曼地亞紅豆干杉葉片粗提液中紫杉醇的測定

曼地亞紅豆干杉葉片粗提液中紫杉醇的測定

紫杉醇是繼阿霉素和鉑之后的一種熱點抗癌藥物。它是世界上最具廣譜性和活性的抗癲癇藥物。就目前臨床供藥而言,紫杉醇的主要來源仍為天然紅豆杉屬植物。由于紫杉醇在樹皮中的含量低,所以用自然來源方式來獲取臨床所需的紫杉醇,已給紅豆杉屬植物帶來極大的威脅。曼地亞紅豆杉是紅豆杉科紅豆杉屬常綠針葉灌木植物,是一種天然雜交品種,其母本為東北紅豆杉,父本為歐洲紅豆杉。由于其生長速度快,4~5年生的曼地亞紅豆杉樹皮、枝葉中紫杉醇含量高于70~80年天然紅豆杉樹皮的紫杉醇含量;曼地亞紅豆杉植株利用率高,全株均含紫杉醇,都可參與提取紫杉醇;具有生物量大、適應能力強、生物特性穩(wěn)定等特點。曼地亞紅豆杉已被美國FAD批準用于提取紫杉醇首選的紅豆杉品種之一,如今國內(nèi)大量引種該物種,因此原料易得。從曼地亞紅豆杉枝葉中提取紫杉醇,不僅能改變天然紅豆杉的瀕危處境,具有影響深遠的生物學意義,而且能產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益。本實驗對曼地亞紅豆杉枝葉的乙醇粗提液經(jīng)過正己烷萃取,再經(jīng)碳酸鉀溶液堿洗兩步處理,除掉粗提液中大部分雜質(zhì),使其純度達到能進行HPLC檢測分析的要求,而不致因雜質(zhì)含量過高污染色譜柱,降低其使用壽命及影響分析。1實驗部分1.1曼地亞紅豆干葉的檢測紫杉醇對照品(購自中國藥品生物制定所,純度>98%)、甲醇、氯仿、正己烷、碳酸鉀、氯化鈉均為分析純;曼地亞紅豆杉干枝葉由湘西本草制藥責任有限公司提供。BT8100型泵;K-2501型紫外檢測器;CQ-6超聲儀;N2000雙通道色譜工作站;Explorer全自動電子天平。1.2溶液的制備1.2.1對照品儲備液的制備精密稱取紫杉醇對照品5.1mg,以甲醇溶解并定溶于10mL容量瓶中,制成510μg/mL的紫杉醇對照品儲備液。分別吸取0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.00mL對照品儲備液,以甲醇定溶于5mL容量瓶中,制成濃度分別為10.2,20.4,40.8,61.2,81.6,102μg/mL的標準液,供繪制標準曲線時使用。1.2.2萃取-濃縮法精密稱取5.0000g曼地亞紅豆杉干枝葉粉末,加入100mL無水乙醇,冷浸過夜,超聲處理40min,靜置過濾,濾渣再以100mL無水乙醇超聲30min,靜置過濾,合并濾液,于45℃真空濃縮至18mL左右,加入2mL蒸餾水,以50mL正己烷萃取,再以25mL正己烷萃取2次。乙醇相于45℃真空濃縮至無醇,濃縮物以50mL氯仿充分溶解,加入50mL1mol/L碳酸鉀溶液(含5%氯化鈉)攪拌20min,靜置分層,氯仿相再以25mL該碳酸鉀溶液洗滌2次。氯仿相轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶,并以氯仿定容,作供試品溶液。1.3流動相-甲醇-水法色譜柱:phenomenexC18(250mm×4.60mm,5μm),甲醇-水(65∶35)為流動相,流速0.7mL/min,檢測波長227nm,柱溫25℃。采用外標峰面積法進行定量分析。2結(jié)果與討論2.1標準曲線的建立以系列濃度對照品溶液按色譜條件進行操作,定量進樣6μL,測得紫杉醇濃度Y與濃度X的回歸方程為:Y=2325.8+4853.4X(R=0.9993,n=6),表明紫杉醇在10.2~102μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關系,標準曲線見圖1。2.2對照品溶液的測定同一天內(nèi)每隔1h及隔日于同一時間測定濃度為10.2,40.8,81.6μg/mL的對照品溶液共5次,用標準曲線計算含量。結(jié)果:日內(nèi)相對標準差(RSD)為:1.75%,1.22%,1.34%;日間相對標準差(RSD)為:1.81%,1.16%,1.47%。2.3加樣回收率試驗精密稱取5.0000g曼地亞紅豆杉干枝葉粉末6份,分別定量加入紫杉醇對照品,制成樣品溶液,測定峰面積,計算加樣回收率,結(jié)果平均加樣回收率為94.60%,RSD為1.28%(n=6),結(jié)果見表1。2.4進樣精密進樣供試品溶液經(jīng)0.45μm微濾膜過濾,按色譜條件精密進樣6μL,其結(jié)果見圖2、圖3。紫杉醇出峰時間為24.338min,對同一批樣測定5次,其平均含量為0.012%,RSD為1.46%。2.5其他條件下的實驗2.5.1紫杉醇粗提液堿洗在碳酸鉀溶液第2次堿洗時,常發(fā)生嚴重的乳化現(xiàn)象,在碳酸鉀溶液中加入5%氯化鈉即可消除乳化。2.5.2曼地亞紅杉樹干枝葉的粉末提取經(jīng)2次提取,可認為紫杉醇已提取完全,因在第3次提取液中按本文操作檢測未檢出紫杉醇。2.5.3波長選擇經(jīng)掃描,紫杉醇在紫外227nm處有最大吸收,故采用227nm為檢測波長。2.5.4流量相的選擇采用甲醇-水(65∶35)體系作為流動相,峰形好,拖尾現(xiàn)象不明顯。2.5.5精密度實驗測定日間相對標準差時,紫杉醇標準溶液于4℃保存,結(jié)果表明,紫杉醇在此條件下保存比較穩(wěn)定,沒有出現(xiàn)較明顯的異構(gòu)化及其他化學變化。3線性關系的良好實