病理制片技術手冊

病理制片技術手冊第一章病理標本的接受

第二章組織固定

第三章取材

第四章組織脫水

第五章包埋

第六章組織石蠟切片

第七章常規(guī)染色

第八章封片

第九章冷凍切片的制作

第十章慣用特殊染色

第十一章慣用試劑及染液的配制第一章病理標本的接受

病理標本的接受是在取材、固定組織前首先要做的第一步工作，它是臨床與病理科交接的一種重要環(huán)節(jié)，它為開展病理學檢查、病理檔案的保存奠定了基礎。

標本接受程序以下。

1．首先核對病理申請單與標本上的紅色號碼與否一致。

2．核查病理申請單上寫明的送檢標本及數目與否與實際送檢標本一致。

3．觀察送檢標本的大小及固定液比例與否適宜。

(1)穿刺活檢及纖支鏡所取的小標本，4％中性甲醛(10％中性福爾馬林)固定組織的量應在6～10倍。

(2)對于較大的手術切除標本，應及時切開固定；核對后將病理申請單和標本編上病理標本號。

4．將病人姓名、性別、年紀、病歷號、科別、臨床診療、部位、標原來源、標本例數等逐項錄入電腦存儲。

5．作為病理資料不僅要做好計算機錄入工作，還須進行文字登記，方便病理檔案長久保存。

第二章組織固定

一、固定的目的和意義

活體組織一旦停止血液循環(huán)和物質代謝就會因物質代謝障礙產生一系列的生物化學和組織化學變化，并造成形態(tài)學上可見的細胞器變化和細胞組織的形態(tài)變化直至腐敗自溶。固定的目的就是要通過使用化學和物理的辦法，盡量地保存組織細胞離體時含有的生理和病理形態(tài)構造及生物化學和免疫化學成分。

良好的固定是制作優(yōu)秀病理切片的基礎，也是特殊染色、組織化學、免疫組織化學和組織原位分子雜交等技術辦法賴以成功的基礎。

因此，在病理技術工作中必須高度重視固定的質量。

二、組織固定的注意事項

1．及時取材：由于甲醛對組織的平均穿透速度只有0.8mm/h，因此手術切除的送檢標本應及時切開進行取材，方便確保重要的鏡檢部位能及時地得到固定。

2．及時固定：完畢取材的組織塊應立刻投入固定液方便盡量地保存組織細胞的形態(tài)構造和抗原性。

3．液量充足：普通狀況下規(guī)定固定液的量應為組織體積的6～10倍。

4．適度固定：當代固定的規(guī)定是，在良好保存組織細胞形態(tài)構造的同時盡量較好地保存組織細胞的抗原性。長時間的固定會造成某些組織抗原性的逐步喪失，因此，適時固定能夠在保存細胞構造和抗原性之間獲得必要的平衡。對于較大的送檢標本而言，在及時切開固定的基礎上，應盡量在24h以內取材進入組織脫水程序。

5．適宜溫度：低溫能夠減少固定的速度，反之能夠加緊固定進程。在自動組織脫水機上能夠施加恒定的溫度使得在有限的時間內能夠完畢固定過程。普通狀況下應將固定溫度控制在36~38℃。

6．適宜攪拌：在自動組織脫水機上能夠通過使用攪拌和試劑循環(huán)功效使固定過程在標本與試劑充足接觸的條件下完畢。

三、固定液的選擇

影響標本固定的因素諸多，如組織與固定液的比例、固定時間、固定溫度等；除此之外，固定液本身也很重要，若所選固定液不當，細胞內蛋白質、脂類、核酸等成分將會有不同程度地損失。固定劑最佳隨配隨用，并注意其濃度和酸堿度。因此根據實際工作的目的，選用適宜的固定液非常重要。下面是某些慣用固定液的配制辦法及合用范疇。

1．單純固定液

(1)4％中性甲醛固定液：最慣用的固定液，能滿足常規(guī)HE及免疫組化、PCR等工作。普通無特殊規(guī)定的病理標本均合用。特別值得注意的是，中性甲醛是以pH7．2～7．4的磷酸緩沖液為溶劑配制的，其固定效果及對組織抗原性的保存均優(yōu)于普通的4％甲醛固定液。此固定液配制后應密封并保存在陰涼處，保存時間不超出一種月。

甲醛(40%)100ml

無水磷酸氫二鈉6.5g

磷酸二氫鈉4.0g

蒸餾水900ml

(2)乙醇固定液：使用時以80％～95％的濃度為宜，含有硬化、固定、脫水等作用，對組織滲入力較弱，因此極少單獨使用，但其保存組織中的核酸強于中性甲醛，故慣用于有核酸操作的實驗或檢查，如果用于證明尿酸結晶和保存糖原，可用100%乙醇固定組織。

(3)4％的多聚甲醛：重要用于培養(yǎng)細胞的固定。

2．混合固定液

(1)乙醇一甲醛(乙醇－福爾馬林，AF)固定液：合用于皮下組織中肥大細胞的固定。該固定液有固定兼脫水作用，固定后的標本可直接入95％乙醇脫水。

甲醛(40％)100ml

95％乙醇900ml

(2)B5(醋酸鈉一升汞一甲醛)固定液：多用于固定淋巴組織。染色前應進行脫汞沉淀解決。

無水醋酸鈉1.25g

升汞6.0g

蒸餾水90ml

使用前加入甲醛10ml

(3)Bouin固定液：特別合用于睪丸活檢組織的固定。Bouin液對組織固定較均勻，收縮極少，不會使組織變硬變脆。需現配現用。

飽和苦味酸水溶液(約1.22%)75ml

甲醛25ml

冰醋酸5ml

(4)Carnoy固定液：穿透能力強，可較好的固定細胞質和細胞核，特別適合于固定外膜致密的組織，亦合用于糖原及尼氏小體的固定。

無水乙醇60ml

氯仿30ml

冰醋酸10ml

(5)Zenker固定液：經此液固定的標本，細胞核和細胞質染色頗為清晰，但成本較昂貴且需特殊解決汞。該固定液要避免接觸陽光，以免引發(fā)化學變化而失效。

升汞5.0g

重鉻酸鉀2.5g

硫酸鈉1.0g

蒸餾水(加至)100ml

四、操作辦法

臨床醫(yī)師切取標本后，應盡快將標本置于盛有足夠量固定液的容器內，盡量避免可能出現固定不及時或不充足造成標本干涸或腐敗，無法進行切片制作。病理科工作人員驗收標本后，必須對臨床初步固定的標本及時進行規(guī)范的解決：對于穿刺及胃腸鏡所取的小標本，直接添加中性甲醛，添加的量應6～10倍于標本體積；對于較大的手術切除標本應呈書頁狀切開、有包膜的標本切開固定，切開的厚度1cm左右，為了保存標本的原有大致形態(tài)，切開時最佳不要完全斷開，兩切面之間用脫脂棉或紗布隔開，然后放人6～10倍體積的固定液中完全沉沒。特殊標本特殊解決：如脾臟或淋巴結等包膜較厚，固定劑滲入力有限，應切薄薄的一小片單獨固定，對于宮頸錐切標本及胃腸等空腔器官應及時釘板展開固定。固定到取材的時間應視標本的大小及切面的厚度而定，小標本應不少于4h,大標本不少于18h。

第三章取材

一、概念

取材是將送檢標本進行客觀描述并將病變部位組織切成厚薄適度的小片后裝入小盒(進入組織脫水程序)，取材至關重要。

二、取材環(huán)境

取材室由取材臺、統(tǒng)計桌、標本陳列架、電腦查詢等構成；取材臺應有良好的排風、進出水系統(tǒng)，配備齊全的刀、剪、鑷、尺等基本工具和備用固定劑，統(tǒng)計桌應備有打號機(無時應用鉛筆)、統(tǒng)計紙張、標本小盒及盒蓋等，標本陳列架應寄存、拿取方便、排風良好，電腦查詢應與登記臺和醫(yī)師診療統(tǒng)計成果的計算機相連。

三、操作

1．首先進行核對：統(tǒng)計者拿出一份申請并唱出病理號，取材醫(yī)師按病理號拿出一份標本，核對無誤后唱出申請單編號，統(tǒng)計者核對無誤后念出申請單上填寫的取材部位和送檢標本份數及具體塊數，取材醫(yī)師核對無誤后對標本進行具體描述。

2．對送檢標本的觀察和描述：可分為活檢小標本(涉及經內窺鏡獲取的黏膜組織、淺表或深在部位的穿刺物、子宮腔刮取物、經微創(chuàng)手術由器官或腫瘤中切取的不完整組織等)和手術大標本。

(1)小標本檢查：描述送檢標本的數量(量少時精確計數)、大小(量少時精確測量，量多時聚堆測量體積)、色澤、形狀以及質地等。

(2)大標本檢查：①檢查切除標本的手術類型。②測量標本的大??；描述標本的形狀、色澤、有無包膜或被膜及質地，必要時(如內分泌腫瘤)要在切開標本前稱重；帶有臟器的標本還應注意檢查病變與有關臟器的比鄰關系。③按操作規(guī)范切開檢查標本切面，如實性區(qū)

域觀察色澤、質地、紋理、有無出血壞死以及腫瘤肉眼浸潤深度和范疇；囊性區(qū)域觀察囊腫壁的厚度、內外表面、內容物及其性狀等。④注意各系統(tǒng)臟器大致檢查的特殊規(guī)定。⑤必要時繪制簡圖闡明標本大致特點和解剖關系，也可進行表面及剖面攝影，以保存大致資料。

3．組織取材：按病理診療和研究的目的和規(guī)定，從標本上切取適宜大小和數目的組織塊，供后續(xù)制片和顯微鏡下觀察用于診療以及有關研究。取材的普通原則以下。

(1)認真地進行大致檢查，精確選用病變部位。

(2)顯示病變全貌，切取有代表性的病變區(qū)域組織，涉及病變周邊相對正常的組織和壞死組織等；對有腫瘤的標本應涉及切緣、腫瘤包膜及轉移部位等。

(3)組織塊的面積普通為2.0cmX1.5cm，厚度不超出3.0mm。太大太厚的組織塊常會固定不充足，而影響脫水和制片。組織塊的數量依具體狀況而定，普通以滿足診療和有關研究需要為準。

(4)骨或鈣化組織需要先經脫鈣解決；腔道器官及囊壁組織應立埋。

4．統(tǒng)計：大致檢查和取材要由含有一定經驗的病理醫(yī)師進行，應配備人員進行統(tǒng)計。統(tǒng)計人員負責以下事宜。

(1)每例標本在病理醫(yī)師進行大致檢查和取材前，與其共同核對該例標本份數、內容、病變特性及其標志與否與申請單有關內容一致。

(2)病理醫(yī)師在進行大致檢查和取材時，統(tǒng)計人員根據申請單向醫(yī)師報告病人基本狀況、術中所見、送檢醫(yī)師特殊規(guī)定等，并如實清晰地將病理醫(yī)師口頭描述統(tǒng)計于統(tǒng)計單上，必要時繪制簡圖顯示大致所見及標示取材部位。

(3)病理醫(yī)師取材完畢后，與其共同核算取材內容，確保組織塊及其編號標簽精確置人脫水盒內，并在統(tǒng)計單和取材工作單上簽名并訂立日期。

5．注意事項

(1)核對要認真，描述要客觀，取材要精確。

(2)每例標本取材前后，均應用流水徹底清洗取材臺面和全部有關器物，避免交叉污染。

(3)細小標本取材時可用伊紅點染并用濾紙包裹，嚴防標本丟失。

(4)大標本取材大小要適宜(組織塊的面積普通為2.0cm×1.5cm，厚度不超出3.0mm)

(5)取材刀刃要鋒利，避免使用鈍刀或齒鑷過分擠壓組織，取材動作要輕柔，不可來回切割或過分牽拉組織，以免組織構造變形或內部細胞脫落。

(6)組織塊切面應平整，如有線結和鋼絲應拔除。

(7)所取組織應涉及各臟器的重要構造或全層。

(8)特殊標本要在取材前攝影留資料。第四章組織脫水

組織經固定后會有大量水分，組織脫水是用某些溶劑逐步將組織內的水分置換出來，以利于透明劑和石蠟的滲入。

一、手工脫水

1．器械準備：大標本缸6個，浸蠟用金屬缸3個，脫水籃，恒溫烤箱。

2．日常工作程序見表5．1。

表5．1手工脫水日常工作程序試劑濃度／溫度時間設定中性緩沖甲醛4%3.00h乙醇80%1.00h乙醇90%1.00h乙醇95%過夜無水乙醇I

2.00h無水乙醇Ⅱ

2.00h二甲苯一無水乙醇體積比為1:130min二甲苯I

30min二甲苯Ⅱ

1.00h石蠟60℃1.00h石蠟60℃1.00h石蠟60℃1.00h

3．注意事項

(1)所用標本缸要大某些，達成組織塊與液體比6～10倍。

(2)固定液、脫水劑要勤更換，能夠采用前移更換。

(3)二甲苯時間不適宜過長，不要超出2h。

(4)石蠟溫度不得高于60℃。

(5)全部程序應每間隔0．5h搖動2～3次以利于固定脫水浸蠟徹底。

二、半自動脫水機

半自動脫水機日常工作程序可參考全手工脫水日常工作程序進行。梯度乙醇的脫水時間加長。注意事項同手工脫水。

三、全自動密閉式脫水機

全自動密閉式脫水機有控制面板、解決槽、石蠟箱和試劑柜四個部分。為確保組織解決無刺激味道，全自動密閉式脫水機還設有活性炭過濾器。

(1)控制面板有顯示屏和小鍵盤，可由此輸入20個不同的解決程序，可設立解決時間和溫度，可啟動P／V循環(huán)(壓力和真空交替)和混合循環(huán)，出現故障時有報警提示。

(2)解決槽是組織塊進行解決的容器。

(3)石蠟箱可將熔化的石蠟保持在設定的溫度待用。

(4)試劑柜裝有解決試劑。

1．日常工作程序見表5．2。

表5．2全自動密閉式脫水機脫水日常工作程序溶液百分濃度

（％）時間設定溫度

（℃）P/V循環(huán)（壓力和真空交替）混合循環(huán)中性緩沖甲醛液42.00h35＋＋乙醇801.00h

－－乙醇951.00h

－－乙醇951.00h

＋＋乙醇951.00h

＋＋乙醇1001.00h

－－乙醇1001.00h

＋＋乙醇1001.00h

＋＋二甲苯1000.50h

－－二甲苯1001.00h

＋＋石蠟

1.00h60－—石蠟

1.00h60＋＋石蠟

1.00h60＋＋石蠟

1.00h60＋＋

注：截止時間為1／8：00am

2．雙休日工作程序：脫水程序及各試劑的所用時間及功效相似，只將截止時間調至3/8:00am即可。

3．外檢小標本工作程序見表5．3。

表5．3全自動密閉式脫水機外檢小標本工作程序試劑百分濃度

（％）時間設定溫度

（℃）P/V循環(huán)（壓力和真空交替）混合循環(huán)中性甲醛42.00h35＋＋乙醇801.00h

－－乙醇951.00h

－－乙醇951.00h

－－乙醇951.00h

＋＋乙醇10030min

－－乙醇10030min

－－乙醇10030min

＋＋二甲苯10020min

－－二甲苯10020min

＋＋石蠟

30min60－—石蠟

30min60－－石蠟

1.00h60＋＋石蠟

1.00h60＋＋

注：截止時間為1／8：00am

4．小動物組織工作程序見表5．4。

表5．4全自動密閉式脫水機小動物組織工作程序溶液百分濃度

（％）時間設定溫度

（℃）P/V循環(huán)（壓力和真空交替）混合循環(huán)中性甲醛42.00h35＋＋乙醇800.50h

－－乙醇950.50h

－－乙醇950.50h

＋＋乙醇950.50h

＋＋乙醇1000.50h

－－乙醇1000.50h

－－乙醇1001.00h

＋＋二甲苯10020min

－－二甲苯10020min

＋＋石蠟

0.50h60－—石蠟

0.50h60＋＋石蠟

1.00h60－－石蠟

1.00h60＋＋

5．大動物組織(如狗、兔、猴)：能夠同外檢組織使用一種程序。

6．脫水程序運行完畢后解決。

(1)先按泵出按鈕將石蠟抽回缸內，再打開解決槽將組織塊取出。

(2)將解決槽內及槽蓋上的余蠟擦凈。

(3)將底部中央過濾器螺絲擰開，將管道口的蠟擦凈，擰緊螺絲。

(4)蓋上蓋后，按清洗按鈕清洗。

7．全自動密閉式脫水機的注意事項。

(1)固定液每三天更換一次，組織塊為600～800塊。組織固定的好壞直接影響切片質量。為達成組織固定徹底的目的，可使用脫水機的P／V循環(huán)和混合循環(huán)功效，也可將溫度定在38～40℃。

(2)梯度乙醇脫水劑每星期更換一次，組織塊約為1000～1200塊。辦法是將第二缸的80％乙醇倒棄，后來的95％乙醇和無水乙醇依次前移。只將最后一缸的無水乙醇更換為新液。這樣更換不僅節(jié)省了乙醇，更重要的是如果脫水劑全部更換為新液就會產生過脫水，組織發(fā)脆。通過幾次脫水后的乙醇，濃度即使只減少了5％～10％，但脫水過程中置換出的細胞外液、組織液等可削弱乙醇的脫水能力。因此實際工作過程中須根據組織塊的多少、脫水劑的使用時間合理設定脫水劑的脫水時間、P／V循環(huán)和混合循環(huán)功效。

(3)透明劑二甲苯10～15天更換一次。第一缸二甲苯倒棄，第二缸前移至第一缸，第二缸更換為新液。二甲苯起媒介作用，將無水乙醇置換出又使石蠟較好地浸入組織內。如果透明時間過長、強度過大(如P／V循環(huán)和混合循環(huán)全程使用)就會產生透明，以致組織發(fā)脆發(fā)干不利于切片。因此透明劑設定的時間、P／V循環(huán)和混合循環(huán)的使用要有機配合。

(4)所用石蠟要干凈無雜質，熔點58～60℃。使用一定時間后，倒棄二甲苯含量過高的第一缸石蠟，將后三缸石蠟依次前移，最后一缸換新鮮石蠟。石蠟溫度設定為60℃，這樣的溫度可避免小標本浸蠟因溫度過高而發(fā)脆。

(5)脫水機要放置干燥通風房間，避免陽光直射顯示屏。最佳配備一臺不間斷電源(UPS)，避免瞬間斷電影響機器使用。

(6)使用全自動密閉式脫水機要避免過脫水，過透明。

第五章包埋

一、意義

組織塊通過固定、脫水、透明、浸蠟等解決后，用包埋劑(如石蠟、樹脂、塑料等)將其包制成含組織塊的蠟塊或塑料塊等的過程稱為包埋。不同的包埋辦法有不同的規(guī)定，經包埋后，組織可達成一定的硬度和韌度，有助于切成抱負的薄片。

二、包埋環(huán)節(jié)

先將熔化的石蠟注入包埋托內(模具)，而后用鑷子將通過浸蠟的組織塊從脫水盒中取出，放入包埋托中央，放在小冷臺上，用鑷子輕按組織塊，以達成組織塊平整，蓋上脫水盒底，再加好石蠟，移至冷凍臺上，待冷凍好后，卸下組織蠟塊待切。包埋時應根據組織的不同，選擇大小型號適合的包埋托；有規(guī)定直立包埋的組織要用鑷子將組織固定在蠟塊中央稍停半晌，以使組織在蠟凝時立住，達成立埋的規(guī)定。

三、注意事項

1．每次夾取組織塊時，鑷子用乙醇燈加熱至溫度適中。

2．包埋托內不要有水、碎蠟等異物，以免影響包埋質量。

3．包埋蠟的溫度要控制好，包埋蠟的熔點應為58~60℃。

4．包埋蠟加入少量蜂蠟(蜜蠟)，能夠增加韌度，利于切片。

5．夾取組織塊放人包埋托內時，一定要注意包埋面。

6．包埋好的蠟塊，用刀修整時，一定要適宜保存蠟塊中組織周邊的白蠟邊，以利于持續(xù)切片。

7．每包埋完一塊組織，鑷子必須擦干凈或用乙醇燈燒。

四、自動包埋機介紹

自動包埋機是對組織經脫水、浸蠟后進行包埋解決的設備。有多個類型，其設計含有人性化，普通整機由包埋部分和冷凍部分組合而成(一體化簡潔緊湊)，全自動程序控制，含有延時自動開機功效，加熱快速，溫控精確，安全可靠，包埋效果好等特點，冷臺最低溫度可達一5℃，可進行快速冷凍解決包埋塊，含有大冷臺，冷凍面積大，可放置超大包埋盒或多個包埋盒。包埋部分溫度能夠從55～70℃，可儲存3～5L石蠟，自動熔解石蠟，可容納70～100個樣品包埋盒。金屬板表面容易清洗，有2個加熱的抽屜，可收集多出的石蠟，進行重新運用，避免石蠟浪費。含有冷卻鑷子架，方便使用?？膳浞糯箸R利于小活檢標本的包埋；可配腳踏：石蠟注入由腳踏開關控制或上手工控制。全部溫度和工作時間參數全部由程序控制，記憶功效配有備用電池，這使病理組織學實驗室的工作更為靈活。這種獨特的結合使現在組織學和病理組織學實驗包埋技術達成了新的水平。是創(chuàng)新發(fā)展的石蠟包埋技術和智能化高水準工藝的完美結合。

第六章組織石蠟切片

組織經石蠟包埋后制成的蠟塊，用切片機制成切片的過程為石蠟切片法。石蠟切片法現使用的切片機有平推式切片機、輪轉式切片機兩種。

一、平推式切片機石蠟切片法

1．切片前的準備：清洗過的載物片(或免清洗的)，毛筆，鉛筆，小竹片，水槽，霧化器，攤片器，切片刀，刀架。

2．切片制作環(huán)節(jié)：刀架的粗削部放在頭端，在切片機刀架部夾緊。組織蠟塊裝在切片機蠟塊固定器上夾緊。右手握切片機刀頭運動手柄，左手轉動切片機蠟塊運動旋鈕。先轉動此鈕，后平拉刀架運動手柄，進行粗削，直至組織切全。停止，將刀架移到細削部，輕輕轉動蠟塊運動旋鈕，后拉刀架手柄進行細削。削至組織光滑發(fā)亮，右手拿毛筆掃凈刀架及蠟塊上的蠟屑，組織屑，放下毛筆，再用右手握住刀架運動手柄。左手拿小竹片，用竹片頭蘸一下水槽中的水。左手中指搬動薄切鈕，霧化器的噴頭對準蠟塊。右手拉刀架運動手柄。左手中的小竹片在蠟塊空白處等待切片刀切起蠟片一端挑起粘住，隨切片刀移動，完整的蠟片切出后，粘在竹片上，移入水槽中，撈片，放在攤片器上攤片5min后，裝在染色籃上，放入75℃烤箱烤片。

3．注意事項

(1)無冷臺的病理科能夠將包埋好的組織蠟塊放到冰箱內，但如放置時間過久溫度太低切片時蠟塊會產生熱漲，切片會厚，要多切幾張，背面的片子就會薄某些。

(2)霧化器是去除靜電的，但也有增加切片厚度的缺點。特別霧氣大時，使蠟塊熱漲，厚度增加更明顯。為了確保切片厚度，一定要控制好風力、霧力。霧化器使用自來水，水位控制在30刻度。

(3)切片機使用前一定要檢查各部位狀況。先檢查固定器與否固定在你所要的厚度上。切片機刀架角度與蠟塊呈90。。從蠟塊右上角進刀。

二、輪轉式切片機石蠟切片法

1．切片前的準備：清洗過的載玻片、毛筆、鉛筆、盛有30％乙醇的小燒杯、牙科鑷、展片槽、切片機、一次性刀片及刀架。檢查輪轉式切片機切片厚度的鈕與否固定于你所要切的厚度刻度上。

2．切片制作環(huán)節(jié)：將放在－5℃冷臺上的組織蠟塊裝在切片機固定器上夾緊，空白蠟多的一端在上。將切片刀固定一端為粗削部，左手旋動蠟塊推動器，右手旋動切片機把手。先搖動蠟塊推動器，后搖動切片機機頭半輪上下運動，進行粗削，一進一削，直至組織切全。而后將切片刀移至另一端進行細削，削至蠟塊光滑平整。用毛筆將其刀架、蠟塊面清掃干凈。左手持毛筆，右手整輪轉動切片機手柄進行切片。將毛筆貼于刀架背不時轉動，輕輕托起連片的蠟片。右手停止轉動機頭，換持牙科鑷，夾住連片蠟片頭端，放入盛30％乙醇的燒杯內。用牙科鑷去除不好的蠟片。放入水溫45～50℃水槽內展片后撈片。

3．注意事項

(1)無冷臺的病理科能夠將包埋好的組織蠟塊放到冰箱內，但如放置時間久溫度太低注意切片時蠟塊會產生熱漲，切片會厚，要多切幾張，背面的片子就會薄某些。

(2)為了能夠連片，蠟塊兩端要有空白蠟。多的一端放在上面。

(3)展片槽溫度不要過高，有時會有小組織塊散漂在水面上造成污染?？捎檬旨堈鄢膳c水槽寬度相似水面行走，將組織屑撈走。第七章常規(guī)染色

蘇木精(hematoxylin)和伊(eosin)染色辦法，簡稱HE染色辦法，是生物學、細胞學與組織學最廣泛應用的染色辦法。在病理科稱為常規(guī)染色辦法。病理學的診療都是以HE辦法為基礎的。染色的目的是把組織切片或細胞涂片等浸入染料及其它染色劑配成的染色液中，通過適宜的時間和解決，使組織或細胞及其它成分染上不同深淺的顏色，產生不同的折射率，從而便于光學顯微鏡下進行觀察和研究。

進行染色邁進行染色液的配制，應根據工作量的多少配制對應量的染液，同時應注意溶液種類的選擇、溶液濃度、pH值等，另外也應注意配方的合理選擇。

在實際工作中，應做到下列幾點。

(1)保持染液的清潔，應經常過濾或更換。

(2)染色時間應根據組織的種類、染液的新舊及特殊規(guī)定而決定。

(3)染色環(huán)境溫度對染色效果也有著親密的影響，故染色時間必須根據不同條件靈活掌握。

(4)脫蠟干凈與否對染色效果有著重要影響，烤片溫度、脫蠟二甲苯的溫度、二甲苯的新舊和二甲苯脫蠟的時間長短都與染色有著親密關聯(lián)。

(5)標本脫水的好壞及固定的充足與否對染色效果影響極大。

(6)切片染色后，經梯度乙醇脫水，若每步的時間局限性易造成切片發(fā)霧、含糊不清，影響診療。

在染色過程中，既要按常規(guī)辦法環(huán)節(jié)進行操作，也應根據實際狀況、個人經驗靈活運用，不停總結，才干純熟掌握并提高實際工作能力與效率。

一、人工染色

人工染色已使用近百年，至今還在使用，既古老又實用。人工染色的設立因地區(qū)的差別設立也不同，但大多數的地方基本同樣。

１．石蠟切片HE人工染色程序(見表8．1)。

表8．1人工染色程序液體設立１75℃恒溫烤箱烤片20min２二甲苯I2～5min３二甲苯Ⅱ2～5min４二甲苯Ⅲ2～5min５無水乙醇I1min６無水乙醇Ⅱ1min７95％乙醇I1min８95％乙醇Ⅱ1min９85%乙醇1min1080%乙醇1min1170%乙醇1min12自來水水洗3次，將水控凈13蘇木精?5min14自來水水洗3次15l％鹽酸乙醇分化3～5s16自來水水洗3次17O．5％氨水返藍18自來水水洗3次191％伊紅水溶液1min20自來水水洗3次2170%乙醇1min2280%乙醇1min2395%乙醇I1min2495%乙醇Ⅱ1min25無水乙醇I1min26無水乙醇Ⅱ1min27無水乙醇Ⅲ1min28二甲苯I1min29二甲苯Ⅱ1min30二甲苯Ⅲ擱置至封片

2．注意事項

(1)石蠟切片放入恒溫箱中烤片，溫度不可過低或過高，以75℃為宜，否則在染色過程中容易發(fā)生脫片。

(2)組織切片脫蠟要經二甲苯三次才干徹底。切片從恒溫箱取出后應趁熱浸入二甲苯以利于徹底脫蠟。使用一段時間后，第一缸二甲苯融的蠟較多應倒棄，其后的二甲苯依次前移，最后一缸換新鮮的二甲苯。

(3)切片經70％乙醇后入蘇木精染液前，必須自來水水洗3次，最后1次最佳用蒸餾水水洗并控干。這樣能夠確保Harris蘇木精染色能力持久，而不會由于低濃度乙醇的混合而過早的喪失染色能力。

(4)Harris蘇木精染液配制的好壞直接影響切片染色質量。好的蘇木精染液500ml正常染色能力為2500張左右。為確保染色質量應及時更換染液。

(5)蘇木精染液要經常過濾以確保染色清潔而不在切片上有染色渣的出現。

(6)鹽酸乙醇分化液配制參見本書第十二章。分化時間可根據分化液的新舊適宜調節(jié)，新的分化液時間短些。分化的目的就是讓該染上要清晰地染上，而不該著色的一定要分化掉。

(7)氨水返藍液濃度不可過高，返藍時間不可過高，不要過長，否則會發(fā)生脫片現象。

(8)1％伊紅水溶液是抱負的胞漿染液。要選擇好水溶性的伊紅染料使胞質鮮艷某些，切片不僅美麗且利于觀片。

(9)切片染色后的脫水要充足，每道乙醇脫水的時間不要過短，特別是三道無水乙醇更為如此。無水乙醇要勤更換。

(10)切片經最后一次無水乙醇后盡快地放人二甲苯中。在夏季室內濕度較大的環(huán)境中更是如此。如切片在濕度大的空氣中停留時間過長就會在封片時產生霧氣，而不能現片。其因素是無水乙醇吸取了空氣中的水汽，在二甲苯中難以分離析出，當用中性樹膠封片后，二甲苯揮發(fā)，而水汽留在膠中產生霧氣。

(11)封片所使蓋玻片需大小適宜、清潔。樹膠用量視蓋玻片大小而定，規(guī)定不發(fā)生溢膠或缺如。

(12)不倡導切片經無水乙醇，然后干燥，直接用中性樹膠封固。這樣會產生人為的細小黑點，與細胞核相似。

(13)封片要在通風廚中進行，避免二甲苯污染工作間，危害技師的身體。

二、自動染色機

自動染色機是近幾年才引進的病理自動儀器，在病理制片過程中發(fā)揮著重要的作用，它能夠持續(xù)進行染色，自動記憶，染色效果好，質量控制到位。起到了手工無法比擬的作用。

1．液體設立：由于機器為電腦控制，染液次序及液體的設立根據染色機所設立的染色缸多少來調配。染色機基本模擬手工辦法，運用機器手來完畢操作程序見表8．2。

表8．2機染程序的液體設立二甲苯二甲苯二甲苯無水乙醇無水乙醇95%乙醇85%

乙醇水水水水水烤箱65℃

停機報警取籃處二甲苯二甲苯二甲苯無水乙醇無水乙醇95%乙醇85%乙醇伊紅1%

氨水1%

鹽酸

乙醇蘇木精裝機

2．注意事項

(1)工作前先檢查染液及試劑，并啟動電源。

(2)啟動進水開關。

(3)調試好所需的染色程序，根據蘇木精一伊紅的新舊來調節(jié)時間。

(4)將切片染色籃放人染色機后按提示鍵即可按程序進行染色。

(5)聽到提示音響后，取出已染好的切片染色籃進行封片。

(6)工作完畢后，關閉電源，關掉水源，并蓋好染色缸。

(7)染色機配制的無水乙醇及95％乙醇的程序比手工程序少，但不影響染色效果，因機械手在提高時有抖動作用，帶的液體極少。

(8)定時取出活性碳過濾網晾曬確保使用。

(9)工作結束后一定要取出鹽酸乙醇，以免長久放在機器內，腐蝕機器。

第八章封片

封片是將組織切片封固保存于載玻片與蓋玻片之間，使之不與空氣發(fā)生接觸，避免其氧化、褪色，利于鏡檢觀察及保存。

一、手工封片

手工封片應注意下列七點。

(1)所用樹膠濃度要適中，以普通速度滴下并恰能成珠既可。太稀時易溢出玻片，當二甲苯揮發(fā)后，組織切片就會收縮產生膠不勻并出現大片氣泡。太濃時，滴在玻片上樹膠不易散開，易產憤怒泡，難以驅除，并影響折光率。

(2)樹膠用量多少應根據組織大小、厚薄而定。

(3)應快速敏捷滴膠。

(4)封片時，切片上應保存適宜的二甲苯，以防干封，產憤怒泡。

(5)為避免氣泡，封片時，樹膠不適宜攪動。

(6)如遇有小氣泡時可用鑷子輕壓蓋玻片，排除氣泡。

(7)封片時，若離面部較近，鼻、口呼出的氣體會有水分造成切片云霧狀甚至含糊不清，需引發(fā)注意。

二、機器膠帶封片機

機器膠帶封片機不用樹膠，只用少量二甲苯即可封片。使用方便，切片診療后即可歸檔，不會因樹膠不干造成粘片等。使用封片機時，首先檢查二甲苯瓶，并檢查滴液分注量，檢查膠帶可用量、選擇膠帶長短規(guī)格，檢查接片筐與否安裝到位。工作時開通電源，并打開過濾網開關。工作完畢后，關閉2個電源，擦拭機器。

三、機器蓋玻片封片機

機器蓋玻片封片機采用模擬人工手法來完畢封片工作。使用機器封片，封片效率高、質量好，同時可減少封片對技術人員身體的傷害。其操作環(huán)節(jié)為以下。

(1)接通電源，打開開關，機器進行白檢后，批示燈變綠即可工作。

(2)將染色完畢的染色籃精確的放人封片機內。

(3)按動開始鍵，封片機進入工作狀態(tài)。

(4)封片結束后報警，即可取出封好的切片。

機器蓋玻片封片機的蓋玻片采用24×40、24×50、24×60等規(guī)格的蓋片(現在國產免洗蓋玻片已替代進口，使用效果良好)。

第九章冷凍切片的制作

一、概述冷凍切片是運用物理降溫的辦法將新鮮的組織標本冷凍使其產生一定的硬度進行切片的技術辦法。與石蠟切片相比，由于冷凍切片不需脫水包埋因此制片速度快，是為手術進行中的臨床醫(yī)師提供病理診療的良好辦法。另外由于冷凍切片的標本是未經固定的新鮮組織，因此冷凍切片也是脂肪染色、酶組織化學染色以及某些免疫組織化學染色和原位分子雜交的抱負制片辦法。冷凍切片的局限性是組織細胞的形態(tài)略遜于石蠟切片。

二、冷凍切片的制作辦法

運用氯乙烷噴灑、二氧化碳噴射、半導體制冷的辦法均可制作普通的冷凍切片，用于術中的病理診療。恒冷箱冷凍切片機能夠制作合用于多個目地的冷凍切片，是現在最為慣用的抱負冷凍切片制片方式。

1.冷凍切片的技術操作辦法

(1)將恒冷箱冷凍切片機的速凍頭和箱內溫度調節(jié)到適宜的切溫度，普通狀況下為一18～一25℃。

(2)在標本冷凍托上涂布一層冷凍包埋劑一OCT，然后將取材后新鮮標本安放在標本冷凍托上并用OCT覆蓋標本。

(3)標本冷凍完畢后將標本托固定在切片機的機頭上，調節(jié)機頭位置使其正好位于切片刀的后方。

(4)使用粗切削方式進行標本的粗切削至暴露標本的最大平面，使用自動推動方式持續(xù)切削2～3刀后用毛筆去除機頭、標本托及切片刀上的組織碎屑。

(5)調節(jié)并確認切片的厚度，普通為4～8um，染脂肪和神經組織應控制在12~25um。

(6)放下防卷板使防卷板的位置正好與切片刀的刀刃完全平行并略突出于刀刃。

(7)以自動推動的方式進行切片，良好的切片將在防卷板的下方形成一張完整平整的薄片，如切片略有彎曲可用小毛筆輕輕展平切片。

(8)打開防卷板，用載玻片平穩(wěn)地輕壓切片使其平整地吸附到載玻片上。

三、冷凍切片的染色

切好的冷凍切片立刻投入丙酮中進行固定，普通固定1～2min即可進行染色，用于免疫組化染色的冷凍切片應在切片略干時即刻投入冷甲醇中固定10~15rmin然后進行對應的組織化學染色程序。

1．冷凍切片的HE染色程序。

(1)切片在丙酮中固定1～2min。

(2)水洗5s。

(3)使用新鮮的Harris蘇木精染液染細胞核2min。

(4)水洗5s。

(5)在0.5％的鹽酸乙醇液中分化1～3s。

(6)水洗5s。

(7)在0.5％～1％的伊紅染液中染細胞質20~30s。

(8)水洗5s。

(9)在95％乙醇I、95％乙醇Ⅱ、100％乙醇I、100％乙醇Ⅱ、中逐級脫水各3～5s。

(10)甲苯I、二甲苯Ⅱ透明各5s。

(11)干組織周邊的二甲苯，在二甲苯尚未干燥前滴加光學樹脂膠封片。

四、注意事項

1．倡導使用新鮮蘇木精染色液：高質量的冷凍切片和良好的染色，是病理醫(yī)師為在手術中的外科醫(yī)師提供病理診療的重要手段。為了在短時間內獲得高質量的HE染色冷凍切片，在確保高質量冷凍切片的同時使用新鮮的蘇木精染色液是確保高質量染色的重要前提。

2.防卷板的調節(jié)：對的地調節(jié)使用冷凍切片機的防卷曲板是獲得平展完整冷凍切片的重要手段，防卷曲板的對的位置是與切片刀

對的位置防卷曲板低于刀刃防卷曲板過于突出

的刀刃平行并略微突出于刀刃。如防卷曲板過分突出于刀刃會造成切片機頭上的組織與防卷曲板相撞，如防卷曲板低于刀刃會造成切片向上卷曲不能形成平整的切片。在調試時可從下向上逐步提高防卷曲板的位置，每提高一點切一張切片測試，直至切片能在防卷曲板下形成完整平展的切片。

3.避免污染：切片污染是病理組織制片的大忌，在冷凍切片進行粗切削完畢后必須用毛筆清理碎屑，以避免其它標本的組織碎片沾染到正在進行切片的標本上。

4．不同組織的切片溫度調節(jié)：不同組織冷凍切片的冷凍溫度調節(jié)原則是，柔軟稚嫩富含水分的組織選擇相對較高的溫度，較為致密富含脂肪的組織選擇相對較低的溫度。柔軟稚嫩富含水分的組織選擇較低的溫度易造成切片呈碎屑狀，而致密富含脂肪的組織選擇較

高的溫度易造成切片堆積不能形成片狀。詳見表9·1。

表9．1部分組織冷凍切片的參考溫度值冷凍溫度組織一10～一15℃淋巴結、腎上腺、腦組織、脾臟、子宮內膜、黏液軟骨－16～一25℃乳腺、肺、膽囊、子宮、小腸、結腸、腎、肝臟、肌肉、胰腺、前列腺、皮膚、甲狀腺、扁桃體、軟組織腫瘤一25～一50℃富于脂肪的乳腺組織、纖維脂肪組織、富于脂肪的皮膚組織、富于脂肪的腫瘤

第十章慣用特殊染色

一、六胺銀染色

1．第一步準備工作：配制六胺銀染液，將10％硝酸銀2．5ml倒入干凈的染色缸內，加入2％硼砂5ml，液體呈乳白色，再加入3％烏洛托品40ml，染液逐步呈透明狀。

2．第二步染色過程：事先把溫箱調至60℃?zhèn)溆?，切片經脫蠟至水，?％過碘酸氧化10min，水洗，然后切片放人六胺銀染液放置60℃溫箱1h，染真菌時間要相對短某些，普通狀況下肉眼看到染液變色，切片呈棕色時從溫箱取出染色缸，倒掉染液，自來水沖洗1min，用0．25％氯化金調色1min，水洗后，用3％硫代硫酸鈉染5min,水洗，用蘇木精染液淺染，水洗、分化、沖水返藍，伊紅染10s，最后經脫水、透明、封固。

3．圖示成果：基底膜與毛細血管間質性物質、真菌呈棕黑色，核呈藍色。

4．注葸事項

(1)掌握染色溫度和時間，如60℃染1h，80℃染30～40min。

(2)真菌類染色時間相對要短，染色時間過長，切片染色過深，可用分色劑解決。

二、黏液卡紅染色

1．第一步準備工作：配制黏卡染液，將稱好的胭脂1g、氫氧化鋁1g倒入瓶內，加入50％L醇100rnl混合搖勻，再加入氯化鋁0．5g，水浴加溫逐步煮沸并攪動液體，使其充足溶解(注意染液容易外濺)，數分鐘后，染液由紅色變成透明深紫紅色，冷卻后將液體倒入量筒，再加入50％乙醇至原量，過濾，放人冰箱備用。

2．第二步染色辦法：染液使用時原液與蒸餾水比例為1：4稀釋．

切片厚5um，脫蠟至水，經蘇木精染色2min、水洗、分化、返藍后進人黏卡液染色2h以上，染液能夠重復使用多次，但要適宜延長染色時間．切片水洗后，脫水、透明、封固。

3．圖示成果：黏液為紅色，胞核為藍色．

4．注意事項

(1)染液使用時比例為1份黏卡原液，4份蒸餾水。

(2)用酶消化對照染色特異性很大，消化時間為20min。

(3)配制黏卡染液時要避免液體濺出。

三、石碳酸品紅染色

1．第一步準備工作

(1)配制鹽基性品紅飽和液：鹽基性品紅溶于乙醇內