棉花e-isj標記的多態(tài)性篩選及連鎖圖譜構(gòu)建

棉花e-isj標記的多態(tài)性篩選及連鎖圖譜構(gòu)建

棉花有四種種植類型：草地棉、亞洲棉、陸地棉和海島棉。其中，陸地棉占世界棉花產(chǎn)量的95%以上，海島棉占約2%。然而作為紡織工業(yè)原料陸地棉的纖維品質(zhì)比海島棉差。如何培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)陸地棉品種一直是棉花育種的重要目標。棉花產(chǎn)量、纖維品質(zhì)等性狀為數(shù)量性狀,傳統(tǒng)遺傳改良方法進展緩慢,效率低。DNA標記技術(shù)的研究進展為數(shù)量性狀的遺傳改良提供了快速有效的方法。在構(gòu)建遺傳連鎖圖譜和定位數(shù)量性狀基因座的基礎(chǔ)上,利用與QTL緊密連鎖的分子標記進行分子標記輔助選擇,可大幅度提高育種效率。利用海陸種間雜交群體,已構(gòu)建了相對飽和的棉花種間圖譜。由于棉花種間雜交遺傳連鎖圖譜難以用于陸地棉遺傳改良,因此需要構(gòu)建陸地棉飽和遺傳連鎖圖譜。而陸地棉品種間的DNA標記多態(tài)性低,目前所構(gòu)建遺傳連鎖圖譜的標記密度、基因組覆蓋率還不能滿足分子標記輔助選擇的需要,需要開發(fā)大量新型標記。Lin等和Zhang等相繼將SRAP標記應(yīng)用于棉花遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。鄭靚等根據(jù)植物基因內(nèi)含子-外顯子剪接位點保守序列設(shè)計了擴增內(nèi)含子的IT-ISJ,并將其應(yīng)用于陸地棉遺傳圖譜構(gòu)建。本研究利用不同ET-ISJ引物組合對陸地棉重組近交系群體進行標記基因型檢測,構(gòu)建遺傳連鎖圖譜,以確定ET-ISJ標記在作物遺傳連鎖圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用價值。1材料和方法1.1fps3的種植2006年于西南大學重慶北碚歇馬科研基地種植270個(渝棉1號×T586)F2:7重組近交系。采用改良的CTAB法提取渝棉1號、T586、F1、重組近交系幼葉DNA。1.2pcr產(chǎn)物的克隆測序參照鄭靚等的方法設(shè)計擴增外顯子的ET-ISJ引物。根據(jù)前體mRNA內(nèi)含子-外顯子剪接邊界5端保守序列TGTGCAGGT作為正向引物的核心部分,以剪接邊界3′端保守序列ACTTACCTG作為反向引物的核心部分,為保證引物的退火溫度在55℃左右,同時為下一步進行PCR產(chǎn)物克隆測序,在正向引物5′端加上限制性內(nèi)切酶EcoRI的識別序列GAATTC,在反向引物5′端加上限制性內(nèi)切酶PstI的識別序列CTGCAG。正向引物與反向引物均在3端加上3個任意選擇堿基(表1)。1.3pcr擴增et-1ET-ISJ標記擴增反應(yīng)體系含1.0μL10×PCRbuffer、1.5μLMgCl2(25mmolL–1)、0.2μLdNTP(2mmolL–1)、0.5μL正向引物(10μmolL–1)、0.5μL反向引物(10μmolL–1)、0.1μLTaqDNA聚合酶(5UμL)、1.0μL模板DNA(50ngμL),以雙蒸水補足10.0μL。擴增程序為94℃預(yù)變性5min;94℃變性45s,53℃退火45s,72℃延伸1min,40個循環(huán);72℃10min。采用銀染方法檢測ET-ISJ標記。命名標記以引物組合加一字母,如ET-ISJ18F58Ra,18F為正向引物,58R為反向引物,a表示一個引物組合產(chǎn)生多個位點中分子量較小的位點。1.4遺傳標記分析采用JoinMap3.0作圖軟件,以LOD=4.0,重組率=0.4,Kosambi作圖函數(shù)進行遺傳連鎖分析。根據(jù)已定位在染色體上的形態(tài)標記和SSR標記,確定ET-ISJ標記在染色體上的分布。采用繪圖軟件MapChart2.2繪制遺傳連鎖圖譜。2結(jié)果與分析2.1多態(tài)性篩選的篩選利用1280對ET-ISJ引物組合,對陸地棉品種渝棉1號和T586進行多態(tài)性篩選,每個引物組合產(chǎn)生1~10個清晰條帶(圖1),片段為80~1000bp,其中69對引物在兩親本間具多態(tài)性,占5.4%。2.2ssr標記的遺傳連鎖分析以69對多態(tài)性ET-ISJ引物組合檢測(渝棉1號×T586)F2:7重組近交系群體,獲得70個標記位點(圖2~圖4)。其中62個表現(xiàn)顯性,占88.6%;8個表現(xiàn)共顯性,占11.4%。70個標記位點中有23個偏離1∶1的孟德爾分離比例(P≤0.05),占標記位點的32.9%。其中6個位點較嚴重偏離孟德爾分離比例(P≤0.001),占標記位點的8.7%。以70個ET-ISJ標記位點與523個SSR、59個IT-ISJ、29個SRAP和8個形態(tài)標記進行遺傳連鎖分析,構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜包括59個連鎖群、673個位點(68個ET-ISJ、510個SSR、58個IT-ISJ、29個SRAP和8個形態(tài)標記)(圖5)。連鎖圖覆蓋3216.7cM,占棉花基因組的72.3%,標記間平均距離為4.8cM。68個ET-ISJ標記分布于20條染色體(表2),其中第6、第8染色體均分布14個ET-ISJ標記。3群體遺傳圖譜擴增的可行性自Reinisch等將RFLP標記用于棉花遺傳圖譜構(gòu)建以來,RFLP、AFLP、SSR和SRAP等標記已廣泛用于棉花遺傳圖譜構(gòu)建,但目前所構(gòu)陸地棉遺傳圖譜覆蓋率低,同時所定位的QTL與連鎖標記距離偏遠,不能滿足分子標記輔助選擇育種的需要。因此,需要開發(fā)大量新型標記,尤其是與基因緊密連鎖的分子標記。作為基因翻譯起始信號、前體mRNA加A位點、啟動子、增強子區(qū)域和內(nèi)含子-外顯子剪接邊界等保守區(qū)域均具有與基因緊密連鎖的特性。此外,絕大多數(shù)植物基因都存在內(nèi)含子,且內(nèi)含子與外顯子的結(jié)合區(qū)域高度保守。本研究根據(jù)前體mRNA內(nèi)含子-外顯子剪接邊界保守序列設(shè)計的擴增外顯子的ET-ISJ標記在陸地棉重組近交系群體親本渝棉1號與T586間的多態(tài)性引物組合比例為5.4%,鄭靚等設(shè)計的擴增內(nèi)含子的IT-ISJ標記在渝棉1號與T586間的多態(tài)性引物組合比例為7.0%,SSR和SRAP標記在渝棉1號與T586間的多態(tài)性引物比例分別為6.8%和7.0%。ET-ISJ標記的多態(tài)性引物比例略低于IT-ISJ、SSR和SRAP標記。在這些標記中,SSR標記穩(wěn)定性好,但正向引物與反向引物不能任意組合,成本較高;ET-ISJ、IT-ISJ和SRAP標記正向引物與反向引物可任意組合,成本較低;SRAP標記擴增程序退火穩(wěn)定較低(前5個循環(huán)35℃),易產(chǎn)生非特異性擴增產(chǎn)物;ET-ISJ和IT-ISJ標記具有結(jié)果穩(wěn)定與成本低的優(yōu)點。擴增外顯子的ET-ISJ標記對構(gòu)建陸地棉高密度遺傳圖譜和QTL定位研究具有較好的應(yīng)用前景。為確定擴增片段是否為外顯子,下一步將對ET-ISJ引物組合擴增產(chǎn)物進行克隆測序研究。本研究表明ET-ISJ標記主要表現(xiàn)為顯性。70個標記位點中有23個(32.9%)位點偏離1∶1的孟德爾分離比例(P≤0.05),6個(8.7%)位點嚴重偏離孟德爾分離比例(P≤0.001)。Zheng等研究指出,在同一群體,SSR與IT-ISJ標記的偏分離比例分別為30.7%和44.8%,嚴重偏分離比例分別為5.3%和13.8%。ET-ISJ標記偏分離比例與SSR標記一致,大多數(shù)偏分離標記集中分布于少數(shù)染色體區(qū)域。本研究還表明ET-ISJ標記總體上均勻分布于棉花基因組,但存在ET-ISJ標記密集區(qū)域。如第6和8染色體均具有14個ET-ISJ標記,第6染色體上SSR、IT-ISJ和SRAP標記密集,第8染色體上SSR和IT-ISJ標記密集。產(chǎn)生標記密集區(qū)域的可能原因,一是目前所開發(fā)的標記不完全均勻分布于棉花基因組;二是本研究使用的群體親本在標記密集區(qū)域存在較大的DNA序列差異;三是棉花基因在基因組中分布不均勻,存在基因密集區(qū)域。本研究使用了SRAP、IT-ISJ和ET-ISJ三種基因相關(guān)標記,但這3