現(xiàn)代微生物鑒定技術(shù)

現(xiàn)代微生物鑒定技術(shù)

中國(guó)藥品生物制品檢定所抗生素室

馬越一API鑒定系統(tǒng)

二自動(dòng)微生物系統(tǒng)

三分子生物學(xué)在細(xì)菌分類中的應(yīng)用一API鑒定系統(tǒng)由于傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法費(fèi)時(shí)、耗力，因此出現(xiàn)多種類型的的成套鑒定系統(tǒng)及編碼鑒定系統(tǒng)方法，使細(xì)菌鑒定簡(jiǎn)易化、微量化和快速化。API鑒定系統(tǒng)是在世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣、種類最多的系統(tǒng)。分類1）快速鑒定系統(tǒng)如:RapideoZ沙門菌、志賀菌等2小時(shí)生化反應(yīng)項(xiàng)目52）特定菌屬（群）的鑒定系統(tǒng)如：APIStaph，APIStrep可鑒定28個(gè)和35個(gè)種，生化反應(yīng)項(xiàng)目203）ATB（AutomaticTestingBacteriology）系統(tǒng)API方法電腦化，可自動(dòng)讀取鑒定結(jié)果，使用時(shí)需將鑒定板與自動(dòng)化儀器結(jié)合起來。4）用于研究細(xì)菌對(duì)糖的發(fā)酵、氧化和同化能力以及細(xì)菌所具有的酶譜（Enzymesprofile）

數(shù)值鑒定的基本原理數(shù)值鑒定是通過出現(xiàn)頻率的計(jì)算進(jìn)行的，即每個(gè)分類單位的總出現(xiàn)頻率與每個(gè)菌群中所有菌的總出現(xiàn)頻率總和相比較而得。

數(shù)值鑒定的應(yīng)用

生化圖譜數(shù)碼的編碼法將生化反應(yīng)所得陽性和陰性結(jié)果，轉(zhuǎn)換成數(shù)碼，再與索引中數(shù)碼相比較完成鑒定。原則：所有的（20或32個(gè)）反應(yīng)從陽性到陰性的信息濃縮成一組數(shù)字。每3個(gè)反應(yīng)為一組，組內(nèi)按其位置第一位陽性為1，第二位陽性為2，第三位陽性為4，陰性為0。最終組成一個(gè)7位或10位數(shù)字。生化反應(yīng)圖譜索引手冊(cè)的應(yīng)用鑒定%≥99.9極好的鑒定%99.8-99.0很好的鑒定%98.9-90.0好的鑒定%98.9-80.0可以接受的鑒定%79.9以下低分辨率(不可信)API系統(tǒng)的操作接種物的制備試驗(yàn)條的接種讀取結(jié)果二自動(dòng)微生物系統(tǒng)

（AutoMicrobicSystemAMS）美國(guó)BD公司BioMerieuxViteK氣相色譜(GasChromatography)鑒定微生物紅外光譜儀（InfraredSpectroscopy）鑒定微生物

BioMerieuxViteK

BioMerieuxViteK

工作原理1革蘭陰性、陽性菌的鑒定主要依據(jù)概率是最大擬燃模型法（Probabilisticmaximumlikelihoodmodel），通過計(jì)算機(jī)控制，讀數(shù)儀每小時(shí)對(duì)孵育室中的測(cè)試卡自動(dòng)掃描一次，進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)，將所得數(shù)據(jù)送入計(jì)算機(jī)。因細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖使測(cè)試小池的透光量減少，計(jì)算出百分變化值，以判定是否有細(xì)菌生長(zhǎng)。計(jì)算機(jī)對(duì)測(cè)試菌各反應(yīng)池結(jié)果的處理求出該菌的絕對(duì)擬燃值（Absolutelikelihood）與內(nèi)存模型菌比較進(jìn)行鑒定。2厭氧菌的鑒定利用細(xì)菌生長(zhǎng)產(chǎn)生的酶，用單一基質(zhì)酶促反應(yīng)原理，與測(cè)試卡中的少量基質(zhì)反應(yīng)，充入?yún)捬蹙蔫b定卡，在非厭氧條件下培養(yǎng)小時(shí)，結(jié)果輸入計(jì)算機(jī)，作出鑒定。3酵母菌鑒定酵母菌鑒定的測(cè)試卡與上述不同，菌液充入試驗(yàn)卡，先在30℃培養(yǎng)4小時(shí)，然后放入讀數(shù)儀/培育室中讀數(shù)，鑒定。如需要，計(jì)算機(jī)將提示再重復(fù)培養(yǎng)，測(cè)試一次。儀器的優(yōu)點(diǎn)1功能多可以對(duì)革蘭陽性，陰性，厭氧菌，酵母菌等作出鑒定2速度快獲得純培養(yǎng)后，充入試卡，一般細(xì)菌在18小時(shí)內(nèi)，酵母菌在2天內(nèi)，作出鑒定。3結(jié)果準(zhǔn)確可避免人主觀判斷的誤差。其他不足1酵母菌的鑒定不能僅憑生化反應(yīng)，要兼顧形態(tài)學(xué)特征。2在少數(shù)情況下，AMS系統(tǒng)不能作出鑒定，在排除操作錯(cuò)誤以后，可能是該機(jī)現(xiàn)有資料庫中沒有相應(yīng)的模式。氣相色譜鑒定微生物原理根據(jù)細(xì)菌脂肪酸的構(gòu)成譜（fattyacidcompositionprofiles）來鑒定細(xì)菌。提取未知微生物的脂肪酸，氣相色譜儀自動(dòng)定量測(cè)定脂肪酸一確定脂肪酸的構(gòu)成譜，并與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫中的參考微生物進(jìn)行比較，鑒定。該系統(tǒng)可鑒定到屬、種、亞種及生化變異型。常用氣相色譜鑒定微生物系統(tǒng)有SherlockMicrobialIdentificationSystem（MIS）。MIS系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)庫

（MISStandardLibraries）

該標(biāo)準(zhǔn)庫包括有需氧菌、厭氧菌、酵母菌，很多領(lǐng)域內(nèi)有特性的微生物均保存在標(biāo)準(zhǔn)庫中。所以MIS系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)庫可以應(yīng)用于以下專業(yè)的微生物鑒定工作。醫(yī)學(xué)及臨床微生物環(huán)境微生物植物微生物工業(yè)微生物食品微生物獸醫(yī)飲用水和廢水MIS系統(tǒng)僅能鑒定那些標(biāo)準(zhǔn)庫中包括或與其相關(guān)的菌種。另外，培養(yǎng)條件和樣本制備必須根據(jù)要求進(jìn)行。注意：脂肪酸譜與DNA同源性有關(guān)，而DNA用于確定種的分類。所以，在有些科里，如腸桿菌科中有些菌種間關(guān)系密切，根據(jù)生化反應(yīng)的分類學(xué)使該系統(tǒng)的鑒定會(huì)有二、三種選擇的情況，此時(shí)，尚需用其他方法鑒定。另外，細(xì)胞在不同的環(huán)境條件中，為維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性其脂肪酸的成分有所改變。所以培養(yǎng)基的選擇和培養(yǎng)溫度一定要按規(guī)定進(jìn)行。紅外光譜儀鑒定微生物（InfraredSpectroscopy）

原理細(xì)菌或其他微生物的紅外光譜包含了化合物組分的資料信息，如細(xì)胞壁組分（酯類，多糖，多肽），核酸，蛋白質(zhì)。菌種不同其紅外光譜不同，利用這種‘光譜指紋’（spectralfingerprints）與計(jì)算機(jī)軟件庫中的標(biāo)準(zhǔn)譜進(jìn)行比較可以對(duì)微生物進(jìn)行鑒定。InfraredSpectroscopy的特點(diǎn)1快速2鑒定所需標(biāo)本量少3自動(dòng)分析4鑒定準(zhǔn)確5可鑒定到菌株水平6對(duì)所有微生物可以進(jìn)行鑒定

三分子生物學(xué)在細(xì)菌分類中的應(yīng)用1DNA分子中G+C百分含量的測(cè)定2DNA-DNA相關(guān)度檢測(cè)-核酸分子雜交技術(shù)3脈沖場(chǎng)凝膠電泳1DNA分子中G+C百分含量的測(cè)定不同種生物DNA分子中鹼基組成不同，且較恒定，因而可以用做細(xì)菌的分類