實驗動物基因工程研究進(jìn)展

實驗動物基因工程研究進(jìn)展

目前，實驗動物育種的研究非?；钴S，取得了良好的效果。本文僅對國內(nèi)外實驗動物基因工程的研究作一綜述,以供讀者參考。1小鼠基因犯罪基因圖譜就是研究基因組結(jié)構(gòu),查明染色體上基因序列。目前研究者們正在有計劃地、大規(guī)模地對包括人類在內(nèi)的重要生物體的全基因圖譜進(jìn)行測序與詮釋。以期繪制出遺傳連鎖圖、物理圖、序列圖和轉(zhuǎn)錄圖等主要圖譜。由Watson發(fā)起的人類基因組計劃,經(jīng)許多國家科學(xué)家的努力,人類的基因序列已被基本闡明。豬的基因圖譜正由英、法、德、美等10個國家18個單位進(jìn)行研究;牛的基因圖譜以歐洲為主,由13個國家30個單位繪制;羊的基因圖譜由新西蘭和北歐共同研究;家禽由英、美、荷蘭、以色列等國研究。20世紀(jì)80年代以來,小鼠基因圖譜的研究取得了很大進(jìn)展。在小鼠基因作圖技術(shù)上有了突破性進(jìn)展,如:①建立了種間回交繪圖平臺,由于雜交親本之間遺傳多態(tài)性程度很高,基本上任何一個基因都可在單位雜交中被定位。最常使用的親本是C57BL/6J和musSpertus?，F(xiàn)可供使用的種間回交繪圖平臺是JacksonLaboratoryInterspecific(JLIB)和EuropeanCollaborativeInterspecificBackcross。②90年代以來,應(yīng)用微衛(wèi)星DNA技術(shù),鑒定了數(shù)量眾多的簡單序列長度多態(tài)性標(biāo)記(SSLP),在小鼠,目前已有總數(shù)為6555個SSLP被定位。③在小鼠突變基因位點的定位與克隆方面,目前已有1000多個自發(fā)或誘發(fā)的小鼠突變基因位點被定位,這些突變的表型很多與人類疾病表型相一致,因此可用小鼠突變基因鑒定人類的同源基因。④在小鼠物理圖譜研究上,已構(gòu)建了小鼠YAC文庫并已標(biāo)出9787個標(biāo)記位點,平均相鄰兩個標(biāo)記位點之間的距離為300kb,每個YAC克隆平均含有820kb小鼠染色體DNA,所有YAC共覆蓋了92%的小鼠基因組。⑤在小鼠轉(zhuǎn)錄圖的研究中,現(xiàn)已得到40萬條表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)及其定位的信息,8000個基因被定位在染色體的相應(yīng)位置。⑥小鼠基因組測序,由于小鼠基因組總長度接近于人類,其測序難度也接近于人類基因組測序。作為模式生物,小鼠基因組測序被作為人類基因組計劃的內(nèi)容之一,預(yù)計2003年可完成全序列圖。2dna多態(tài)性分析的應(yīng)用分子遺傳標(biāo)記是所有遺傳分析的基礎(chǔ),是進(jìn)行基因連鎖分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、動物遺傳育種及生物進(jìn)化與分類研究中不可缺少的工具。隨著限制性內(nèi)切酶和DNA重組技術(shù)的出現(xiàn)以及分子生物學(xué)的飛速發(fā)展,遺傳標(biāo)記開始轉(zhuǎn)向遺傳物質(zhì)-DNA分子。由于各種遺傳信息都蘊藏在DNA分子中,生物性狀間的差異在本質(zhì)上是DNA分子的差異,因此DNA是最可靠的遺傳標(biāo)記。近10年來,在人類基因組計劃(HGT)的推動下,分子標(biāo)記的研究與應(yīng)用得到了迅速的發(fā)展。自1980年Botstein首先提出利用限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)構(gòu)建人類遺傳連鎖圖以來,遺傳標(biāo)記的數(shù)量已不再成為限制因素。用于DNA多態(tài)性分析的技術(shù)相繼被提出并得到廣泛應(yīng)用。在以分子雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的RFLP分子標(biāo)記外,Jeffreys(1985)首先發(fā)現(xiàn)并建立了DNA指紋技術(shù)(DFP),此外還有可變數(shù)目串連重復(fù)位點(VNTRs)多態(tài)性分析、單位點小衛(wèi)星多態(tài)性分析等。近年來又發(fā)展了以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記方法,諸如:隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD,Williams,Welsh,1990)、序列靶標(biāo)位點(STS,Olson,1989)、微衛(wèi)星DNA(亦稱簡單重復(fù)序列,SSR,Litt&Luty,Weber&May,1989)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP,ZabeauMarc,VosPieter,1992)等。上述技術(shù)被廣泛應(yīng)用于實驗動物的遺傳檢測、親子鑒定、品種(系)的遺傳純度及遺傳距離的測定、重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳標(biāo)記、群體遺傳變異分析、動物的起源與親緣關(guān)系分析、標(biāo)記輔助選擇(MAS)等方面。同時,在基因制圖、連鎖分析、基因定位和遺傳病診斷等方面也得到廣泛應(yīng)用。Jeffreys(1987)采用33.6和33.15為探針檢測了6個近交系小鼠及野生家鼠的DFP;Sudo等(1993)對實驗兔進(jìn)行了DFP分析;Woodward等(1994)用481條引物檢出近交系小鼠95個RAPD多態(tài)位點,結(jié)合重組近交系分析,構(gòu)建了含有76個多態(tài)標(biāo)記的遺傳圖。目前已發(fā)現(xiàn)近交系大鼠微衛(wèi)星位點8000多個,每一個微衛(wèi)星位點都具有1~10個等位基因。我國實驗動物界也廣泛采用DNA標(biāo)記技術(shù)開展了實驗動物的遺傳檢測及遺傳特征分析,如:董罡等(2000)用JL-02多位點探針對近交系小鼠DFP進(jìn)行了分析,李瑞生等(2001)進(jìn)行了DFP、SSR在近交系大鼠遺傳檢測的應(yīng)用研究。在RAPD方面,先后開展了西雙版納小型豬、巴馬小型豬、貴州小型豬、10余個小鼠品系、兔的RAPD研究;此外,對貴州小型豬的AFLP、小型豬的SSR也進(jìn)行了研究。研究結(jié)果顯示,分子遺傳標(biāo)記技術(shù)在實驗動物中具有廣闊的應(yīng)用前景。3動物模型的開發(fā)實驗動物基因組的改造與操縱,能夠制備具有各種用途的動物模型,已成為生命科學(xué)研究中十分重要的技術(shù)平臺之一。小鼠基因組的改造與操縱目前已取得了明顯進(jìn)展。3.1基因組織特點基因剔除(geneknockout)是指通過同源重組原理,向ES細(xì)胞內(nèi)源基因引入特定的突變(點突變、缺失、轉(zhuǎn)位、倒位、全突變),使靶基因功能喪失或部分喪失。這種特定的突變可通過生殖系傳遞下去。自1990年起,發(fā)達(dá)國家十分重視基因剔除小鼠技術(shù)。一旦某種人類疾病基因被克隆成功,便可制備相應(yīng)的基因剔除小鼠,從而對該基因的功能和作用途徑進(jìn)行研究。目前許多基因剔除小鼠被用作人類疾病模型。我國先后從國外引進(jìn)了BALB/c—HSF1和Smad3基因剔除小鼠,并對其引種、保種、繁殖特性、基因型鑒定、遺傳穩(wěn)定性等進(jìn)行了研究。3.2小鼠人源染色體區(qū)域采用轉(zhuǎn)大片段DNA技術(shù),用人的染色體片段取代小鼠相應(yīng)的染色體區(qū)域。這種含有人源染色體片段的小鼠即可稱為“人化小鼠”。人化小鼠具有廣泛的用途,如:遺傳功能分析、模擬人類染色體疾病、制造特定的基因產(chǎn)品等。3.3實現(xiàn)資源共享與小鼠疾病模型相關(guān)的一系列生物信息數(shù)據(jù)庫已經(jīng)建立,因此只要建立網(wǎng)絡(luò)平臺,在網(wǎng)上就可進(jìn)行許多工作。這類研究的對象被稱作“電子小鼠”。目前有很多“電子小鼠”的數(shù)據(jù)庫,如:美國有Jackson實驗室的“小鼠基因組數(shù)據(jù)庫”、“小鼠基因組百科全書”、“基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫”、“人類孟德爾遺傳在線”、“小鼠突變體資源庫”、“定位突變數(shù)據(jù)庫”等,英國有“小鼠細(xì)胞遺傳圖譜”、“嚙齒類基因組數(shù)據(jù)庫”、“畸形小鼠同源數(shù)據(jù)庫”等。通過互聯(lián)網(wǎng)就可實現(xiàn)資源共享。此外,數(shù)量性狀定位(QTL)、誘變技術(shù)等也在實驗動物中廣泛應(yīng)用。4sv0cda的基因表達(dá)在小鼠精子外源基因中的表達(dá)轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgenictechnique)是基因工程與胚胎工程結(jié)合的一門生物技術(shù)。轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)是使用基因工程技術(shù)將選定的目的基因?qū)雱游锶旧w組上,整合并表達(dá)和遺傳的過程。攜帶和表達(dá)外源基因的動物稱為轉(zhuǎn)基因動物(transgenicanimal)。轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)過程包括目的基因的構(gòu)建、基因的轉(zhuǎn)移、基因的整合及表達(dá)等。將目的基因?qū)雱游锘蚪M的方法有原核注射法、反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法、胚胎干細(xì)胞法、精子介導(dǎo)法、卵母細(xì)胞質(zhì)注射法、發(fā)生泡基因注射法、基因粒子槍法等。美國科學(xué)家Jaenisch(1974)最早把猿猴病毒40(SV40)注入小鼠囊胚腔得到部分體組織中含有SV40DNA的嵌合體小鼠,1976年他們利用反轉(zhuǎn)錄病毒與小鼠卵裂球共培養(yǎng)把莫氏白血病病毒基因插入小鼠基因組,建立了世界上第一個轉(zhuǎn)基因小鼠系。1980年,Gordon等把SV40DNA顯微注射到小鼠受精卵的原核中,獲得了兩只轉(zhuǎn)基因小鼠,創(chuàng)建了顯微注射轉(zhuǎn)基因方法。1982年,Palmiter和Brinster用顯微注射法把大鼠的生長激素基因?qū)胄∈笫芫阎?獲得了體重是對照組小鼠2倍的“超級鼠”,首先證明外源基因可在受體表達(dá),并且表達(dá)產(chǎn)物具有生物活性。從此,轉(zhuǎn)基因技術(shù)受到生物學(xué)界的廣泛重視并得到迅速發(fā)展。至今已制備出轉(zhuǎn)基因小鼠、大鼠、兔、雞、魚、牛、豬、羊等多種動物的轉(zhuǎn)基因品系。我國從20世紀(jì)80年代初期開始轉(zhuǎn)基因動物研究,先后成功地將人β-球蛋白基因、大腸桿菌galk和gpt基因、牛及人生長激素基因?qū)胄∈笫芫阎?獲得了多種轉(zhuǎn)基因小鼠。近年來,采用大片段DNA導(dǎo)入技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因小鼠亦有報道。如,轉(zhuǎn)YAC、BAC和PI小鼠,轉(zhuǎn)染色體小鼠等。近年來,轉(zhuǎn)基因動物被用來非活性蛋白或用外分泌器官生產(chǎn)活性蛋白。1987年,Simons等在轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁中得到綿羊的β-球蛋白,1988年又從轉(zhuǎn)基因綿羊乳汁中得到了α-抗胰蛋白酶。后來,抗凝血因子Ⅸ(Clayk等,1989)、組織纖維蛋白溶酶原激活因子(TPA)(Ebert等,1991)、蛋白質(zhì)C(Velander等,1992)、凝血因子Ⅷ(Halter