第二章-紫外-可見分光光度法在食品檢測中的應(yīng)用

第二章紫外-可見分光光度法在食品檢測中的應(yīng)用2021/6/41一、紫外-可見分光光度法簡介1、什么是紫外-可見分光光度法？根據(jù)物質(zhì)分子對波長為200-760nm這一范圍的電磁波的吸收特性所建立起來的一種定性、定量和結(jié)構(gòu)分析方法。2021/6/422、什么是吸收曲線（吸收光譜）？描述物質(zhì)分子對輻射吸收的程度隨波長而變的函數(shù)關(guān)系曲線。具體做法：讓不同波長的光通過待測物，經(jīng)待測物吸收后，測量其對不同波長光的吸收程度(吸光度A)，以吸光度A為縱坐標，輻射波長為橫坐標作圖，得到該物質(zhì)的吸收光譜或吸收曲線。吸收光譜的產(chǎn)生：運動的分子外層電子→吸收外來輻射→產(chǎn)生電子能級躍遷→分子吸收譜2021/6/433、吸收曲線對物質(zhì)定性、定量的基礎(chǔ)及方法？（1）定性基礎(chǔ)：吸收曲線上的λmax、λmin、肩峰以及整個吸收光譜的形狀，決定于物質(zhì)的性質(zhì)，其特征隨物質(zhì)結(jié)構(gòu)而異，所以它是物質(zhì)定性的依據(jù)。（P171）不同物質(zhì)為什么會在特定的波長產(chǎn)生吸收峰？——不同物質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同或者說其分子能級的能量(各種能級能量總和)或能量間隔各異，因此不同物質(zhì)將選擇性地吸收不同波長或能量的外來輻射，這是UV-Vis定性分析的基礎(chǔ)。（P164-166:電子躍遷的種類）2021/6/44（2）定性分析方法：?與標準品、標準譜圖對比?對比吸收光譜特征數(shù)據(jù)?對比吸收度的比值2021/6/45（3）紫外-可見光譜定性分析的局限？

有機化合物紫外吸收光譜反映結(jié)構(gòu)中生色團和助色團的特性，不完全反映分子特性：紫外吸收光譜只有2～3個較寬的吸收峰，具有相同生色團的不同分子結(jié)構(gòu)，有時在較大分子中不影響生色團的紫外吸收峰，導(dǎo)致不同分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生相同的紫外吸收光譜——紫外吸收光譜相同，兩種化合物有時不一定相同。例如：甲苯與乙苯：譜圖基本相同2021/6/46（4）紫外光譜用于有機化合物結(jié)構(gòu)輔助解析a.可獲得的結(jié)構(gòu)信息1）200～800nm無吸收峰。脂肪族碳氫化合物、胺、醇、鹵代烴等，不含雙鍵或環(huán)狀共軛體系，且無醛、酮或溴、碘等基團。2）270～350nm有弱吸收峰（ε=10～100）而無其它強吸收峰則說明僅含非共軛的具有n電子的生色團發(fā)生的n→π*躍遷（R帶）3）250～300nm有中等強度的吸收峰（ε=200～2000）,芳環(huán)的特征吸收（具有精細結(jié)構(gòu)的B帶）。4）210～350nm有強吸收峰（ε≥104），表明含有兩個雙鍵的共軛體系（K）帶。共軛二烯：K帶（～230nm）；α,β-不飽和醛酮：K帶～230nm，260nm～350nm有強吸收峰——3～5個雙鍵的共軛體系。2021/6/47b.光譜解析注意事項1）確認λmax，并算出logε，初步估計屬于何種吸收帶；2）觀察主要吸收帶的范圍，判斷屬于何種共軛體系；3）pH值的影響加NaOH紅移→酚類化合物，烯醇。加HCl藍移→苯胺類化合物。4）識別未知物分子中可能具有的生色團、助色團并估計共軛程度。2021/6/48(5)定量基礎(chǔ)：朗伯-比爾定律和吸光度加和性朗伯-比爾定律：

當一束光強度為I0的單色光通過濃度為c、厚度為L的溶液時，溶液對光的吸收度與與溶液濃度及液層厚度成正比，公式表示為：A=KLc2021/6/49(6)朗伯-比爾定律中需注意的幾個問題：K稱為吸收系數(shù)，在單色光波長、濃度、溶劑、溫度一定時，K為常數(shù)，K常用摩爾吸收系數(shù)ε表示；朗伯-比爾定律只適用于單色光、溶液，儀器分光系統(tǒng)和待測液狀態(tài)都會影響定量準確性；2021/6/410(7)朗伯-比爾定律的偏離及其原因？根據(jù)朗伯-比爾定律，在同一條件下進行測定，A-c曲線應(yīng)為通過原點的直線，但實際工作中直線常常發(fā)生彎曲，這稱為朗伯-比爾定律的偏離。原因：吸光物質(zhì)濃度較高；非單色光引起；介質(zhì)不均勻引起；吸光物質(zhì)不穩(wěn)定引起。2021/6/411摩爾吸收系數(shù)ε：1mol/L濃度的溶液，液層厚度為1cm時的吸收度。強吸收：ε＞104；中等強度吸收：102＜ε＜104；弱吸收：ε＜102；摩爾吸收系數(shù)不能直接測得？2021/6/412(8)吸光度加和性：在多組分共存的溶液體系中，體系的總吸收度等于各組分吸收度之和，在任意波長下，共存的多組分中各組分遵守朗伯-比爾定律。這是多組分定量的基礎(chǔ)。A總=A1+A2+……+Ai

=ε1bc+ε2bc+……+εibc2021/6/413(9)定量分析方法：a、單組分定量方法1）標準曲線法先通過全波段掃描，根據(jù)吸收曲線特征選擇入射波長；配制該物質(zhì)不同濃度的標準溶液，測定其在入射波長處對應(yīng)吸光值；得到標準曲線后，通過標準曲線法測定待測試樣的濃度。2021/6/4142）標準對比法：該法是標準曲線法的簡化，即只配制一個濃度為cs的標準溶液，并測量其吸光度，求出吸收系數(shù)k，然后由Ax=kcx求出cx該法只有在測定濃度范圍內(nèi)遵守L-B定律，且cx與cs大致相當時，才可得到準確結(jié)果。2021/6/415b.多組分定量方法由于吸光度具有加和性，因此可以在同一試樣中測定多個組份。設(shè)試樣中有兩組份X和Y，將其顯色后，分別繪制吸收曲線，會出現(xiàn)如圖所示的三種情況：2021/6/4162021/6/417例

1.00×10-3mol·L-1的K2Cr2O7溶液及1.00×10-4mol·L-1的KMnO4溶液在450nm波長處的吸光度分別為0.200及0，而在530nm波長處的吸光度分別為0.050及0.420。今測得兩者混合溶液在450nm和530nm波長處的吸光度為0.380和0.710。試計算該混合溶液中K2Cr2O7和KMnO4濃度。（吸收池厚度為10.0mm)。2021/6/418c.2021/6/4194、紫外-可見分光光度計的構(gòu)成、類型和使用

（1）構(gòu)成：光源、單色器、吸收池、檢測器、信號處理器、顯示器可見光源：碘鎢燈、鎢燈：320-2500nm紫外光源：氫燈、氘燈、汞燈：150-400nm2021/6/420玻璃吸收池：僅用于可見光區(qū)石英池：可用于紫外光區(qū)和可見光區(qū)標準比色皿短光程微量比色皿通用型微量池專用超微量比色皿微量池架遮光板2021/6/421玻璃吸收池和石英池的辨別？吸收池的配對？2021/6/422（2）紫外可見分光光度計的類型和使用：1）.單光束分光光度計：可定量分析；不能自動掃描吸收曲線。752型紫外-可見分光光度計a）開機預(yù)熱b）波長設(shè)置c）設(shè)置測試模式d）調(diào)零e）測樣品，讀數(shù)2021/6/4232).雙光束分光光度計：

減少誤差；可進行波長掃描，繪制吸收曲線。TU-1901紫外可見分光光度計a）接通電源、打開開關(guān)，打開樣品室，預(yù)熱10minb）打開軟件c）選擇測試模式，設(shè)置波長d）空白液調(diào)零e）測試樣品2021/6/4243).雙波長分光光度計：通過切光器使兩束不同波長的光交替通過吸收池，測得吸光度差ΔA。2021/6/425a）可測多組份試樣、混濁試樣；b）不需參比液(消除了由于參比池的不同和制備空白溶液等產(chǎn)生的誤差)；c）通過波長的選擇方便地校正背景吸收，消除吸收光譜重疊的干擾；d）克服了電源不穩(wěn)而產(chǎn)生的誤差，靈敏度高。2950型2021/6/4264).多通道分光光度計可光譜掃描、光度測量、定量測量、時間掃描；掃描速度快；光源透鏡吸收池光柵光電二極管陣列檢測器TU-1800SPC紫外-可見分光光度計2021/6/4275)新型分光光度計展示光度計PhotoLabSpektral適于多種形狀吸收池DR2700型便攜式分光光度計

便攜性2021/6/4285、分光光度法測量條件的選擇（1）檢測波長的選擇根據(jù)吸收曲線選擇不易有其它物質(zhì)干擾的、較高的和寬的吸收峰處的波長2021/6/429（2）溶劑的選擇及處理方法選擇原則：能完全溶解樣品；在所用的波長范圍內(nèi)有較好的透光性；純度為“光譜純”或經(jīng)檢驗其空白符合規(guī)定。處理方法：蒸餾水煮沸去除氣泡；乙醇去除醛類、苯等雜質(zhì)；環(huán)己烷、正己烷去除苯；氯仿防止光和空氣破壞；乙醚去除過氧化物；烴類吸附除雜2021/6/430（3）參比溶液的選擇1）.溶劑參比：試樣組成簡單、共存組份少（基體干擾少）、顯色劑不吸收時，直接采用溶劑（多為蒸餾水）為參比；2）.試劑參比：當顯色劑或其它試劑在測定波長處有吸收時，采用試劑作參比（不加待測物）；3）.試樣參比：如在測定波長處顯色劑無吸收而試樣基體有吸收，且試樣基體不與顯色劑反應(yīng)時，可以試樣作參比（不能加顯色劑）；4）.褪色參比：顯色劑和被測試樣均有顏色，則在一份試液中先加掩蔽劑，再按測定方法加入顯色劑等其它試劑作為參比。2021/6/431（4）吸光度讀數(shù)范圍的選擇改變被測液濃度使吸光度在0.16～0.80范圍內(nèi)（5）顯色反應(yīng)條件的選擇顯色劑用量溶液的酸度溫度顯色時間干擾組成的去除2021/6/432二、紫外-可見分光光度法

在食品檢測中的應(yīng)用（一）、食品酶分析一般步驟：粗酶液制備→反應(yīng)→終止反應(yīng)→（顯色）→檢測→計算注意事項：粗酶液制備時根據(jù)目標酶的性質(zhì)選擇緩沖液、溫度、時間等條件；酶和底物的反應(yīng)條件也要恰當；一般以檢測產(chǎn)物變化量居多。2021/6/433二、紫外-可見分光光度法

在食品檢測中的應(yīng)用（一）、食品酶分析1、

-半乳糖苷酶（乳糖酶）以O(shè)NPG（鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷）為底物測定

-半乳糖苷酶活力。鄰-硝基苯酚（ONP）：黃色，420nm有特異吸收2021/6/434“不同豆類乳糖酶活力的研究”樣品處理：紅豆、綠豆、花生、黃豆→發(fā)芽→取10g→加20mL預(yù)冷的緩沖液A（0.1mol/L磷酸緩沖液，pH為7.0、內(nèi)含5%甘油和1mmol/LEDTA），冰浴研磨，5000r/min冷凍離心10min，收集上清液待測。反應(yīng)：0.2mL5mmol/LONPG、0.2mLpH4.0的0.1mol/LNaAc-HAc緩沖液和0.1mL稀釋25倍的各種粗酶液，在50℃水浴中準確反應(yīng)15min后加1.0mL0.2mol/L碳酸鈉溶液終止反應(yīng)。測定：紫外分光光度計420nm測反應(yīng)液的吸光度。計算：根據(jù)產(chǎn)生的ONP的量計算酶活力。酶活力單位定義為：在規(guī)定條件下，每分鐘在420nm波長下每增加0.001個吸光度單位所需的酶量。2021/6/4352021/6/4362、蛋白酶活力測定中性蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶制備粗酶液時所用緩沖液的pH值不同常用方法：福林-酚法2021/6/437福林-酚法原理:福林-酚試劑(磷鎢酸和磷鉬酸混合試劑)在堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原而呈藍色反應(yīng)（鎢蘭和鎢蘭混合物）。由于蛋白質(zhì)中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物也呈此反應(yīng)。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反應(yīng)，來間接測定蛋白酶的活力。2021/6/438操作過程：即先將酶和底物（酪蛋白）在一定條件下反應(yīng)一段時間，然后終止反應(yīng)，再取一定量的反應(yīng)液和福林酚試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，最后用分光光度法檢測生成的呈色物質(zhì)的量。2021/6/439GB/T23527-2009：蛋白酶活性的測定所需儀器和設(shè)備

分析天平：精度0.0001g

恒溫水浴：精度±0.2℃

計時表

分光光度計

沸水浴器

振蕩混合器

pH計:精度0.01pH單位2021/6/440試劑和溶液

乳酸緩沖液（pH=3.0）適用于酸性蛋白酶磷酸緩沖液的制備（pH=7.5）適用于中性蛋白酶硼酸緩沖液(pH=10.5)適用于堿性蛋白酶0.4mol/L碳酸鈉溶液0.4mol/L的三氯醋酸液10.00mg/ml酪素溶液100μg/ml酪氨酸標準溶液福林-酚試劑2021/6/441粗酶液制備：稱取經(jīng)研磨的樣品5g，置于100mL容量瓶中。測中性蛋白酶則加pH7.5的磷酸鹽緩沖液50mL在25℃浸提1h,測酸性蛋白酶則加pH3.0的乳酸-乳酸鈉緩沖液50mL在25℃浸提1h,測堿性蛋白酶則加pH10.5的硼砂氫氧化鈉緩沖液50mL在25℃浸提1h，浸提完成后用相應(yīng)的緩沖液定容至100mL，然后取濾液進行酶活力測定。

2021/6/442標準曲線的繪制

L-酪氨酸標準溶液按下表配制。分別取上述溶液各1.00ml(須做平行試驗)，各加0.4mol/L碳酸鈉溶液5.00ml。福林試劑使用溶液1.00ml,置于40+0.2℃水浴中顯色20min,取出用分光光度計于波長680nm比色，以不含酪氨酸的0管為空白管調(diào)零點，分別測定其吸光度值，以吸光度值為縱坐標，酪氨酸的濃度為橫坐標，繪制標準曲線或計算回歸方程。試管號012345100μg/ml酪氨酸溶液體積（mL）012345蒸餾水（mL）1098765酪氨酸實際濃度（μg/ml）010203040502021/6/443樣品測定：

先將酪素溶液放入（40±0.2）℃恒溫水浴中，預(yù)熱5min

取4支試管，各加入1ml酶液取一支作為空白管，加2ml三氯乙酸，其他3管作為測試管各加入1ml酪素，搖勻，40℃保溫10min取出試管，3支測試管中各加入2ml三氯乙酸，空白管中加1ml酪素。

靜置10min，過濾沉淀各取1ml濾液，分別加0.4mol/L的Na2CO35ml、福林試劑1ml。在40℃顯色20min。680nm處測OD值。

以空白管調(diào)零點。

注：1.398中性蛋白酶制劑和166中性蛋白酸制劑，除反應(yīng)與顯色溫度為30℃±0.2℃外，其他操作同上，標準曲線做同樣處理。2021/6/444計算：酶活力定義為：在40℃，一定pH條件下1min水解干酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量為一個蛋白酶活力單位，酶活力單位為ug/min。樣品酶活力計算：X(U/g)=C×7×4×V/(10×m)其中，C為測定樣品時通過吸光度從標準曲線上得來的酪氨酸的濃度（ug/mL）；V為制備酶液時定容的體積（mL）；m為稱取樣品的質(zhì)量(g)；7是顯色反應(yīng)時反應(yīng)體系的體積（mL）；4是酶解反應(yīng)時反應(yīng)體系體積對酶液體積的稀釋倍數(shù)；10是酶解反應(yīng)的時間（min）。2021/6/445“紫外光譜法定量測定不同種蛋白酶活力的研究”原理：利用蛋白酶在一定的溫度與pH值條件下,水解酪素底物,水浴60℃滅酶,然后加入三氯乙酸使未水解的酪素沉淀除去,濾液對紫外光有吸收,可采用紫外光譜法測定。根據(jù)吸光度計算蛋白酶活力。試劑：2%酪蛋白溶液；100μg/ml標準酪氨酸溶液；0.4mol/L三氯乙酸溶液；緩沖溶液2021/6/446操作步驟：粗酶液制備同上法。測定波長的選擇：在230~500nm范圍內(nèi)掃描,得到其吸收光譜曲線。2021/6/447操作步驟：標準曲線的繪制：將標準系列溶液,在275.0nm處進行測定,并繪制標準曲線。試管號012345100μg/ml酪氨酸溶液體積（mL）012345蒸餾水（mL）1098765酪氨酸實際濃度（μg/ml）010203040502021/6/448操作步驟：樣品測定：先將酪素溶液放入(40±0.2)℃恒溫水浴中,預(yù)熱5min。2021/6/449計算：X(U/g)=C×10×V/(10×m)其中，C為測定樣品時通過吸光度從標準曲線上得來的酪氨酸的濃度（ug/mL）（已減去空白）；V為制備酶液時定容的體積（mL）；m為稱取樣品的質(zhì)量(g)；分子上的10是濾液定容的體積（mL）。分母上的10是反應(yīng)時間（min）2021/6/450兩種方法比較2021/6/4513、超氧化物歧化酶原理：在堿性條件下，鄰苯三酚會發(fā)生自氧化，可根據(jù)SOD抑制鄰苯三酚自氧化能力測定SOD活力。試劑：0.1mol/LTris-HCl緩沖液（pH8.2,含1mmol/LEDTA-2Na）;4.5mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液2021/6/452“青稞苗中超氧化物歧化酶（SOD)活性的測定”樣品處理：取剪碎的青稞苗樣品10.0g置于研缽中，加入100.0mL蒸餾水研磨5分鐘，移入離心管。用少量蒸餾水沖洗研缽，洗液并入離心管中，加蒸餾水至刻度，經(jīng)4000r/min離心15min，棄去沉淀，取上清液測定。2021/6/453檢測：在25℃左右，于10mL比色管中依次加入A液2.35mL，蒸餾水2.00mL，B液0.15mL。加入B液立即混合并傾入比色皿，分別測定在325nm波長條件下初始時和1min后吸光度值，二者之差為鄰苯三酚自氧化速率△A325。在25℃左右，于10mL比色管中依次加入20uL樣液，A液2.35mL，蒸餾水2.00mL，B液0.15mL。加入B液立即混合并傾入比色皿，分別測定在325nm波長條件下初始時和1min后吸光度值，二者之差為樣液抑制鄰苯三酚自氧化速率△A′325。2021/6/454酶活力定義：25℃時抑制鄰苯三酚自氧化速率50%所需的SOD定義為一個活力單位。計算：2021/6/455[1]李丕武,劉瑜,李瑞瑞,段夢迪,黃少華.兩種葡萄糖氧化酶活力測定方法的比較[J].食品工業(yè)科技[2]陳育紅,.大豆種皮過氧化物酶活力的測定方法[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊),2013,(5).[3]巫小琴,徐強,李燚,陶詩,黎勇,.纖維素酶產(chǎn)生菌的分離及其酶活力測定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,(35).[4]馬歌麗,魏泉增,張志剛,.分光光度法測定大曲糖化酶活力探討[J].中國釀造,2008,(17).[5]孫艷波,何衛(wèi)加,雷虹,劉躍泉,于景華.嬰兒配方粉中溶菌酶活力的測定及其校正系數(shù)的研究[J].中國乳品工業(yè),2002,(5).[6]吳涓,肖亞中,王怡平,李清彪.蜜環(huán)菌胞外漆酶酶活力的分光光度法測定[J].廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2001,(4).[7]禹邦超，鄧輝勝，王旭，劉德立.多種形式酯酶總活力的混合底物分光光度測定法[J].華中師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),1996,(1).[8]王福榮,陳敏.分光光度法測定α-淀粉酶活力[J].釀酒科技,1992,(3).2021/6/456二、紫外-可見分光光度法

在食品檢測中的應(yīng)用（二）、食品成分分析1、雙波長等吸收點法測定銀杏果仁中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量原理？方法：樣品制備：粉碎、脫脂、溶解淀粉、碘試劑反應(yīng)標準品作吸收曲線，選擇波長對標準品系列在選定波長對下測定，作△A-c曲線在選定波長對下進行樣品測定，據(jù)△A計算c2021/6/4572、食品中甜蜜素的檢測“GB/T5009.97-2003食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定”第二法比色法原理：2021/6/458分析步驟：提?。阂后w試樣：稱取10.0g試樣于透析袋中，加10mL透析劑，將透析袋口扎緊，放入盛有100mL水的200mL廣口瓶中，加蓋，透析20h-24h得透析液。固體試樣：稱取2.0g已剪碎的試樣于研缽中，加少許海砂研磨至呈干粉狀，經(jīng)漏斗倒入100mL容量瓶中，加水沖洗研缽，并將洗液一并轉(zhuǎn)移至容量瓶中。加水至刻度，不時搖動，1h后過濾，得試樣提取液。準確吸取10.0mL試樣提取液于透析紙中，加10mL透析劑，將透析袋口扎緊，放入盛有100mL水的200mL廣口瓶中，加