每片約3ml。c、待瓊脂凝固后，用打孔器在瓊脂板上打出梅花形的小孔（中央1孔，周邊6孔），然后封底。d、向中央孔加入抗小鼠IgG類或亞類抗血清，周邊孔加入待檢樣品；加樣后將瓊脂板放入濕盒，置37℃水浴箱中12-24小時或4℃過夜，觀察成果。（B）ELISA法該法不需要將樣品濃縮，并且比免疫擴散法更快地得到成果。材料：a、ELISA所需用溶液同雜交瘤細(xì)胞的篩選一節(jié)。b、酶標(biāo)板。c、山羊抗鼠Ig；兔抗小鼠Ig類及亞類特異性血清；HRP結(jié)合的山羊抗兔Ig等。d、待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清；陰性、陽性對照樣品。辦法一a、每孔加入適量的100ul山羊抗小鼠Ig，室溫2小時；洗滌液洗2次。b、每孔加200ul封閉液，室溫作用1小時。c、洗滌液洗2次；加100ul雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，4℃過夜；設(shè)陰性、陽性對照孔。d、洗滌4次，每孔加100ul兔抗小鼠Ig類及亞類特異性抗血清，室溫2小時。e、洗滌4次，加100ulHRP標(biāo)記的山羊抗兔Ig；室溫作用2小時。f、洗滌后，加底物顯色，判讀成果。g、若有HRP標(biāo)記的抗小鼠Ig類及亞類試劑，則可省去e。辦法二a、以適宜濃度的抗原包被酶標(biāo)板，100ul/孔，4℃過夜。b、洗滌后，加入待檢的單抗樣品，100ul/孔，37℃1小時；設(shè)陰性、陽性對照孔。c、洗滌后，加入HRP標(biāo)記的抗小鼠類及亞類Ig的抗體試劑，100ul/孔，37℃避光顯色15分鐘；用2mol/LH2SO4終止反映后，閱讀各孔的OD490值。C、單抗純度的鑒定聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、SDS、等電點聚焦電泳（IEF）及免疫轉(zhuǎn)印分析（WB）等辦法都可用于鑒定單抗的純度。PAGE、SDS、IEF、WB的原理和辦法請參閱有關(guān)專著，這里不再贅述。（2）單抗理化特性的鑒定從實用意義上說，單抗對溫度和PH變化的敏感性以及單抗的親合力都是理化特性鑒定的重要項目，它們可為單抗的使用和保存提供重要根據(jù)。其中單抗親合力測定比較復(fù)雜，下面作簡要介紹。抗體親合力是指抗體與抗原或半抗原結(jié)合的程度，其高低重要是由抗體和抗原分子的大小、抗體分子結(jié)合簇（部）和抗原決定簇之間的立體構(gòu)型的適宜程度決定的。親合力普通以平均內(nèi)在結(jié)合常數(shù)（K）表達(dá)。單抗親合力測定是十分重要的，它可為對的選擇不同用途的單抗提供根據(jù)。在建立多個檢測辦法時，應(yīng)選用高親合力的單抗，以提高敏感性和特異性，并可節(jié)省試劑。而在親和層析時，應(yīng)選用親合力適中的單抗作為免疫吸附劑，由于親合力過低不易吸附，親合力過高不易洗脫。精確測定單抗的親合力是較困難的，好在實際應(yīng)用中選擇單抗時，普通只需測定各單抗的相對親合力及其高低排列次序。慣用的辦法有競爭ELISA、非競爭性ELISA 、間接ELISA、間接法夾心ELISA等，這里僅介紹競爭性ELISA測定單抗親和常數(shù)的辦法。其環(huán)節(jié)是：取適宜濃度的純化抗原包被酶標(biāo)板，100ul/孔，4℃過夜。洗滌后，加入封閉液（%BSA-PBS，）100ul/孔，37℃1小時。取一定濃度的單抗，與系列倍比稀釋的抗原混合，4℃過夜，使反映達(dá)成平衡；必須注意所用抗原濃度最少要比抗體濃度高10倍以上。將平衡后的抗原抗體復(fù)合物加入酶標(biāo)板孔中，100ul/孔，37℃1小時。洗滌后，加入適宜稀釋度的HRP標(biāo)記抗小鼠IgG抗體，100ul/孔，37℃1小時。洗滌后，加入底物（OPD）溶液，100ul/孔，37℃顯色15分鐘；2mol/LH2SO4終止反映后，于495nm波長測定各孔的吸取率（A）。按下列公式計算各單抗的親和常數(shù)（K）：A0/（A0-A）=1+K/a0其中A0=無抗原時A值；A=采用不同濃度抗原時的A值；a0=抗原總量；K=親和常數(shù)。（3）單抗與對應(yīng)抗原的反映性測定單抗與對應(yīng)抗原的反映性決定于它所識別的抗原表位，擬定單抗針對的表位在抗原構(gòu)造上的位置，是單抗特性鑒定的核心環(huán)節(jié)，同時，進一步分析這類表位的差別，可對的評價單抗的特異性和交叉反映性，如某些抗原為同屬不同血清型共有，甚至是科內(nèi)不同屬所共有，而另某些抗原表位則是某種血清型乃至某一菌株或毒株所特有。另外，單抗的反映性往往呈現(xiàn)一種或幾個免疫實驗特異性，這在建株時予以測定，有助于對的使用這些單抗。單抗反映性測定的辦法諸多，涉及各類免疫血清學(xué)實驗、生物學(xué)實驗和免疫化學(xué)技術(shù)等，選擇何種辦法根據(jù)不同的單抗特性和實驗?zāi)康亩ǎ垍㈤営嘘P(guān)論著的具體敘述。三、單克隆抗體的生產(chǎn)獲得穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞系后，即可根據(jù)需要大量生產(chǎn)單抗，以用于不同目的。1、單抗的大規(guī)模制備現(xiàn)在大量制備單抗的辦法重要有兩大系統(tǒng)，一是動物體內(nèi)生產(chǎn)法，這是國內(nèi)外實驗室所廣泛采用；另一是體外培養(yǎng)法。（1）動物體內(nèi)生產(chǎn)單抗的辦法迄今為止，普通狀況下均采用動物體內(nèi)生產(chǎn)單抗的辦法，鑒于絕大多數(shù)動物用雜交瘤均由BALB/c小鼠的骨髓瘤細(xì)胞與同品系的脾細(xì)胞融合而得，因此使用的動物固然首選BALB/c小鼠。本辦法即將雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠腹腔內(nèi)，在小鼠腹腔內(nèi)生長雜交瘤，并產(chǎn)生腹水，因而可得到大量的腹水單抗且抗體濃度很高。可見該法操作簡便、經(jīng)濟，但是，腹水中常混有小鼠的多個雜蛋白（涉及Ig），因此在諸多狀況下要提純后才干使用，并且尚有污染動物病毒的危險，故而最佳用SPF級小鼠。A、材料a、成年BALB/c小鼠。b、降植烷（Pristance）或液體石蠟。c、處在對數(shù)生長久的雜交瘤細(xì)胞。B、辦法a、腹腔接種降植烷或液體石蠟，每只小鼠。b、7-10天后腹腔接種用PBS或無血清培養(yǎng)基稀釋的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠5×105/。c、間隔5天后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生狀況，如腹部明顯膨大，以手觸摸時，皮膚有緊張感，即可用16號針頭采集腹水，普通可持續(xù)采2-3次，普通每只小鼠可采5-10ml腹水；d、將腹水離心（r/min5分鐘），除去細(xì)胞成分和其它的沉淀物，收集上清，測定抗體效價，分裝，-70℃凍存?zhèn)溆?，或凍干保存。?）體外培養(yǎng)生產(chǎn)單抗的辦法總體上講，雜交瘤細(xì)胞系并不是嚴(yán)格的貼壁依賴細(xì)胞（anchoragedependentcell，ADC），因此既能夠進行單層細(xì)胞培養(yǎng)，又能夠進行懸浮培養(yǎng)。雜交瘤細(xì)胞的單層細(xì)胞培養(yǎng)法是各個實驗室最慣用的手段，即將雜交瘤細(xì)胞加入培養(yǎng)瓶中，以含10-15%小牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞濃度以1×106-2×106/ml為佳，然后收集培養(yǎng)上清，其中單抗含量約10-50ug/ml。顯然，這種辦法制備的單抗量極為有限，無疑是不合用于單抗的大規(guī)模生產(chǎn)。要想在體外大量制備單抗，就必須進行雜交瘤細(xì)胞的大量（高密度）培養(yǎng)。單位體積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量越多，細(xì)胞存活時間越長，單抗的濃度就越高，產(chǎn)量就越大?，F(xiàn)在在雜交瘤細(xì)胞的大量培養(yǎng)中，重要有兩種類型的培養(yǎng)系統(tǒng)。其一是懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，采用轉(zhuǎn)瓶或發(fā)酵罐式的生物反映器，其中涉及使用微載體；其二是細(xì)胞固定化培養(yǎng)系統(tǒng)，涉及中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和微囊化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。a、懸浮培養(yǎng)法：現(xiàn)在小規(guī)模懸浮培養(yǎng)多采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，通過攪拌使細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)；而大規(guī)模懸浮培養(yǎng)多采用發(fā)酵式的生物反映器，美國、加拿大、法國和德國等幾家公司生產(chǎn)這類反映器，其培養(yǎng)方式可分為純批式、流加式、半持續(xù)式和持續(xù)式。b、微載體培養(yǎng)法：微載體（Microcarrier）是以小的固體顆粒作為細(xì)胞生長的載體，在攪拌作用下微載體懸浮于培養(yǎng)液中，細(xì)胞則在固體顆粒表面生長成單層?？捎米骷?xì)胞大量培養(yǎng)的微載體重要以交聯(lián)瓊脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作為基質(zhì)的產(chǎn)品，其中以CytodexI，Biosilon和Superbeads為好。微載體培養(yǎng)的基本辦法上與懸浮培養(yǎng)相似。近來的研究表明，該法是雜交瘤細(xì)胞大量培養(yǎng)的抱負(fù)途徑之一。c、中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)：該系統(tǒng)由中空纖維生物反映器、培養(yǎng)基容器、供氧器和蠕動泵等構(gòu)成。用于細(xì)胞培養(yǎng)的中空纖維由乙酸纖維、聚氯乙烯-丙烯復(fù)合物、多聚碳酸硅等材料制成，外徑普通為100-500um，壁厚25-75um，壁呈海綿狀，上面有許多微孔。中空纖維的內(nèi)腔表面是一層半透性的超濾膜，其孔徑只允許營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物出入，而對細(xì)胞和大分子物質(zhì)（如單抗等）有滯留作用?，F(xiàn)在使用的中空纖維生物反映器分為柱式、板框式和中心灌流式。盡管該培養(yǎng)系統(tǒng)在大規(guī)模生產(chǎn)單抗時成本較低，并可獲得高產(chǎn)量高純度的抗體，由于設(shè)備價格昂貴，限制了其使用范疇。d、微囊化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)：該系統(tǒng)是先將雜交瘤細(xì)胞微囊化，然后將此含有半透膜的微囊置于培養(yǎng)液中進行懸浮培養(yǎng)，一定時間后，從培養(yǎng)液中分離出微囊，沖洗后打開囊膜，離心后即可獲得高濃度的單抗?？傊鲜鏊姆N體外培養(yǎng)生產(chǎn)單抗的辦法仍處在發(fā)展之中；隨著研究的不停進一步和技術(shù)的完善，它們將會在單抗生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化進程中發(fā)揮越來越大的作用。（3）雜交瘤細(xì)胞的無血清培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)絕大多數(shù)應(yīng)用DMEM或RPMI-1640為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加10-20%胎牛或新生小牛血清?；A(chǔ)培養(yǎng)基重要提供多個氨基酸、維生素、葡萄糖、無機鹽、多個合成核酸和脂質(zhì)的前體物質(zhì)。而血清重要供應(yīng)雜交瘤細(xì)胞等多個營養(yǎng)成分，血清中的激素可刺激細(xì)胞生長，其中的許多蛋白質(zhì)能結(jié)合有毒性的離子和熱源質(zhì)而起解毒作用，同時這些蛋白質(zhì)對激素、維生素和脂類有穩(wěn)定和調(diào)節(jié)作用。但是，血清中含有上百種的蛋白質(zhì)，這給單抗的純化帶來很大麻煩，而未純化的含有異種蛋白的單抗用于動物治療可誘發(fā)變態(tài)反映；加之，血清來源有限；每批血清之間質(zhì)量差別較大，直接影響成果的穩(wěn)定性，同時血清是雜交瘤細(xì)胞發(fā)生支原體污染的最重要來源之一，并且價格較貴，為了克服血清的這些缺點，采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞越來越受到廣泛重視。無血清培養(yǎng)的實質(zhì)就是用多個不同的添加劑來替代血清，然后進行雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)?，F(xiàn)在已報道的各類無血清培養(yǎng)基有含有大豆類脂的、含有酪蛋白的、化學(xué)限定性的、無蛋白的、含有血清低分子量成分的無血清培養(yǎng)基，其中一部分已有產(chǎn)品出售。綜合這些無血清培養(yǎng)基，約有幾十種不同的添加劑可用于無血清培養(yǎng)基，在其中最少必須添加胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺和亞硒酸鈉這四種成分，才干起到類似血清的作用，其它較重要的添加劑涉及白蛋白、亞油酸和油酸、抗壞血酸以及錳等某些微量元素。采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞制備單抗，有助于單抗的純化，有助于大規(guī)模生產(chǎn)，可減少細(xì)胞污染的機會，且成本較低。但無血清培養(yǎng)細(xì)胞的生產(chǎn)率低、細(xì)胞密度小，影響了單抗的產(chǎn)量；同時無血清培養(yǎng)基還缺少血清中保護細(xì)胞免受環(huán)境中蛋白酶損傷的克制因子等。盡管如此，無血清培養(yǎng)基終究會成為雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的抱負(fù)的培養(yǎng)基。2、單抗的純化（1）腹水型單抗的純化在單抗純化之前，普通均需對腹水進行預(yù)解決，目的是為了進一步除去細(xì)胞及其殘渣、小顆粒物質(zhì)、以及脂肪滴等。慣用的辦法有二氧化硅吸附法和過濾離心法，以前者解決效果為佳，并且操作簡便。a、二氧化硅吸附法：新鮮采集的腹水（或凍存的腹水），r/min15分鐘，除去細(xì)胞成分（或凍存過程中形成的固體物質(zhì)）等；取上層清亮的腹水，等量加入巴比妥緩沖鹽水（VBS；L巴比妥，LNaCl，LMg2+，LCa2+）稀釋；然后以每10ml腹水中加150mg二氧化硅粉末，混勻，懸液在室溫孵育30分鐘，不時搖動；g離心20分鐘，脂質(zhì)等通過該法除去，即可得澄清得腹水。b、過濾離心法：用微孔濾膜過濾腹水，以除去較大得凝塊及脂肪滴；用10000g15分鐘高速離心（4℃）除去細(xì)胞殘渣及小顆粒物質(zhì)。c、混正當(dāng)：即上述兩法的組合，先將腹水高速離心，取上清液再用二氧化硅吸附解決。（2）單抗的粗提A、硫酸銨沉淀法a、飽和硫酸銨溶液的配制：500g硫酸銨加入500ml蒸餾水中，加熱至完全溶解，室溫過夜，析出的結(jié)晶任其留在瓶中。臨用前取所需的量，用2mol/LNaOH調(diào)PH至。b、鹽析：吸取10ml解決好的腹水移入小燒杯中，在攪拌下，滴加飽和硫酸銨溶液；繼續(xù)緩慢攪拌30分鐘；10000r/min離心15分鐘；棄去上清液，沉淀物用1/3飽和度硫酸銨懸浮，攪拌作用30分鐘，同法離心；重復(fù)前一步1-2次；沉淀物溶于PBS（L）或Tris-HCl緩沖液中。c、脫鹽：慣用柱層析或透析法。柱層析法是將鹽析樣品過SephadexG-50層析柱，以PBS或Tris-HCl緩沖液作為平衡液和洗脫液，流速每分鐘1ml。第一種蛋白峰即為脫鹽的抗體溶液。透析法是將透析袋于2%NaHCO3，1mmol/LEDTA溶液中煮10分鐘，用蒸餾水清洗透析袋內(nèi)外表面，再用蒸餾水煮透析袋10分鐘，冷至室溫即可使用（并可于LEDTA溶液中，4℃保存?zhèn)溆茫?。將鹽析樣品裝入透析袋中，對50-100倍體積的PBS或Tris-HCl緩沖液透析（4℃）12-24小時，其間更換5次透析液，用萘氏試劑（碘化汞，碘化鉀8g，加蒸餾水50ml，待溶解后，再加20%NaOH50ml）檢測，直至透析外液無黃色物形成為止。d、蛋白質(zhì)含量的測定：（Pr）（mg/ml）=（××OD260）×稀釋倍數(shù)；或（Pr）=OD280×稀釋倍數(shù)/3e、分裝凍存?zhèn)溆?。B、辛酸-硫酸銨沉淀法該法簡樸易行，適合于提純IgG1和IgG2b，但對IgG3和IgA的回收率及純化效果差。其重要環(huán)節(jié)以下：取1份預(yù)解決過的腹水加2份L醋酸緩沖液，用1mol/LHCl調(diào)PH至；按每毫升稀釋腹水加11ul辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，于30分鐘內(nèi)加完，4℃靜置2小時，取出15000g離心30分鐘，棄沉淀；上清經(jīng)尼龍篩過濾（125um），加入1/10體積的LPBS，用1mol/LNaOH調(diào)PH至；在4℃下加入硫酸銨至45%飽和度，作用30分鐘，靜置1小時；10000g離心30分鐘，棄上清；沉淀溶于適量PBS（含137mmol/LNaCl，LKCl，LEDTA）中，對50-100倍體積的PBS透析，4℃過夜，其間換水3次以上；取出10000g離心30分鐘，除去不溶性沉渣，測定蛋白質(zhì)含量后，分裝，凍存?zhèn)溆谩、優(yōu)球蛋白沉淀法該法合用于IgG3和IgM型單抗的提取，所獲制品的抗體活性幾乎保持不變，對IgG3單抗的回收率高于90%，對IgM單抗的回收率為40-90%不等。其操作環(huán)節(jié)以下：取一定量的預(yù)解決過的腹水，先后加入NaCl和CaCl2，使各自的濃度分別達(dá)L和25mmol/L，隨之可見纖維蛋白的產(chǎn)生；經(jīng)濾紙過濾后，濾液對100倍體積的去離子水透析，4℃8-15小時（若是IgG3單抗，也可室溫2小時），其間換水1-2次；取出后2g離心30分鐘，棄上清；將沉淀溶于1mol/LNaCl，LTris-HCl溶液中，重復(fù)上述的透析與離心；將沉淀的優(yōu)球蛋白濃度調(diào)至5-10mg/ml，分裝凍存?zhèn)溆?。?）單抗純化的辦法單抗純化的辦法有諸多個，應(yīng)根據(jù)具體單抗的特性和實驗條件選擇適宜的辦法，慣用的技術(shù)有DEAE離子交換層析柱、凝膠過濾法和親和層析法三種。3、單抗的標(biāo)記現(xiàn)在動物用單抗，在動物疫病診療和檢疫、妊娠檢測、性別鑒定等方面有廣泛的應(yīng)用，大多以診療試劑（盒）的形式提供，其中核心試劑為標(biāo)記的單抗。下面將介紹最慣用的幾個標(biāo)記技術(shù)。（1）酶標(biāo)記A、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體和多克隆抗體的慣用辦法是過碘酸鈉法。其原理是HRP的糖基用過碘酸鈉氧化成醛基，加入抗體IgG后該醛基與IgG氨基結(jié)合，形成Schiff氏堿。為了避免HRP中糖的醛基與其本身蛋白氨基發(fā)生偶合，在用過碘酸鈉氧化先用二硝基氟苯阻斷氨基。氧化反映末了，用硼氫化鈉穩(wěn)定Schiff氏堿。這里介紹兩種程序。程序一a、將5mgHRP溶于LNaHCO3溶液中；加10mmol/LNaIO4溶液，混勻，蓋緊瓶塞，室溫避光作用2小時。b、加LNa2CO3混勻。c、加入小鼠已解決的腹水，或純化單抗等（15mg/ml），混勻。d、稱取SephadexG25干粉，加入一支下口墊玻璃棉的5ml注射器外筒內(nèi)；隨即將上述交聯(lián)物移入注射器外套；蓋緊，室溫作用（避光）3小時或4℃過夜。e、用少量PBS將交聯(lián)物全部洗出，收集洗出液，加1/20V體積新鮮配制的5mg/mlNaBH4溶液，混勻，室溫作用30分鐘；再加入3/20VNaBH4溶液，混勻，室溫作用1小時（或4℃過夜）。f、將交聯(lián)物過SephadexG200或Sepharose6B（×50cm）層析純化，分管收集第一峰。g、酶結(jié)合物質(zhì)量鑒定：克分子比值測定酶量（mg/ml）=OD403×IgG量（mg/ml）=（OD280-OD403×）×克分子比值（E/P）=酶量×4/IgG量，普通在1-2之間。酶結(jié)合率=酶量×體積/抗體，標(biāo)記率普通為，即1-2個HRP分子結(jié)合在一種抗體分子上，標(biāo)記率可不不大于，，；OD403/OD280等于時，E/P約為1。標(biāo)記率=OD403/OD280酶活性和抗體活性的測定可應(yīng)用ELISA法、免疫擴散、DAB-H2O2顯色反映測定酶結(jié)合物的酶活性，抗體活性及效價、特異性。HRP抗體結(jié)合物的保存：加入等量甘油后，小量分裝-20℃寄存，避免重復(fù)凍融；或加入等量60%甘油4℃保存；不適宜加NaN3或酚防腐，否則會影響酶活性。必要時凍干保存，以BSA或脫脂牛奶作保護劑。程序二1、將5mgHRP溶于LNaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯無水乙醇溶液，室溫攪拌作用1小時，以封閉HRP分子上的α和ε氨基。2、再加1mlL過碘酸鈉溶液，在室溫中避光輕攪30分鐘，溶液呈黃綠色；隨即加1mlL乙二醇，輕攪1小時，中斷氧化反映。3、移入透析袋中，在1000mlL碳酸鹽緩沖液中，4℃透析過夜，更換