第2章 基因工程制藥 第9、10節(jié)

第九節(jié)基因工程藥物的

質(zhì)量控制是利用活細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，產(chǎn)物的分子量較大，并有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，還參與生理功能的調(diào)節(jié)，用量極微，任何質(zhì)和量的偏差都可貽誤病情造成嚴(yán)重危害。宿主細(xì)胞中表達(dá)的外源基因，在轉(zhuǎn)錄翻譯精制工藝放大過程中都可能發(fā)生變化，故從原料以及制備全過程都必須嚴(yán)格控制條件和鑒定質(zhì)量。一、原材料的質(zhì)量控制

原材料的質(zhì)量控制是確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來自單一克隆，所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。根據(jù)質(zhì)量控制要求應(yīng)了解以下特性：⒈明確目的基因的來源、克隆經(jīng)過，并以限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和核苷酸序列予以確證；⒉應(yīng)提供表達(dá)載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及各組成部分（如復(fù)制子、啟動(dòng)子）的來源與功能，構(gòu)建中所用位點(diǎn)的酶切圖譜，抗生素抗性標(biāo)記物；⒊應(yīng)提供宿主細(xì)胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學(xué)特性；⒋須闡明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性；⒌提供插入基因與表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過程中啟動(dòng)與控制基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方法及水平等。二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制在工程菌的貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變；在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應(yīng)有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含有致癌因子，無細(xì)菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始種子批建立生產(chǎn)用工作細(xì)胞庫(kù)。原始種子批須確證克隆基因DNA序列，詳細(xì)敘述種子批來源、方式、保存及預(yù)計(jì)使用期，保存與復(fù)蘇時(shí)宿主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。對(duì)生產(chǎn)種子，應(yīng)詳細(xì)敘述細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性數(shù)據(jù)，依據(jù)宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)穩(wěn)定性，確定最高允許傳種代數(shù)；在培養(yǎng)過程中，應(yīng)測(cè)定被表達(dá)基因分子的完整性及宿主細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)后的基因型特征；依宿主細(xì)胞-載體穩(wěn)定性與產(chǎn)品恒定性，規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)時(shí)間，并定期評(píng)價(jià)細(xì)胞系統(tǒng)和產(chǎn)品。培養(yǎng)周期結(jié)束時(shí)，應(yīng)監(jiān)測(cè)宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)的特性，如質(zhì)?？截悢?shù)、宿主細(xì)胞中表達(dá)載體存留程度，含插入基因載體的酶切圖譜等。

三、純化工藝過程的質(zhì)量控制

產(chǎn)品要有足夠的生理和生物學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，確證提純物分子批間保持一致性；外源蛋白質(zhì)、DNA與熱源質(zhì)控制在規(guī)定限度以下。在精制過程中能清除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類、病毒、培養(yǎng)基成分及精制工序本身引入的化學(xué)物質(zhì)，并有檢測(cè)方法。四、目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制基因工程藥物的質(zhì)量控制主要包括以下幾項(xiàng)要求:產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性。它需要利用生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等多學(xué)科的理論與技術(shù)所建立的鑒定方法。⒈產(chǎn)品的鑒別常用的鑒定方法:電泳方法:SDS、等電聚焦、免疫電泳免疫學(xué)方法:放射免疫(RIA)、酶聯(lián)免疫(ELISA)受體結(jié)合試驗(yàn)高效液相色譜(HPLC)、肽圖分析法、末端序列分析、圓二色譜、核磁共振⑴肽圖分析肽圖分析是用酶法或化學(xué)法降解目的蛋白質(zhì),對(duì)生成的肽段進(jìn)行分離分析。它是檢測(cè)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)最有效的方法，該技術(shù)靈敏高效是對(duì)基因工程藥物的分子結(jié)構(gòu)和遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證的首選方法。常用HPLC、毛細(xì)管電泳。⑵氨基酸成分分析50個(gè)氨基酸較理想⑶部分氨基酸序列分析N端15個(gè)氨基酸可作為重組蛋白質(zhì)和多肽的重要鑒定指標(biāo)。

⑷重組蛋白質(zhì)濃度測(cè)定和相對(duì)分子量的測(cè)定蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法有:福林-酚法、雙縮脲法蛋白相對(duì)分子量的測(cè)定:凝膠過濾法、SD-SPAGE法⑸蛋白質(zhì)二硫鍵分析測(cè)定方法有:對(duì)氯汞苯甲酸法等5，5’-二硫基雙-2-硝基苯甲酸法⒉純度分析⑴蛋白質(zhì)含量測(cè)定SDS、等電聚焦、各種HPLC、毛細(xì)管電泳⑵雜質(zhì)①蛋白類雜質(zhì)殘留宿主細(xì)胞蛋白采用免疫分析的方法②非蛋白類雜質(zhì)②非蛋白類雜質(zhì)非蛋白類雜質(zhì)主要有:病毒、細(xì)菌等微生物、熱原、內(nèi)毒素、致敏源及DNA。常用檢測(cè)方法：雜質(zhì)和污染物檢測(cè)方法內(nèi)毒素鱟試劑、家兔熱原法宿主細(xì)胞蛋白免疫分析、SDS、CE其它蛋白雜質(zhì)免疫分析、SDS、HPLC、CE殘余DNADNA雜交、紫外光譜、蛋白結(jié)合蛋白變異肽譜、HPLC、IEF、CE甲酰蛋氨酸肽譜、HPLC、IEF、CE蛋氨酸氧化肽譜、HPLC、質(zhì)譜、氨基酸分析產(chǎn)物變性或聚和脫氨基SDS、IEF、HPLC、CE、質(zhì)譜、凝膠過濾雜質(zhì)和污染物檢測(cè)方法單克隆抗體SDS、免疫分析氨基酸取代氨基酸分析、肽譜、質(zhì)譜、CE微生物微生物學(xué)檢查支原體