五倍子多酚化合物對(duì)人工齲再礦化的影響

五倍子多酚化合物對(duì)人工齲再礦化的影響

在牙齒上，牙齒中有機(jī)化合物的質(zhì)量比為20%，是電池的20倍，其中非膠原占有機(jī)成分的10%左右。此外，dpp是牙齒中主要的非晶態(tài)氧化物（dentinphonet，dpp）。的發(fā)育礦化中起重要作用,還影響根齲的再礦化,研究認(rèn)為去除游離狀態(tài)下的可溶性DPP(solubleDPP,S-DPP)對(duì)根齲再礦化有利。五倍子與以往的再礦化藥物不同,含有大量的鞣酸、沒(méi)食子鞣酸,研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)牙釉質(zhì)齲及早期根面齲具有再礦化作用,然而尚未有研究報(bào)道五倍子提取物對(duì)根面齲提取S-DPP后的再礦化影響。因此本文對(duì)此進(jìn)行研究,為今后五倍子臨床應(yīng)用防齲奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1材料和方法1.1改性純?nèi)ルx子水五倍子多酚化合物(GCE):由四川大學(xué)華西藥學(xué)院天然藥化教研室制備。1000g五倍子粉碎,以3000mL去離子水于60～70℃水浴10h,振搖,過(guò)濾,濾渣,重復(fù)上次操作,合并濾液,加活性炭脫色,過(guò)濾,濾液濃縮至稠膏狀,加95%乙醇,攪拌溶解,過(guò)濾,乙醇液減壓濃縮得類白色粉末狀物為GCE,純?nèi)ルx子水配制濃度為4mg/mL的溶液,調(diào)pH為7.0。以下溶液均以分析純?nèi)ルx子水配制,由Millipore純化系統(tǒng)提供純水配制:羅丹明B(上?；瘜W(xué)試劑廠,配制成1mmol/L),0.5mol/LNaCl溶液(成都化學(xué)試劑廠,分析純)。硬組織切割機(jī)(Struersminitom,丹麥),磁力攪拌器(85-2型,上海司樂(lè)儀器有限公司,中國(guó)),偏振光顯微鏡(EllipseME600LNikon,日本),激光共聚焦顯微鏡(BioRADCo,1024ES,美國(guó))。1.2牛牙的制備球磨取同一天新鮮拔除的牛切牙(從市場(chǎng)獲得幼牛年齡基本相同),存于麝香草酚液中,除去表面有機(jī)污染物及纖維組織,超聲洗凈,體視顯微鏡檢查(放大10倍)無(wú)裂痕、缺隙、齲損、氟斑,置于去離子水中,-20℃冰箱保存,備用。取備用牛牙,分離冠根,去除牙根表層牙骨質(zhì),用高速硬組織切割機(jī)切下牙根頸部6mm長(zhǎng)度牙本質(zhì)塊。用拋光機(jī)及800#-1200#-2400#碳化硅砂紙將牙本質(zhì)塊在流水下依次磨平、拋光。將14顆牛切牙牙本質(zhì)塊標(biāo)本均沿頰舌向縱向剖開(kāi),分別形成近中面和遠(yuǎn)中面牙本質(zhì)塊。每個(gè)牙本質(zhì)表面分別形成4mm×4mm開(kāi)窗區(qū),其余部位涂布兩層抗酸指甲油。1.3表層下脫礦司法脫礦液1:50mmol/L乙酸,5mmolHEPES,1.5mmol/LCaCl2-2H2O,0.9mmol/LKH2PO4,0.5mg/LNaF(pH5.0),形成表層下脫礦(subsurfacelesion)。脫礦液2:0.1mol/L乙酸(pH4.0),形成酸蝕性病損(erosivelesion)。1.4提取s-dpp將樣本黏在玻棒上,表面處理面積與溶液的比率為20mm2/10mL;每顆牙本質(zhì)塊近中面用脫礦液1脫礦,遠(yuǎn)中面用脫礦液2脫礦,磁力攪拌器攪拌37℃下100r/min,每顆牙本質(zhì)塊脫礦液處理3d,結(jié)束后封閉半個(gè)脫礦區(qū),暴露的半邊浸泡在0.5mol/LNaCl溶液12h(提取S-DPP)后,重新暴露封閉區(qū),進(jìn)入GCE處理循環(huán)1周。循環(huán)前4d為GCE處理21h/d,脫礦處理3h/d,后3dGCE處理24h。1.5樣品的制備和清洗樣本脫礦后提取S-DPP前不同形態(tài)根面齲模型(表層下脫礦和酸蝕性病損)隨機(jī)選擇兩個(gè)樣本,采用連續(xù)切片技術(shù),低速鋸床從牙塊開(kāi)窗區(qū)中央將牙齒鋸開(kāi),然后切成約300μm厚的牙片,用蜂蠟和冷杉膠混合膠將牙片貼附于載玻片上,待冷固后,流水下磨制成薄片,約100μm,用細(xì)粒度為1200目的砂紙拋光,吸水干燥后將載玻片放入二甲苯中使混合膠溶解,磨片與載玻片分離。用水浸泡24h后PLM觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取出樣本,清洗根部牙體組織塊開(kāi)窗區(qū)外封閉的指甲油。清洗過(guò)程為丙酮溶液、水、中性洗滌液、酒精。清洗時(shí)間約1h。清洗完畢后的標(biāo)本置于-4℃冰箱待用。LSCM(激發(fā)波長(zhǎng)為543nm,發(fā)射波長(zhǎng)為590nm)對(duì)樣本進(jìn)行分析,將樣本用低速鋸床制成200～150μm厚的縱切片,37℃下用新配制的羅丹明B0.1mmol/L染色1h。通過(guò)計(jì)算機(jī)成像并檢測(cè)平均熒光量(averagefluorescence,AF),測(cè)量所用的軟件為QuantifyPro軟件。1.6統(tǒng)計(jì)方法同一種病損形態(tài)提蛋白前后GCE再礦化結(jié)果分析用配對(duì)t檢驗(yàn),α=0.05。2結(jié)果2.1表層結(jié)構(gòu)檢驗(yàn)PLM觀察結(jié)果顯示脫礦液1形成的表層下脫礦具有完整的牙體組織(圖1A),沒(méi)有形成實(shí)質(zhì)性的缺損,且形成了較明顯的表層結(jié)構(gòu)(表層的密度高于表層下組織),符合本次實(shí)驗(yàn)要求。脫礦液2形成的酸蝕性病損具有表層喪失的特點(diǎn)(圖1B),且脫礦區(qū)表層組織密度明顯下降(表現(xiàn)為光線透射增強(qiáng)),越接近脫礦區(qū)底部密度越高,且脫礦區(qū)可見(jiàn)到明顯的膠原纖維紋路,該區(qū)可能礦物質(zhì)大量喪失,而主要由纖維組織組成。2.2熒光染色與未提蛋白af值的比較LSCM觀察表明表層下脫礦類型盡管表層比較完整,但熒光液滲入仍然高于表層下組織,而在整個(gè)脫礦區(qū)均有較明顯熒光液滲入(圖2A、2B),提蛋白前后圖像未發(fā)現(xiàn)有明顯差異。而在酸蝕性病損下則呈現(xiàn)相反的情況,表層區(qū)熒光染色最模糊,越接近正常組織,熒光染色越明顯(圖2C、2D),而熒光染色在提取蛋白后比未提蛋白略顯模糊。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,表層下脫礦提取蛋白后的AF值(18.67±6.37)與未提取蛋白AF值(23.65±1.03)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而酸蝕性病損條件下提蛋白后的AF值(11.77±5.87)低于未提蛋白的AF值(27.65±6.42,P<0.05)。3提取溶劑及濃度的選擇牙齒牙本質(zhì)由無(wú)機(jī)物、有機(jī)物和水組成。占牙本質(zhì)質(zhì)量70%的無(wú)機(jī)成分中,主要是羥基磷灰石晶體(HAP),因而HAP在牙本質(zhì)再礦化動(dòng)力學(xué)過(guò)程中起主導(dǎo)作用。目前對(duì)牙本質(zhì)有機(jī)成分在再礦化中的作用有了較明確的研究結(jié)果,認(rèn)為牙本質(zhì)的再礦化是殘余HAP晶體發(fā)生化學(xué)反應(yīng),從而重新結(jié)晶的過(guò)程,而膠原蛋白成分主要為有機(jī)纖維,是牙本質(zhì)基質(zhì)的主要成分,主要起惰性基質(zhì)作用,非膠原蛋白(主要為DPP)又分為兩種情況,即可溶和不可溶形式。研究認(rèn)為脫礦牙本質(zhì)中可溶性磷蛋白對(duì)再礦化起阻礙作用,S-DPP在礦化過(guò)程中的作用類似于無(wú)機(jī)雜質(zhì)離子,抑制動(dòng)力學(xué)過(guò)程的反應(yīng)速率,因此建議去除S-DPP以提高再礦化潛能。EDTA和NaCl溶液等是研究較多的提取非膠原蛋白液,但EDTA對(duì)HAP有脫礦作用,對(duì)再礦化實(shí)驗(yàn)有影響,而NaCl不會(huì)導(dǎo)致脫礦。因此本實(shí)驗(yàn)選擇NaCl溶液作為S-DPP提取液。有研究表明當(dāng)NaCl溶液為0.5mmol/L時(shí)作用12h提蛋白效果最好,因此本實(shí)驗(yàn)選擇了該濃度提取S-DPP。GCE與一般的再礦化液不同,含有鞣酸、沒(méi)食子鞣酸、樹(shù)脂和蠟質(zhì)等,鞣質(zhì)是五倍子的主要多酚化合物,屬水解類鞣質(zhì),在五倍子中的含量最高可達(dá)70%,研究發(fā)現(xiàn)其具有沉淀蛋白和收斂作用,能使許多生物堿及甙類形成不溶性復(fù)合物。本實(shí)驗(yàn)中樣本均在同一條件下進(jìn)行脫礦和再礦化處理,保證了基線的一致性,避免處理過(guò)程中可能出現(xiàn)的偏倚。實(shí)驗(yàn)中利用PLM對(duì)隨機(jī)選擇的脫礦樣本進(jìn)行了觀察和驗(yàn)證,表層下脫礦顯示了完整的表層,而酸蝕性病損則無(wú)表層形成,且隨著病損深度加大脫礦越明顯,這符合本文章所要求的樣本形態(tài)。LSCM是80年代研制成功的一種高分敏度、高分辨率、可檢測(cè)出樣本中微弱熒光的新型生物學(xué)儀器。研究認(rèn)為礦物減少會(huì)使熒光標(biāo)記進(jìn)入齲損孔隙內(nèi),因而可以通過(guò)測(cè)量脫礦組織中的熒光量而了解脫礦情況。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GCE能夠提高S-DPP后的酸蝕性病損的再礦化能力,可能與酸蝕性病損脫礦程度要遠(yuǎn)高于表層下脫礦,有機(jī)成分大量暴露,且再礦化反應(yīng)面積可能大幅度上升有關(guān)。而GCE對(duì)提S-DPP后的表層下脫礦再礦化能力并沒(méi)有明顯影響,具體原因尚須進(jìn)一步研究。盡管PLM觀察表層下脫礦后有較明顯的表層形成,但LSCM觀察表明表層依然脫礦比較明顯,再礦化效果似乎并不顯著,有較明顯的熒光液滲入,這與另外一種常見(jiàn)齲損形態(tài)早期釉質(zhì)齲的病理結(jié)構(gòu)似乎存在一定差異。早期釉