中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程微生物限度檢查法

微生物程度檢查法一、細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)１簡述細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)是檢測非規(guī)定滅菌制劑及原、輔料受微生物污染程度的辦法。也是用于評價(jià)生產(chǎn)公司的藥用原料、輔料、設(shè)備、器具、工藝流程、環(huán)境和操作者的衛(wèi)生狀況的重要手段和根據(jù)細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)均采用平板菌落計(jì)數(shù)法，這是活菌計(jì)數(shù)的辦法之一，也是現(xiàn)在國際上許多國家慣用的一種辦法。以在瓊脂平板上的細(xì)菌、霉菌和酵母菌形成一種獨(dú)立可見的菌落為計(jì)數(shù)根據(jù)。該法測定成果只反映在該規(guī)定條件下所生長的細(xì)菌（為一群嗜中溫、需氧和兼性厭氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落數(shù)。不涉及對營養(yǎng)、氧氣、溫度、pH和其它因素有特殊規(guī)定的細(xì)菌、霉菌和酵母菌。一種細(xì)菌、霉菌和酵母菌的菌落均可由一種或多個(gè)菌細(xì)胞生長繁殖而成。因此供試品中所測得的菌落數(shù)，實(shí)際為菌落形成單位數(shù)（colonyformingunity，cfu），不應(yīng)理解為細(xì)菌、霉菌、酵母菌的個(gè)數(shù)。2設(shè)備、儀器2.1設(shè)備2.微生物程度檢查應(yīng)有單獨(dú)的干凈實(shí)驗(yàn)室，每個(gè)干凈實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有獨(dú)立的凈化空氣系統(tǒng)。2.1干凈實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的照明燈應(yīng)嵌裝在天花板內(nèi)，室內(nèi)光照應(yīng)分布均勻，光照度不低于300LX。2.1.12.12.12.1不同干凈級別的微粒、浮游菌和沉降菌原則見下表1。表l不同干凈級別的微粒、浮游菌和沉降菌原則干凈級別塵埃數(shù)∕m3浮游菌（個(gè)）∕m3沉降菌（個(gè)）∕（φ90mm·0.5h）微粒直徑≥0.5μm微粒直徑≥5μm100級≤3，500≤0≤5≤110000級≤350，000≤≤100≤3100000級≤3，500，000≤20，000≤500≤10沉降菌數(shù)測定（Ⅱ法）干凈實(shí)驗(yàn)室操作臺消毒擦拭解決后，先啟動層流凈化妝置30min，將備妥的營養(yǎng)瓊脂平板3個(gè)（經(jīng)30～35℃預(yù)培養(yǎng)48h，證明無菌落生長）。以無菌方式（或經(jīng)傳遞箱）移人操作間，置凈化臺左、中、右各1個(gè)，開蓋，暴露30min后將蓋蓋上。在30～35有條件的單位，同時(shí)應(yīng)檢查干凈操作間和凈化工作臺上的浮游菌和微粒數(shù)。操作問和凈化工作臺要定時(shí)檢測其干凈度，分別應(yīng)達(dá)成10000級和100級。如菌落數(shù)或微粒數(shù)超標(biāo)，應(yīng)清洗過濾系統(tǒng)中的過濾設(shè)施，必要時(shí)予以更換。2.12.1涉及實(shí)驗(yàn)室監(jiān)控菌株的分離鑒定、樣品陽性菌株的分離分析、辦法驗(yàn)證明驗(yàn)中的陽性菌操作等實(shí)驗(yàn)活動，應(yīng)在專門的陽性菌實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。除另有規(guī)定外，陽性菌實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合國家Ⅱ級生物安全原則，陽性菌實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備生物安全柜。陽性菌操作不得在供試品檢查用干凈實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。2.1.2.2儀器2.2.1恒溫培養(yǎng)箱（30～35℃菌落計(jì)數(shù)器、顯微鏡（40×～1500×）、電子天平或藥品天平（感量0.2.2.2玻璃器皿錐形瓶（250～300ml、500ml內(nèi)裝玻璃珠若干）、培養(yǎng)皿（9cm）、量筒（100ml，500m1）、試管（18mm×180mm）及塞、吸管（1m1分度0.0l，10m1分度0.1）、注射器（20ml或30m1）、涂布棒、注射針頭、載玻片、蓋玻片、玻璃消毒缸（帶蓋）、不銹鋼桶（帶蓋）。玻璃器皿用前應(yīng)洗滌干凈，吸管、量筒不掛水滴，無殘留抗菌物質(zhì)。吸管口上端距0.5cm2.2.3用品大、小橡皮乳頭（放于干凈帶蓋的容器中，并應(yīng)定時(shí)用70％～75％乙醇溶液浸泡）。無菌衣、帽、口罩、手套接種環(huán)（白銥金或鎳鉻合金，環(huán)徑4～5mm、長度6～10cm）、乙醇燈、乙醇棉球或碘伏棉球、滅菌剪刀或滅菌手術(shù)刀和滅菌鑷子、滅菌鋼錐、滅菌稱樣紙、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、白瓷盤、洗手盆、陶瓦蓋（12cm）3試液、稀釋劑和試劑3.1試液3.1.10.1％苯扎溴銨溶液或其它適宜消毒液3.1.25％石碳酸溶液（配好后裝入玻璃消毒缸內(nèi)，供消毒帶菌吸管用）亦可選用其它適宜消毒液。3.1.375％乙醇溶液。3.13.2稀釋劑和試劑稀釋劑配制后，采用高壓蒸汽滅菌法滅菌。3.2.10.9％無菌氯化鈉溶液（附件二3.1）。3.2.2pH7.0無菌氯化鈉―3.2.3無菌聚山梨酯80氯化鈉―蛋白胨緩沖液（附件二33.2.4pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.3.2.5無菌聚山梨酯80氯化鈉溶液（附件二33.2.6無菌0.1％氯化三苯四氮唑溶液（TTC）（附件二23.2.7pH7.4培養(yǎng)基4.1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.2）。4.2玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.4）。4.3酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.5）。培養(yǎng)基制備注意事項(xiàng)：4.4.4.4.4.3.4.4.4培養(yǎng)基合用性實(shí)驗(yàn)的規(guī)定及操作見本操作規(guī)程第三部分。5供試品抽樣、保存及檢查量5.1抽樣5.5.5.5.2保存5.5.5.3檢查量5.5.3.5.5.3.45.3.5特殊貴重或微量包裝的藥品，檢查量可酌減。除另有規(guī)定外，口服固體制劑不低于規(guī)定檢查沙門菌的供試品，其檢查量應(yīng)增加20g或20ml（其中10g或10ml用于陽性對照實(shí)驗(yàn)）。6實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備6.1將供試品及全部已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管、吸管（1ml、10m1）、量筒、稀釋劑等移至干凈實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。每次實(shí)驗(yàn)所用物品必須事先做好計(jì)劃，準(zhǔn)備足夠用量，避免操作中出入干凈實(shí)驗(yàn)室。編號后將全部外包裝（牛皮紙）去掉。6.2啟動干凈實(shí)驗(yàn)室空氣過濾裝置，并使其工作不低于30min。6.3操作人員用肥皂或適宜消毒液洗手，進(jìn)入緩沖間，換工作鞋。再用0.1％苯扎溴銨溶液或其它消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴無菌衣、帽、口罩、手套。6.4操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口處周邊，待干后用滅菌的手術(shù)鑷或剪將供試品啟封。7供試液的制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采用適宜的辦法制備供試液。所用乳化劑，分散劑、中和劑或滅活劑及其用量應(yīng)證明是有效的，并對微生物無毒性。供試液的制備若需用水浴加溫時(shí)，溫度不應(yīng)超出45℃7.1液體供試品取供試品10ml，加pH7.0無菌氯化鈉―蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為供試液。油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80使供試品分散均勻。水溶性液體制劑可用混合的供試品原液作為供試液。7.2固體、半固體或黏稠液供試品取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉―蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀或其它適宜的辦法，混勻，作為供試液。必要時(shí)加適量的無菌聚山梨酯80，并置水浴中合適加溫使供試品分散均勻。7.3非水溶性供試品7.3.1軟膏、乳膏劑取供試品5g（或5m1），加至含溶化的（溫度不超出45℃）司盤805g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯8010g的無菌混合物（溶化，溫度不超出45℃）的燒杯中，即先將燒杯中無菌助溶劑混合物溶化，待溫度不超出45℃時(shí)，加入供試品，用無菌玻棒攪拌成團(tuán)后，分次慢慢加入457.3.7.3.3栓劑稱取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加適量稀釋劑，置45℃水浴保溫10min，使溶，加入無菌聚山梨酯805～8ml，振搖使之乳化，再加稀釋劑（稀釋劑和聚山梨酯80總量為100m7.3.4膏劑取供試品10g，加至含20ml無菌十四烷酸異丙酯（制法見附錄ⅪH“無菌檢查法”)和無菌玻璃珠的適宜容器中，必要時(shí)可增加十四烷酸異丙酯的用量，充足振搖，使供試品溶解。然后加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉―蛋白胨緩沖液100m7.4非水溶性膜劑供試品普通取樣為100cm2，置滅菌錐形瓶中，加入適量的pH7.0無菌氯化鈉―蛋白胨緩沖液，于45℃±1℃水浴中保溫，浸泡，振搖，以供試品浸液作為l:10供試液。中藥膜劑取100cm2，剪碎，加適量的pH7.0無菌氯化鈉―蛋白胨緩沖液（普通1cm2加1ml或2m1），浸泡，振搖，以供試品浸液作為17．5腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品取供試品10g，腸溶制劑加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液至100ml，結(jié)腸溶制劑加pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液至100ml，均置45℃水浴中，振搖，使溶解，作為1:7.6氣霧劑、噴霧劑供試品取規(guī)定量供試品，置冰箱冰凍室（－20℃下列）內(nèi)約1h。取出，快速消毒供試品容器的啟動部位周邊，用無菌鋼錐在容器上鉆一小孔，在室溫輕輕轉(zhuǎn)動容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器吸出全部藥液，加至適量的稀釋劑（若含非水溶性成分，加適量的無菌聚山梨酯80）中，混勻，取相稱于10g或10ml的供試品，再稀釋成1:107.7茶劑供試品取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加入稀釋劑100ml，振搖2～3min，以滅菌紗布過濾（如為袋泡茶，可直接取2袋，以稱樣成果按1:10加稀釋劑，浸泡30min）。以上供試品如吸水膨脹，或黏度過高，可增加稀釋劑的量，制成1:20～1:100供試液。7.8貼膏劑供試品取規(guī)定量供試品，去掉貼劑的保護(hù)層，放置在無菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有滅活劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振蕩最少30min，或放置于均質(zhì)儀均質(zhì)l0min，或以其它辦法制備成供試液。7.9具抑菌活性的供試品當(dāng)供試品含有抑菌活性時(shí)，應(yīng)消除供試液的抑菌活性后，再依法檢查。慣用的辦法以下：7.9.1稀釋法7.9.2離心沉淀法此辦法用于去除供試液中的沉淀物，對于抑菌活性較強(qiáng)的供試品，如供試液中有不溶顆粒、沉淀，取供試液，先以500r／min，離心3min，取上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，此辦法用于細(xì)菌計(jì)數(shù)和控制菌7.9.37.9.8供試液的釋?。?0倍遞增稀釋法）8.1取2～3支滅菌試管，分別加入9mlpH7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液滅菌稀釋劑（此時(shí)操作普通為：左手執(zhí)試管并將塞打開，傾斜，右手執(zhí)10ml吸管吸量。切勿在酒精燈火焰的正上方操作，以免火焰將供試液中的菌細(xì)胞殺滅）。加稀釋劑后，試管塞應(yīng)立刻塞上。8.2另取1支1ml滅菌吸管吸1:10均勻供試液1ml，加入裝有9mlpH7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液滅菌稀釋劑的試管中，混勻，即得1:100供試液。以這類推，根據(jù)供試品污染程度，可稀釋至1:103、1:104等適宜稀釋級。每遞增l稀釋級，必須另換一支吸管。稀釋時(shí)，吸管插入第1級稀釋液內(nèi)不低于液面2.5cm，重復(fù)吸吹約10次。吸液時(shí)，應(yīng)先吸至高于吸管上部刻度少量，然后提起吸管，貼于試管內(nèi)壁調(diào)節(jié)液量至刻度，吸管移至第2級稀釋管的內(nèi)壁近液面處（勿接觸液面）緩慢地放出全部供試液（吸管內(nèi)應(yīng)無黏附或殘留液體9計(jì)數(shù)辦法驗(yàn)證由于某些供試品含有抗菌活性，在建立測定辦法或原測定法的檢查條件發(fā)生變化時(shí)，可能影響檢查成果的精確性，必須對供試品的抑菌活性及測定辦法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。對各實(shí)驗(yàn)菌的回收率應(yīng)逐個(gè)進(jìn)行驗(yàn)證。9.1驗(yàn)證用菌株大腸埃希菌Escherichiacoli[CMCC(B)44102]，金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus[CCMCC(B)26003]，枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis[CMCC(B)63501]，白色念珠菌Candidaalbicans[CMCC(F)98001]，黑曲霉菌Aspergillusniger[CMCC(F)98003]。菌液制備接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18～24h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48h。上述培養(yǎng)物用0.9％無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml含0.05％（ml／m1）聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用適宜辦法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05％（ml／ml）聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)50～l00cfu的孢子懸液。菌懸液制備后，若在室溫下放置應(yīng)在2h內(nèi)使用，若保存在2～8℃的菌懸液能夠在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉菌的孢子懸液保存在2～8℃9.2驗(yàn)證辦法驗(yàn)證明驗(yàn)分4組，最少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行實(shí)驗(yàn)，并分別計(jì)算供試品組和對照組實(shí)驗(yàn)的菌回收率。9.9.9.9.9.3成果鑒定對照組的菌回收率均應(yīng)不低于70％。若供試品組的菌回收率均不低于70％，則可按該供試液制備辦法和菌落計(jì)數(shù)法測定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次實(shí)驗(yàn)中供試品組的菌回收率低于70％，應(yīng)建立新的辦法，消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。9.4驗(yàn)證明驗(yàn)可與供試品的細(xì)菌，霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行。9.5注意事項(xiàng)9.9.5.2黑曲霉菌的菌液制備將黑曲霉菌接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，于20～25℃培養(yǎng)5～7天，使大量的孢子產(chǎn)生。加入3～5ml含0.05％（ml／m1）聚山梨酯80的0.9.5.3做實(shí)驗(yàn)菌的回收率實(shí)驗(yàn)時(shí)，加入菌量50～l9.5.4進(jìn)行驗(yàn)證明驗(yàn)時(shí)，若因沒有適宜的辦法消除供試品中的抑菌作用而造成微生物回收的失敗，應(yīng)采用能使微生物生長的更高稀釋級供試液進(jìn)行辦法驗(yàn)證明驗(yàn)。此時(shí)更高稀釋級供試液確實(shí)認(rèn)要從低往高的稀釋級進(jìn)行，但最高稀釋級供試液選擇應(yīng)根據(jù)供試品應(yīng)符合的微生物程度原則和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，如供試品應(yīng)符合的微生物程度原則是1克細(xì)菌數(shù)不得過1000cfu，那么最高稀釋級是1:1若采用允許的最高稀釋級供試液進(jìn)行驗(yàn)證明驗(yàn)還存在一株或多株實(shí)驗(yàn)菌的回收率達(dá)不到規(guī)定，那么應(yīng)選擇回收狀況最靠近規(guī)定的辦法進(jìn)行供試品的檢測。如某種產(chǎn)品對某實(shí)驗(yàn)菌有較強(qiáng)的抑菌性能，采用薄膜過濾法的回收率為40％，而采用培養(yǎng)基稀釋法的回收率為30％，那么應(yīng)選擇薄膜過濾法進(jìn)行該供試品的檢測。在此狀況下，生產(chǎn)單位或研制單位應(yīng)根據(jù)原輔料的微生物質(zhì)量、生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品特性進(jìn)行產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)評定，以確保檢查辦法的可靠性，從而確保產(chǎn)品質(zhì)量。10檢查法10.1平皿法10.1.10.1.2陰性對照10.1將預(yù)先配制好的細(xì)菌計(jì)數(shù)用的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)用的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基；含蜂蜜、王漿液體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（霉菌）和YPD瓊脂培養(yǎng)基（酵母菌）熔化，冷至約45℃時(shí)，傾注上述各個(gè)平皿約15ml，以順時(shí)針或反時(shí)針方向快速旋轉(zhuǎn)平皿，使供試液或稀釋液與培養(yǎng)基混勻，蓋上陶瓦蓋，或半蓋蓋，除去冷凝水后，再移去陶瓦蓋后，蓋上平皿蓋置操作平臺上待凝。在旋轉(zhuǎn)平皿時(shí)切勿將培養(yǎng)基濺到10.細(xì)菌計(jì)數(shù)平板倒置于30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)平板倒置于23～28℃10.10.1.510.1.5.210.1.5.3供試品稀釋液常含有不溶性原料、輔料，培養(yǎng)基注皿后亦可能產(chǎn)生沉淀物，通過培養(yǎng)后有時(shí)形成數(shù)量諸多的有形物，且難與菌落相區(qū)別。為了有助于菌落計(jì)數(shù)，可在操作時(shí)將適宜稀釋級的供試液多增加注皿（1～2個(gè)平皿）。注皿后不經(jīng)培養(yǎng)而放置于冰箱（10.110.110.110.110.110.110.10.110.110.1菌數(shù)報(bào)告規(guī)則示例見下表2。表2菌數(shù)報(bào)告規(guī)則示例菌數(shù)報(bào)告規(guī)則示例各稀釋級（供試液1ml∕皿）平均菌落計(jì)數(shù)（cfu）菌數(shù)報(bào)告數(shù)（cfu∕g，ml，10cm2）原液1:10（－1）1:102（－2）1:103（－3）1——64826402——42064864003——不可計(jì)42064640004——00.50＜1005————00＜1006——000＜107000——＜110.2薄膜過濾法10.10.2.2薄膜過濾法采用的濾膜孔徑應(yīng)不不不大于010.2.10.10.10.2.6取相稱于每張濾膜含1g、1ml或10cm2供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品每1g、1ml或10cm2所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級的供試液1ml，過濾。用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液或其它適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗辦法和沖洗量見10.2.3及1010.10.210.10.2.10菌數(shù)報(bào)告規(guī)則以相稱于1g、1ml或10cm2供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長，以＜1報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g、1ml或10cm2供試品10.3培養(yǎng)基稀釋法取低稀釋級供試液（原液或1:10供試液或其它供試液）2份，每份各1ml，分別注入平皿中（每皿0.5ml、0.2ml或＜0.2m1每份供試液所加注平板點(diǎn)計(jì)的菌落之和，即為每lml菌落數(shù)，共得2組數(shù)據(jù)。以2份低稀釋級供試液菌落數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。10.4成果報(bào)告10.10.10.5復(fù)試供試品細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)其中任一項(xiàng)一次檢查不合格，應(yīng)從同一批樣品中隨機(jī)重新取2倍包裝量的供試品，依法作單項(xiàng)復(fù)試兩次，以三次檢查成果的均值報(bào)告。若3次成果的平均值超出該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定；否則，判供試品符合規(guī)定。10.6注意事項(xiàng)10.表3不同程度原則宜采用的供試液稀釋級及對應(yīng)宜采用的計(jì)數(shù)測定辦法程度原則cfu∕g，ml，10cm2普通2～3個(gè)供試液稀釋級對應(yīng)宜選用的計(jì)數(shù)測定辦法原液1:10（－1）1:102（－2）1:103（－3）1:104（－4）＜10■■10●■■100●▲■●■■1000●▲■●■■■10000●▲●▲■●■●■100000●▲●▲●：平皿法（供試液體積：1ml∕皿）；▲：平皿法（培養(yǎng)基稀釋法供試液體積：＜1ml∕皿）；■：薄膜過濾法（供試液體積能夠比較靈活）。10.10.610.610.10.6.5.110.6.510.6.5.3加TTC于傾注培養(yǎng)基前，在每1000ml營養(yǎng)瓊脂內(nèi)加入滅菌1％TTC溶液1ml（最后濃度為011檢查報(bào)告書寫本品按《中國藥典》微生物程度檢查法原則檢查，成果符合或不符合規(guī)定。表4細(xì)菌、霉菌、酵母菌形態(tài)特性比較（營養(yǎng)瓊脂及玫瑰紅鈉瓊脂平板）菌落形態(tài)細(xì)菌霉菌酵母菌菌落大小差別很大，在同一平板上可出現(xiàn)針尖大小至不不大于10mm菌落普通較大，亦有細(xì)小的菌落。在同一平板上生長的菌落大小有時(shí)不一致多數(shù)直徑為1～2mm，在同一平板上生長的菌落大小有時(shí)不一致外觀形態(tài)多樣，小而突起或大而扁平多為圓形，有的蔓延生長為無定形培養(yǎng)基表面生長者多為圓形，內(nèi)層生長者為圓形、鐵餅、紡錘或三角形色澤白、灰白或無色，亦有淡褐、淡黃及淡紅色，菌落正背面顏色相似小菌落灰白，大菌落形成孢子后顏色多樣。菌落正背面顏色不同乳白或粉紅色多見，在同一平板上色調(diào)較單一透明度透明或不透明小菌落半透明有明顯折光性，大菌落不透明透明較差邊沿整潔或不整潔。有放射線狀、樹枝狀、鋸齒狀、卷發(fā)狀。低倍鏡下普通見不到邊沿菌絲體構(gòu)成，多呈放射狀整潔、低倍下可見球狀．卵圓狀或假菌絲狀．細(xì)胞細(xì)密排列氣味普通有臭味往往有霉味多帶酒香味與培養(yǎng)基結(jié)合不結(jié)合結(jié)合較牢固，不易挑起不結(jié)合，易挑起生長速度普通很快較慢較快細(xì)胞形態(tài)球或桿狀，細(xì)小均一。高倍鏡或油鏡下可觀察形態(tài)菌絲體互相交錯(cuò)．成熟霉菌常有產(chǎn)孢組織及孢子多數(shù)為圓或卵圓形，常有芽體相連排列單個(gè)、分散或有一定的排列方式絲狀交錯(cuò)單個(gè)分散二、控制菌檢查l簡述控制菌檢查是用于檢查某些特定微生物（控制菌或其它致病菌），規(guī)定按一次檢出成果為準(zhǔn)，不再復(fù)試。由于控制菌檢查為一次性報(bào)告實(shí)驗(yàn)成果，故應(yīng)注意辦法的有效性確證（辦法驗(yàn)證或陽性對照）、實(shí)驗(yàn)過程保障和成果確證，以提高檢查成果的可靠性。既要避免漏檢造成的假陰性成果。也要避免實(shí)驗(yàn)室污染造成的假陽性成果。控制菌檢查中，涉及實(shí)驗(yàn)室監(jiān)控菌株的分離鑒定、樣品陽性菌株的分離分析、辦法驗(yàn)證明驗(yàn)中的陽性菌操作等，應(yīng)在專門的陽性菌實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。除另有規(guī)定外，陽性菌實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合國家Ⅱ級生物安全原則，陽性菌實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備生物安全柜。陽性菌操作不得在供試品檢查用干凈實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。2辦法驗(yàn)證在建立供試品的控制菌檢查法或原檢查法的檢查條件發(fā)生變化可能影響檢查成果的精確性時(shí)，應(yīng)對供試品的抑菌活性及檢查法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)．按各供試品微生物程度項(xiàng)下的規(guī)定（給藥途徑）選擇對應(yīng)的菌株，并按供試液的制備和控制菌檢查法所規(guī)定的辦法進(jìn)行。2.1儀器、設(shè)備及用品見各控制菌檢查項(xiàng)下。2.2試液、批示液見各控制菌檢查項(xiàng)下。2.3培養(yǎng)基見各控制菌檢查項(xiàng)下。2.4辦法驗(yàn)證用原則菌株應(yīng)根據(jù)具體品種項(xiàng)下的目的控制菌選擇對應(yīng)的驗(yàn)證用原則菌株，慣用目的控制菌的原則菌株以下：大腸埃希菌Escherichiacoli[CMCC(B)44102]金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus[CMCC(B)26003]乙型副傷寒沙門菌SalmonellaparatyphiB[CMCC(B)50094]銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa[CMCC(B)10104]生孢梭菌Clostridiumsporogenes[CMCC(B)64941]白色念珠菌Candidaalbicans[CMCC(F)98001]菌液制備取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌培養(yǎng)物少量，接種至l0ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置30～35℃培養(yǎng)18～24h，取均勻培養(yǎng)物1ml，用0.9％無菌氯化鈉溶液稀釋成每1ml含菌10～100cfu的菌懸液，其菌數(shù)在做對照實(shí)驗(yàn)的同時(shí)用營養(yǎng)瓊脂注皿或平板涂布，經(jīng)培養(yǎng)后計(jì)數(shù)擬定。生孢梭菌接種至12ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，置30～35℃培養(yǎng)18～24h，用0.9％無菌氯化鈉溶液制成1ml含10～100cfu的菌液。2.5供試液的制備（見細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)）2.6驗(yàn)證辦法2.6.1實(shí)驗(yàn)組取規(guī)定量供試液和2.6.2陽性對照取2.2.7成果鑒定陽性對照組應(yīng)檢出實(shí)驗(yàn)菌，陰性對照組應(yīng)無菌生長。若實(shí)驗(yàn)組檢出實(shí)驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查；若實(shí)驗(yàn)組未檢出實(shí)驗(yàn)菌，應(yīng)建立新的辦法，消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。驗(yàn)證明驗(yàn)可與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行。（一）大腸埃希菌1簡述大腸埃希菌（Escherichiacoli）即大腸桿菌，為腸桿菌科埃希菌屬的模式種。埃希菌屬除大腸埃希菌外，新近發(fā)現(xiàn)有非脫羧埃希菌等5個(gè)種。大腸埃希菌是人和溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)的棲居菌，隨糞便排出體外。在藥品中檢出大腸埃希菌。表明該樣品受到人和溫血?jiǎng)游锏募S便污染，即可能污染腸道病原體。大腸埃希菌除普通大腸埃希菌外尚有致病性大腸埃希菌，可引發(fā)嬰幼兒、成人暴發(fā)性腹瀉。為保汪人體健康，口服藥品必須檢查大腸埃希菌。用4-甲基傘形酮葡糖苷酸（4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG）和靛基質(zhì)（indole）實(shí)驗(yàn)檢查大腸埃希菌是一項(xiàng)新技術(shù)，其檢查環(huán)節(jié)為：增菌培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)種MUG蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，多數(shù)狀況下不需要從混合菌中分離單個(gè)菌，如MUG、Indole實(shí)驗(yàn)為陽性或陰性即可報(bào)告成果。原理：運(yùn)用目的菌限定酶作用的底物的水解產(chǎn)物，產(chǎn)生顏色或熒光反映作為批示系統(tǒng)來鑒定目的菌。實(shí)驗(yàn)證明96％的大腸埃希菌含β-葡糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUD)，約10％的沙門菌屬某些菌種也含有此酶。MUG被GUD水解，產(chǎn)生熒光，由于熒光反映的敏感度較顏色反映強(qiáng)千萬倍，易于觀察，沒有主觀性，因而用MUG鑒定大腸埃希菌已被廣泛應(yīng)用于臨床、食品、飲水、污水等的檢測。單一的MUG鑒別大腸埃希菌其漏檢率達(dá)6％，鑒于98％的大腸埃希菌基靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)為陽性，故將MUG與靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)結(jié)合，比單用MUG可提高大腸埃希菌的檢出率。如MUG與Indole實(shí)驗(yàn)的反映不一致時(shí)，則需將供試液的增菌培養(yǎng)物用EMB瓊脂平板分離培養(yǎng)、革蘭染色、鏡檢及生化實(shí)驗(yàn)鑒別。該法理論上可使大腸埃希菌的檢出率達(dá)98％。如僅用IMViC生化實(shí)驗(yàn)來鑒別大腸埃希菌屬中的大腸埃希菌，專屬性不強(qiáng)。2儀器、設(shè)備及用品（參考細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)）3試液批示液3.10.9％無菌氯化鈉溶液（附件二3.1）3.2無菌磷酸鹽緩沖溶液（pH7.2）（附件二3.3)3.3無菌對氨基苯甲酸溶液（附件二2.2）3.4無菌聚山梨酯80氯化鈉溶液（附件二3.2）3.5靛基質(zhì)試液（附件二2.17）3.6甲基紅試液（附件二4.2）3.7V-P試液（附件二2.11，2.13）3.8革蘭染色液（附件二2.4，2.10，2.16）3.9中性紅批示液（附件二4.1）3.10亞甲藍(lán)批示液（附件二4.3）3.11溴麝香草酚藍(lán)批示液（附件二4.6）3.12酸性品紅批示液（附件二4.7）3.13曙紅鈉批示液（附件二4.9）4培養(yǎng)基4.1營養(yǎng)肉湯（附件二5.1）4.2營養(yǎng)瓊脂（附件二5.2）4.3膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基（附件二5.6）4.44－甲基傘形酮葡糖苷酸蛋白胨培養(yǎng)基（附件二5.7）4.5乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、5％乳糖培養(yǎng)基（附件二5.21，5.22）4.6蛋白胨水培養(yǎng)基（附件二5.18）4.7磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基（附件二5.19）4.8枸櫞酸鹽培養(yǎng)基（附件二5.20）4.9曙紅亞甲藍(lán)（EMB）瓊脂（附件二5.8）4.10麥康凱瓊脂（附件二5.9）5準(zhǔn)備5.1對照用菌液（見辦法驗(yàn)證）5.2供試品的檢查量（見細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)5.3）5.3供試液的制備（見細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)）6操作環(huán)節(jié)6.1檢查程序陽性對照實(shí)驗(yàn)供試品進(jìn)行控制菌檢查時(shí)，應(yīng)做陽性對照實(shí)驗(yàn)。陽性對照實(shí)驗(yàn)的加菌量為10～100cfu，供試品和增菌培養(yǎng)基用量及檢查按供試品的控制菌檢查。陽性對照實(shí)驗(yàn)應(yīng)檢出對應(yīng)的控制菌。陰性對照實(shí)驗(yàn)取稀釋劑10m1加入100ml（或200m1）對應(yīng)控制菌檢查用的增菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，應(yīng)無菌生長。6.2增菌培養(yǎng)取膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基3瓶，每瓶各100ml。2瓶分別加入規(guī)定量的供試液（相稱于供試品1g、lml、10cm2），其中1瓶加入對照菌10～100個(gè)作陽性對照，第3瓶加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對照。培養(yǎng)18～24h，必要時(shí)可延至48h。陰性對照應(yīng)無菌生長。取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5、24h在366nm紫外光下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。在紫外光下若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)藍(lán)白色熒光，為MUG陽性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對照的MUG和靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)應(yīng)為陰性。如MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。6.3分離培養(yǎng)如呈現(xiàn)MUG陽性、靛基質(zhì)陰性或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性時(shí)，應(yīng)將上述供試品BL增菌培養(yǎng)液輕輕搖動，以接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液劃線于EMB或麥康凱瓊脂平板上。培養(yǎng)18～24h。若平板上無菌落生長、或生長的菌落與表1所列的菌落形態(tài)特性不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。表1大腸埃希菌菌落形態(tài)特性培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂呈紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊沿整潔，表面光滑，濕潤，常有金屬光澤麥康凱瓊脂鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊沿整潔，表面光滑，濕潤當(dāng)陽性對照的平板呈典型菌落生長時(shí)，若EMB或麥康凱瓊脂平板上生長的菌落與表1所列菌落形態(tài)特性相符或疑似者，應(yīng)挑取可疑菌落進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和IMViC實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)與否為大腸埃希菌。為了規(guī)范操作，下列是對藥典規(guī)定的補(bǔ)充。6.4純培養(yǎng)如EMB或麥康凱瓊脂平板上生長的菌落與表1所列特性相符或疑似者，以接種針輕輕接觸單個(gè)疑似菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑選2～3個(gè)以上疑似菌落，分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)18～24h，作下列檢查。如平板上無單個(gè)可疑菌落，但有可疑菌團(tuán)（紫黑色，或有金屬光澤），應(yīng)沾取可疑菌團(tuán)培養(yǎng)物少量，或重新取增菌培養(yǎng)液劃線接種于EMB瓊脂平板，培養(yǎng)18～24h，再挑選單個(gè)疑似菌落，純培養(yǎng)，作下列檢查。6.5革蘭染色、鏡檢6.6.6.6.6.6.革蘭陽性菌呈藍(lán)紫色；革蘭陰性菌呈紅色。大腸埃希菌為革蘭陰性短桿菌，或球桿菌狀，亦有桿菌狀。6.6.5如菌液過濃，須再取干凈載玻片進(jìn)一步稀釋。6.5.76.5.77生化實(shí)驗(yàn)7.1乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)取上述斜面培養(yǎng)物，接種于乳糖發(fā)酵管，培養(yǎng)24～48h，觀察產(chǎn)酸（批示劑為酸性品紅者為紅色；批示劑為溴麝香草酚藍(lán)者為黃色），產(chǎn)氣（小倒管內(nèi)有氣泡，氣泡無論大小都是產(chǎn)氣）。為避免緩慢發(fā)酵乳糖產(chǎn)生假陰性，亦可接種5％乳糖發(fā)酵管。絕大多數(shù)緩慢發(fā)酵乳糖的細(xì)菌，可于24h出現(xiàn)陽性。或合適延長培養(yǎng)時(shí)間。7.2靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)（Ⅰ）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48h，沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，輕輕搖動試管，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。98％的大腸埃希菌靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)為陽性。普通24h即可出現(xiàn)陽性成果，以無菌操作先從管中取出1或2ml培養(yǎng)液進(jìn)行檢查，如靛基質(zhì)是陰性，余下的蛋白胨水培養(yǎng)物再培養(yǎng)24h，作靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)。7.3甲基紅實(shí)驗(yàn)（M）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2h，于培養(yǎng)液中加入甲基紅批示液2～3滴（約每ml培養(yǎng)液加批示液1滴），輕微搖動，立刻觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈黃色為陰性。7.4乙酰甲基甲醇生成實(shí)驗(yàn)（V-P）取上述斜面培養(yǎng)物。接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2h，于2ml培養(yǎng)液中加入α-萘酚乙醇試液1ml，混勻，再加40％氫氧化鉀試液0.4ml，充足振搖，在4h（普通在30min）內(nèi)出現(xiàn)紅色應(yīng)判為陽性，無紅色反映為陰性。7.5枸櫞酸鹽運(yùn)用實(shí)驗(yàn)（C）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)2～4天，培養(yǎng)基斜面有菌苔生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)為陽性，培養(yǎng)基顏色無變化、無菌生長為陰性。8成果判斷8.1當(dāng)陰性對照實(shí)驗(yàn)呈陰性，陽性對照實(shí)驗(yàn)MUG呈陽性，供試品MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，報(bào)告1g或1ml供試品檢出大腸埃希菌。MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出大腸埃希菌。8.2MUG陽性、靛基質(zhì)陰性、IMViC實(shí)驗(yàn)為－＋――、革蘭陰性桿菌，報(bào)告1g或1ml供試品檢出大腸埃希菌；MUG陰性、靛基質(zhì)陽性、IMViC實(shí)驗(yàn)為＋＋――、革蘭陰性桿菌，報(bào)告1g或1ml供試品檢出大腸埃希菌。8.3供試品培養(yǎng)物檢查不符合8.2二項(xiàng)中的任一項(xiàng)，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出大腸埃希菌。8.4當(dāng)陰性對照有菌生長或陽性對照未生長或生長菌落不是大腸埃希菌，不能做出檢查報(bào)告。9注意事項(xiàng)9.1MUG法不必從混合菌中分離單個(gè)菌落。除大腸埃希菌外，尚有部分志賀菌屬、沙門菌屬的菌株；以及少數(shù)革蘭陽性球菌、桿菌和芽孢菌，其MUG為陽性。因此，在MUG培養(yǎng)基成分中增加了去氧膽酸鈉的量，可排除革蘭陽性菌的干擾。在膽鹽乳糖培養(yǎng)基中志賀菌、沙門菌較難生長。9.2配制MUG培養(yǎng)基時(shí)，務(wù)必校正pH值，滅菌后pH不得過7.4，否則pH值偏高，MUG分解，本身則顯熒光；分裝MUG培養(yǎng)基的試管應(yīng)挑選，試管、蛋白胨不得顯熒光。9.3培養(yǎng)時(shí)間供試品培養(yǎng)液接種于MUG培養(yǎng)基中，普通培養(yǎng)5h和24h要觀察與否產(chǎn)生熒光，如熒光很微弱，不能精確判斷時(shí)，可延長培養(yǎng)至48h再觀察成果。由于大腸埃希菌各菌株間的GUD的活性不完全相似，對底物和底物的濃度反映的差別；培養(yǎng)基中選擇因子的影響；培養(yǎng)時(shí)問、溫度；pH值的變化；大量競爭菌和樣品本身物質(zhì)成分的干擾等，對成果的判斷亦有影響。9.4成果觀察取供試品的MUG實(shí)驗(yàn)管、陽性對照管、陰性對照管同時(shí)在366nm紫外光燈下觀察，陽性對照管應(yīng)有較強(qiáng)的藍(lán)白色熒光，陰性對照管無熒光。供試品MUG管與否有熒光，應(yīng)認(rèn)真觀察比較，或?qū)⒏鞴苷{(diào)換位置（陰性管居中），合適傾斜試管。如陽性對照管熒光強(qiáng)烈，影響供試品管與陰性對照管的觀察時(shí)，亦可移去陽性對照管。9.5藥品中污染的大腸埃希菌，易受生產(chǎn)工藝及藥品的影響。在曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊脂平板上的菌落形態(tài)特性時(shí)有變化，挑取可疑菌落往往憑經(jīng)驗(yàn)，主觀性較大，務(wù)必挑選2～3個(gè)以上菌落分別做IMViC實(shí)驗(yàn)鑒別，挑選菌落越多，檢出陽性菌的機(jī)率越高，如僅挑選一種菌落做IMViC實(shí)驗(yàn)鑒別．則易漏檢。9.6在IMViC實(shí)驗(yàn)中，以滅菌接種針沾取菌苔，首先接種于枸櫞酸鹽瓊脂斜面上，然后接種于蛋白胨水培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中。切勿將培養(yǎng)基帶入枸櫞酸鹽瓊脂斜面上，以免產(chǎn)生假陽性成果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)資料，發(fā)現(xiàn)某些菌培養(yǎng)3天后，構(gòu)櫞酸鹽運(yùn)用實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生陽性，故僅培養(yǎng)2天是不夠的，枸櫞酸鹽運(yùn)用實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間可延長至4天。9.7以IMViC實(shí)驗(yàn)來判斷大腸埃希菌屬中的大腸埃希菌是含混的。IMViC實(shí)驗(yàn)為＋＋――者，除大腸埃希菌外，尚有非活躍大腸埃希菌（E.colijnactive）、弗格森埃希菌（E.fergusonii）、赫爾曼埃希菌（E.hermanii）。IMViC實(shí)驗(yàn)為－＋――者，除大腸埃希菌外，尚有非活躍大腸埃希菌（E.coliinactive）、傷口埃希菌（E.vulneris）、蟑螂埃希菌（E.blattae）。9.8陽性對照實(shí)驗(yàn)是檢查供試品與否有抑菌作用及培養(yǎng)條件與否適宜。陽性對照菌液的制備、計(jì)數(shù)及加入含供試品的培養(yǎng)基中檔操作，不能在檢測供試品的干凈實(shí)驗(yàn)室或凈化臺上進(jìn)行，必須在單獨(dú)的隔離間或凈化臺操作，以免污染供試品及操作環(huán)境。9.9在各類供試品中檢測大腸埃希菌及其它控制菌，按一次檢出成果為準(zhǔn)，不再抽樣復(fù)驗(yàn)。檢出的大腸埃希菌及其它控制菌培養(yǎng)物須保存1個(gè)月，備查。（二）大腸菌群1簡述大腸菌群（Coliform）是指37℃生長時(shí)能發(fā)酵乳糖，在24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭陰性無芽孢桿菌。符合上述定義的細(xì)菌除大腸埃希菌屬（Escherichia）的多數(shù)菌外，還涉及腸桿菌科的腸桿菌屬（Enterobacter）、枸櫞酸菌屬（Citrobacter）、克雷伯菌屬（Klebsiella大腸菌群的檢查通過增菌、分離、革蘭染色、鏡檢和確證明驗(yàn)等環(huán)節(jié)。2儀器、設(shè)備及用品（見大腸埃希菌檢查法）3試液、批示液（見大腸埃希茵檢查法）4培養(yǎng)基4.1乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基（附件二5.21）4.2乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基（附件二5.22）4.3曙紅亞甲藍(lán)（EMB）瓊脂（附錄5.8）4.4麥康凱瓊脂（附錄5.9）5對照用菌液（大腸埃希菌，同控制菌辦法驗(yàn)證2.4）6操作環(huán)節(jié)6.1操作程序6.2增菌培養(yǎng)取乳糖膽鹽發(fā)酵管3支，分別加入1:10稀釋的供試液1ml（含供試品0.1g或0.1m1)、1:100稀釋的供試液1ml（含供試品0.01g或0.01ml）和1:1000稀釋的供試液1ml（含供試品0加供試液的乳糖膽鹽發(fā)酵管若無菌生長、或有菌生長但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則判該管未檢出大腸菌群。若乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應(yīng)進(jìn)一步分離培養(yǎng)。6.3分離培養(yǎng)將上述產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管中的培養(yǎng)物，分別劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24h。大腸菌群的菌落在曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基平板上呈紫黑色或紫紅色，圓形，稍凸起，邊沿整潔，表面光滑，濕潤；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上呈鮮桃紅色或粉紅色，圓形，扁平，邊沿整潔，表面光滑，濕潤。若平板上無菌落生長，或生長的菌落與上述菌落特性不符或?yàn)榉歉锾m陰性無芽孢桿菌，判該管未檢出大腸菌群；若平板上生長有疑似菌落，且為革蘭陰性無芽孢桿菌，應(yīng)進(jìn)行確證明驗(yàn)。6.4確證明驗(yàn)從上述分離平板上挑選4～5個(gè)疑似菌落，分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)24～48小時(shí)。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該乳糖膽鹽發(fā)酵管檢出大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。6.5成果判斷根據(jù)大腸菌群的檢出管數(shù)，按表2報(bào)告1g或1ml供試品中的大腸菌群數(shù)。表2大腸菌群MPN（Mostprobablenumber）表各供試品量的檢出成果最可能的大腸菌群數(shù)N（個(gè)∕g或ml）1.0g或10.1g或00.01g或0＋＋＋＞102＋＋－10＜N＜102＋－－1＜N＜10－－－＜1注：＋檢出大腸菌群。－未檢出大腸菌7注意事項(xiàng)7.1加供試液的乳糖膽鹽發(fā)酵管，由于有的藥渣顏色較深或沉淀物較多，干擾成果的觀察。應(yīng)認(rèn)真觀察倒管底部或試管壁、培養(yǎng)液表面有無氣泡。針尖大的氣泡也是產(chǎn)氣。7.2乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)的倒管不不大于30mm×3mm（內(nèi)徑）。否則，倒管被藥渣遮擋，不便觀察成果。7.3加供試液的乳糖膽鹽發(fā)酵管，經(jīng)培養(yǎng)后，其倒管內(nèi)無論產(chǎn)氣多少，均應(yīng)做分離培養(yǎng)，革蘭染色、鏡檢。如產(chǎn)氣太少，可延長培養(yǎng)時(shí)間。7.5盡量多挑選曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上大腸菌群的可疑菌落，做乳糖發(fā)酵確證明驗(yàn)。挑可疑菌落越多，可提高大腸菌群檢出率。（三）沙門菌1簡述沙門菌屬是腸桿菌科的重要致病菌，按《Bergey系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》第一卷（1984），沙門菌分5個(gè)亞屬，出版的第八版的《臨床微生物手冊》將沙門菌屬分成兩個(gè)菌種及腸炎沙門菌和乍得沙門菌，其中的腸炎沙門菌分6個(gè)亞屬，涉及常見的傷寒、甲型副傷寒、乙型副傷寒、丙型副傷寒、鼠傷寒，豬霍亂等沙門菌在內(nèi)，當(dāng)時(shí)已發(fā)現(xiàn)2501個(gè)血清型。O抗原抗血清的A-E群包含了沙門菌分離株的95％，因此用沙門菌A-FO多價(jià)血清進(jìn)行沙門菌初篩實(shí)驗(yàn)。藥品中的沙門菌，是以鑒定沙門菌屬為準(zhǔn)，即對每10g（或10m1）藥品中與否檢出沙門菌作出檢查報(bào)告。由于沙門菌血清型繁多，各血清型的生化及血清學(xué)特性雖親密有關(guān)，卻不盡相似，采用一種增菌培養(yǎng)基和兩種分離培養(yǎng)基，不可能涵蓋全部沙門菌的最適增菌及分離條件。另外，由于藥品在生產(chǎn)過程中，常受到加熱、干燥等加工環(huán)節(jié)的影響，藥品中污染的沙門菌可受到損傷或呈休眠狀態(tài)，故須在增菌培養(yǎng)前先進(jìn)行預(yù)增菌，然后再進(jìn)行增菌及分離、三糖鐵瓊脂初步鑒別、生化實(shí)驗(yàn)、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)等環(huán)節(jié)。2儀器、設(shè)備及用品（見大腸埃希菌檢查法2）3試液批示液（參見大腸埃希菌檢查法3）3.1無菌脲試液（附件二2.5）3.2酚磺酞批示液（附件二4.4）3.3亮綠試液（附件二2.9）3.4氰化鉀試液（附件二2.14）3.5溴甲酚紫批示液（附件二4.5）3.6革蘭染色液（附件二2.4，2.10，2.16）3.7沙門菌屬A～F“0”4培養(yǎng)基4.1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.2）4.2營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（附件二5.1）4.3半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.3）4.4曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）（附件二5.8）4.5麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacC）（附件二5.9）4.6四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（TTB）（附件二5.11）4.7三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（TSI）（附件二5.10）4.8膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基（DHL）（附件二5.13）4.9沙門菌扁志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（S.S）（附件二5.12）4.10蛋白胨水培養(yǎng)基（附件二5.18）4.11脲（尿素）瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.23）4.12氰化鉀培養(yǎng)基（附件二5.24）4.13賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基（附件二5.25）5對照用菌液取乙型副傷寒沙門菌[CMCC(B)50094]的培養(yǎng)物少量，接種至10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)。30～35℃培養(yǎng)18～24h后，用0.9％無菌氯化鈉溶液按10倍遞增稀釋濃度相稱于10～100cfu∕6操作辦法6.1準(zhǔn)備工作：[見細(xì)菌、霉菌（酵母菌）計(jì)數(shù)6]6.2增菌培養(yǎng)6.2.1預(yù)增菌取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基3份，每份200ml，1份加入10g或者10ml供試品，混勻；1份加入供試品及陽性對照菌10～100c6.2.2增菌培養(yǎng)輕微搖動供試品增菌培養(yǎng)瓶及陽性對照瓶，分別吸取6.3分離培養(yǎng)輕微搖動供試品增菌培養(yǎng)瓶及陽性對照瓶，分別以接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液接種于膽鹽硫乳瓊脂（DHL）或沙門菌志賀菌瓊脂（SS）平板及曙紅亞甲藍(lán)（EMB）瓊脂或麥康凱瓊脂平板各1個(gè)，倒置培養(yǎng)24～48h，必要時(shí)延長至40～48h。檢查平板上有無疑似沙門菌菌落。沙門菌在上述平板上的菌落形態(tài)特性見下表。表3沙門菌的菌落特性平板菌落形態(tài)膽鹽硫乳瓊脂（DHL）無色至淺橙色．半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色沙門菌屬志賀菌屬瓊脂（S.S）無色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時(shí)帶黑褐色曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB）無色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤的圓形菌落麥康凱瓊脂（MacC）無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時(shí)為暗色由于沙門菌不發(fā)酵乳糖和蔗糖，不產(chǎn)酸，菌落不著色，普通為無色半透明，多數(shù)沙門菌因產(chǎn)生H2S，菌落中心呈現(xiàn)黑色甚至全黑色，在DHL瓊脂平板上較為明顯。在SS瓊脂平板上，H2S特性有時(shí)不明顯，沙門菌屬亞屬=3\*ROMANIII因多數(shù)菌株發(fā)酵乳糖，故在上述平板上的乳糖發(fā)酵菌落呈現(xiàn)粉紅或紫色，但由于產(chǎn)生H2S，在有H2S批示系統(tǒng)的平板上仍出現(xiàn)黑色中心。在上述培養(yǎng)基上，有些非沙門菌屬細(xì)菌，也可呈現(xiàn)類似沙門菌菌落形態(tài)，須進(jìn)一步鑒別。由于藥品的影響或非典型菌株的存在，沙門菌菌落可呈現(xiàn)非典型形態(tài)，如色澤變深，菌落粗糙等，應(yīng)注意分辨。6.4初步鑒別實(shí)驗(yàn)從每個(gè)供試品的分離平板上挑取2～3個(gè)疑似菌落（菌落形態(tài)特性與表3所列的形態(tài)特性相符或疑似）分別接種于三糖鐵瓊脂斜面，接種時(shí)應(yīng)以接種針輕輕接觸單個(gè)菌落中心部位，沾取培養(yǎng)物劃線于三糖鐵瓊脂斜面（或者克氏雙糖鐵瓊脂斜面）并穿刺究竟層或先穿刺底層再劃線斜面，培養(yǎng)18～24h，觀察成果。疑似沙門菌在三糖鐵瓊脂斜面上的反映為：①斜面紅色（產(chǎn)堿），底層黑色（產(chǎn)H2S）并顯示黃色（產(chǎn)酸）；②斜面紅色，底層黃色；③斜面黃色，底層黑色，并顯示黃色。多數(shù)沙門菌在三糖鐵瓊脂上產(chǎn)憤怒體，使底層瓊脂出現(xiàn)氣泡或使瓊脂斷裂，但也有不產(chǎn)憤怒體的菌種。對在三糖鐵瓊脂斜面黃色并同時(shí)底層無黑色，斜面未見紅色底層未見黃色，或斜面及底層均為紅色者能夠排除沙門菌。將疑似沙門菌的三糖鐵瓊脂或營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作生化實(shí)驗(yàn)，血清凝集實(shí)驗(yàn)及革蘭染色，鏡檢。沙門菌應(yīng)為革蘭陰性桿菌。6.5生化實(shí)驗(yàn)6.5.1靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)6.5.2脲酶實(shí)驗(yàn)6.5.3氰化鉀實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)物先接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～24h，用接種環(huán)沾取培養(yǎng)液1環(huán)，接種至氰化鉀培養(yǎng)基內(nèi)，另取一環(huán)培養(yǎng)液接種于不含氰化鉀的同樣培養(yǎng)基內(nèi)作對照管，接種后即以橡膠塞塞緊，培養(yǎng)24～48h，觀察成果。對照管內(nèi)有菌生長（混濁），而實(shí)驗(yàn)管也有菌生長為陽性反映；對照管有菌生長（混濁）而實(shí)驗(yàn)管無菌生長（清亮本實(shí)驗(yàn)應(yīng)十分注意密封管口，夏天分裝培養(yǎng)基宜在冰浴中進(jìn)行，避免氰化鉀分解，產(chǎn)生氫氰酸逸出，致使培養(yǎng)基內(nèi)氰化鉀濃度減少，不能克制細(xì)菌生長，造成假陽性。氰化鉀為劇毒品、操作時(shí)須謹(jǐn)慎，切勿用口吸液。用后的培養(yǎng)基每管加數(shù)粒硫酸亞鐵和20％氫氧化鉀0.5ml去毒。然后再滅菌、洗滌。6.6.表4沙門菌與有關(guān)細(xì)菌在三糖鐵瓊脂及初步生化實(shí)驗(yàn)的鑒別序號靛基質(zhì)脲酶氰化鉀賴氨酸脫羧酶鑒定菌屬斜面底層產(chǎn)氣硫化氫1.1－＋＋／－＋／－－－－＋沙門菌屬1.2＋／－＋＋＋－－－＋沙門菌屬=3\*ROMANIII2－＋＋／－＋＋－－＋緩慢愛德華菌屬3＋／－－＋／－＋／－－／＋－／＋＋／－－弗勞地檸檬酸桿菌4.1－＋＋S＋－＋＋－奇異變形桿菌4.2－＋＋／－S＋＋＋＋－普通變形桿菌5＋／－＋＋／－－＋／－－－＋／－大腸埃希菌6－＋－－－／＋－－－志賀菌屬7.1＋＋＋－－＋／－＋－陰溝腸桿菌7.2＋＋＋－－＋／－＋＋肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌8－＋＋S／－－＋＋／－＋－普羅菲登斯菌屬、摩根菌屬9－＋＋／－－－－／＋＋＋蜂房哈夫尼亞菌、黏質(zhì)沙雷菌針對三糖鐵瓊脂上的反映，＋產(chǎn)酸（黃色），陽性，陽性率，＞90％；－產(chǎn)堿（紅色），陰性，陰性率，＞90％；＋／－多數(shù)陽性、少數(shù)陰性；＋S產(chǎn)生少量氣體；生化實(shí)驗(yàn)的成果參見本章6.5內(nèi)容；＋陽性，陽性率，＞90％；－陰性，陰性率，＞90％；＋／－多數(shù)陽性、少數(shù)陰性，－／＋多數(shù)陰性、少數(shù)陽性（本表根據(jù)何曉青衛(wèi)生防疫細(xì)菌檢查，參考第八版《美國臨床微生物手冊》，反映序號1除典型反映外，脲酶、氰化鉀實(shí)驗(yàn)、賴氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)三項(xiàng)中有一項(xiàng)異常；反映序號2僅靛基質(zhì)陽性；可結(jié)合血清學(xué)凝集實(shí)驗(yàn)，或加做部分生化實(shí)驗(yàn)，鑒定與否為沙門菌，其它狀況可排除沙門菌。6.6血清學(xué)凝集實(shí)驗(yàn)6.6.1準(zhǔn)備1片干凈的滅菌載玻片，在近中央的一端，以直徑3mm接種環(huán)沾取沙門菌屬0多價(jià)1血清2～3環(huán)制成與玻片橫徑相垂直的條形涂抹，長約6.66.6.3將玻片前后傾斜多次，以暗色背景襯底，在良好的照明條件下進(jìn)行觀察，陰性對照不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)組任何程度的凝集現(xiàn)象都是陽性反映。陽性反映普通在3min內(nèi)發(fā)生6.7成果判斷7.1供試品培養(yǎng)物為革蘭陰性桿菌，三糖鐵瓊脂反映及生化反映符合沙門菌屬反映，沙門菌屬0多價(jià)1血清凝集實(shí)驗(yàn)陽性反映（含待檢培養(yǎng)物經(jīng)l00℃30min解決后凝集實(shí)驗(yàn)為陽性反映），報(bào)告10g7.2供試品培養(yǎng)物三糖鐵瓊脂反映或生化反映不符合沙門菌屬反映及沙門菌屬0多價(jià)1血清凝集實(shí)驗(yàn)為陰性反映（含待檢培養(yǎng)物經(jīng)100℃30min解決后凝集實(shí)驗(yàn)為陰性反映），報(bào)告1g7.3供試品培養(yǎng)物出現(xiàn)下列狀況應(yīng)繼續(xù)鑒定或保存菌種送交有關(guān)單位進(jìn)一步鑒定后，再作報(bào)告。7.7.7.4對已檢出沙門菌的供試品分離菌種，有條件者，應(yīng)進(jìn)一步作菌型鑒定。根據(jù)檢出菌的特性，推斷可能菌型，增加生化實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目及沙門菌單因子血清“O”及“H”凝集實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定。8注意事項(xiàng)8.1實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基，需通過質(zhì)量鑒定，用已知典型反映菌株（如乙型副傷寒沙門菌[CMCC(B)50094]進(jìn)行測試，其敏捷度及特性性反映應(yīng)符合規(guī)定。培養(yǎng)基需在規(guī)定條件保存，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)使用。分離平板在使用前應(yīng)置30～35℃8.2在對供試品進(jìn)行測試的同時(shí)，需做陽性菌對照及陰性對照。陰性對照應(yīng)無菌生長，陽性對照應(yīng)顯示陽性成果，否則檢查成果無效。在進(jìn)行陽性菌對照實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)與供試品檢查分開操作，避免污染。特別是用接種環(huán)沾取菌液進(jìn)行接種或分離時(shí)，避免動作過大，形成氣溶膠，污染供試品檢查用品及操作環(huán)境。8.3為確保明驗(yàn)辦法的可靠性，對分離平板上的疑似菌落，應(yīng)多選用幾個(gè)菌落同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。挑取菌落時(shí)，不要在分離平板菌落密集部位挑取可疑菌落，而應(yīng)在菌落分布稀疏部位挑選。8.4生化實(shí)驗(yàn)及血清學(xué)實(shí)驗(yàn)的被鑒定培養(yǎng)物必須是純培養(yǎng)物，否則，不可能得到對的成果。如遇血清學(xué)凝集實(shí)驗(yàn)陽性而生化實(shí)驗(yàn)不符合時(shí)，應(yīng)首先檢查培養(yǎng)物的純度。對已污染的培養(yǎng)物，不應(yīng)丟棄，由于污染菌可能掩蓋沙門菌，故應(yīng)對被污染的培養(yǎng)物重新分離，認(rèn)真選用單個(gè)菌落再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。8.5全部生化反映均需按照規(guī)定的實(shí)驗(yàn)規(guī)定進(jìn)行，如觀察三糖鐵瓊脂斜面反映的時(shí)間，應(yīng)在24士2h，時(shí)間過短過長，都可能出現(xiàn)錯(cuò)誤成果判斷。又如氰化鉀實(shí)驗(yàn)，試管口應(yīng)密塞，否則氰化鉀濃度減少，致使抑菌作用下降，產(chǎn)生錯(cuò)誤的鑒定成果。8.6血清凝集實(shí)驗(yàn)的影響因素甚多，除與電解質(zhì)、pH、溫度有關(guān)外，須特別注意抗原與抗體用量的比例恰當(dāng)，只有當(dāng)兩者濃度合適時(shí)，凝集反映方明顯可見。由于本法實(shí)驗(yàn)用多價(jià)血清，其凝集力相對較弱，實(shí)驗(yàn)用菌液量切不能過大。測試前，應(yīng)用已知陽性菌測試以掌握適宜菌液濃度。8.7沙門菌為腸道重要致病菌，操作時(shí)應(yīng)特別注意避免分離待檢菌及陽性對照菌對操作環(huán)境及實(shí)驗(yàn)的污染。全部用過的增菌、分離、生化實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基、血清學(xué)凝集實(shí)驗(yàn)及染色鏡檢后的玻片等，均需經(jīng)滅菌后方能洗滌。（四）銅綠假單胞菌1簡述銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa），習(xí)稱綠膿桿菌，為假單胞菌屬菌種，廣泛分布在土壤，水及空氣，人和動物的皮膚、腸道、呼吸道都有存在，故可通過環(huán)境和生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)污染藥品。本菌是常見的化膿性感染菌、在燒傷、燙傷，眼科及其它外科疾患中常引發(fā)繼發(fā)感染，由于本菌對許多抗菌藥品含有天然的耐藥性，增加了治療的難度、國內(nèi)外藥典均將銅綠假單胞菌檢查列為檢查項(xiàng)目之一。銅綠假單胞菌按增菌、分離、純培養(yǎng)、革蘭染色鏡檢及生化實(shí)驗(yàn)等環(huán)節(jié)進(jìn)行檢查。2儀器、設(shè)備和用品（見大腸埃希茵檢查法2）3試液、批示液3.10.9%無菌氯化鈉溶液或磷酸鹽緩沖液（附件二3.1，3.3）3.21%二鹽酸二甲基對苯二胺試液（附件二2.1）3.3鹽酸試液（附件二2.12）3.4三氯甲烷（附件二1.57）4培養(yǎng)基4.1營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（附件二5.1）4.2膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基（附件二5.6）4.3營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.2）4.4溴代十六烷基三甲胺（附件二5.14）4.5綠膿菌素測定用培養(yǎng)基（PDP瓊脂）（附件二5.26）4.6明膠培養(yǎng)基（附件二5.27）4.7硝酸鹽胨水培養(yǎng)基（附件二5.28）5對照用菌液銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少量，接種至10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，于30～35℃培養(yǎng)18～24h后，用0.9％無菌氯化鈉溶液按10倍遞增稀釋濃度相稱于10～100個(gè)cfu／ml，作陽性對照用菌液。其菌液濃度可在做陽性對照實(shí)驗(yàn)的同時(shí)用平板菌落計(jì)數(shù)法測得。6操作辦法6.1供試品的取樣量[見細(xì)菌、霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)6]6.2供試液的制備[見細(xì)菌、霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)7]6.3增菌培養(yǎng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3份，每份100ml，1份加入1:10供試液10ml（相稱于供試品1g或1ml）；1份加入供試液及陽性對照菌；l份加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對照。于30～35℃培養(yǎng)18～24h（必要時(shí)可延至48h）6.4分離培養(yǎng)輕輕搖動上述增菌培養(yǎng)液，以接種環(huán)取1～2環(huán)培養(yǎng)液（如有菌膜應(yīng)挑取之），劃線接種于溴代十六烷基三甲胺瓊脂平板，于30～35℃培養(yǎng)18～24h。銅綠假單胞菌在該培養(yǎng)基平板上的典型菌落為扁平、圓形或無定形、邊沿不齊，光滑濕潤，呈灰白色，周邊略呈擴(kuò)散現(xiàn)象，在菌落相鄰處常有融合現(xiàn)象。菌落周邊常有水溶性藍(lán)綠色素?cái)U(kuò)散，使培養(yǎng)基顯藍(lán)綠色，但亦有不產(chǎn)色素的菌株。菌落尚有粗糙型和黏液型等，應(yīng)注意挑選。6.5純培養(yǎng)供試品分離平板生長6.4所述典型菌落或呈疑似菌落時(shí)，以接種針輕輕接觸單個(gè)菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑取2～3個(gè)疑似菌落，分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)，作下列檢查。6.6革蘭染色鏡檢6.6.1革蘭染色（6.6銅綠假單胞菌為革蘭陰性、無芽孢桿菌，單個(gè)，成對或成短鏈排列。6.7生化實(shí)驗(yàn)可用銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]做生化實(shí)驗(yàn)的陽性對照株。6.7取一小塊白色干凈的濾紙置平皿內(nèi)，以無菌玻璃棒挑取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少量，涂在濾紙上，隨即滴加1滴新配制的1％二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30s內(nèi)，紙片上的培養(yǎng)物出現(xiàn)粉紅色，逐步變?yōu)樽霞t色，即為氧化酶實(shí)驗(yàn)陽性反映。若培養(yǎng)物不變色或僅顯粉色為陰性反映。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)注意：（1）實(shí)驗(yàn)菌落（苔）必須新鮮，陳舊培養(yǎng)物反映成果不可靠。（2）實(shí)驗(yàn)避免與鐵、鎳等金屬接觸，不可用普通接種針（環(huán)）（白金材料除外）挑取菌（苔），否則易出現(xiàn)假陽性。宜用玻璃棒或木棒。（3）試劑宜新鮮配制，放置過久，二鹽酸二甲基對苯二胺氧化變色不可用。（4）反映需在有氧條件下進(jìn)行，勿滴加試劑過多，以免浸泡培養(yǎng)物使之與空氣隔絕，造成假陰性反映。（5）麥康凱、SS培養(yǎng)基等含糖培養(yǎng)基上的菌落不適于做氧化酶實(shí)驗(yàn)，由于糖分解產(chǎn)酸克制氧化酶活性。6.7取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于綠膿菌素測定用培養(yǎng)基（PDP）斜面上，30～35℃培養(yǎng)24h后，觀察斜面有無色素，如有色素，在試管內(nèi)加三氯甲烷3～5ml，以無菌玻棒攪碎培養(yǎng)基并充足振搖。使培養(yǎng)物中的色素完全萃取在三氯甲烷內(nèi)。靜置半晌，待三氯甲烷分層，用吸管將三氯甲烷移至另一試管中，加入鹽酸試液（1mol／L）約16.以接種環(huán)沾取少量營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，置30～35℃培養(yǎng)24h，觀察成果。如果在培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體產(chǎn)生，即為陽性反映，表明該培養(yǎng)物能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮?dú)?。小倒管?nèi)無氣泡者為陰性反映。6.7.以接種環(huán)沾取少量營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物于0.9％無菌氯化鈉溶液中，制成菌懸液。然后將菌懸液劃線接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，立刻置41℃士16.以接種針沾取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少量，穿刺接種于明膠培養(yǎng)基中，穿刺深度應(yīng)靠近培養(yǎng)基的底部，于30～35℃培養(yǎng)24h。取出放入0～4℃冰箱內(nèi)10～30min。如培養(yǎng)基呈溶液狀，即為明膠液化實(shí)驗(yàn)陽性反映；如明膠呈凝固狀，為陰性反映。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)注意：（1）本實(shí)驗(yàn)接種前，培養(yǎng)基應(yīng)為固態(tài)，否則需將培養(yǎng)基置冰箱內(nèi)使之凝固后，再穿刺接種。（2）實(shí)驗(yàn)應(yīng)同時(shí)設(shè)未接種細(xì)菌的陰性對照管，與實(shí)驗(yàn)管同時(shí)培養(yǎng)并觀察成果。7成果報(bào)告7.1供試品培養(yǎng)物經(jīng)證明為革蘭陰性桿菌，氧化酶實(shí)驗(yàn)及綠膿菌素實(shí)驗(yàn)皆為陽性者，即報(bào)告1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌。7.2供試品培養(yǎng)物氧化酶實(shí)驗(yàn)陽性，鏡檢為革蘭陰性桿菌的培養(yǎng)物，綠膿菌素實(shí)驗(yàn)陰性時(shí)，其硝酸鹽還原產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、42℃生長實(shí)驗(yàn)及明膠液化實(shí)驗(yàn)皆為陽性時(shí)，亦報(bào)告1g7.3凡與7.1與7.2成果不符時(shí)，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出銅綠假單胞茵。8注意事項(xiàng)8.1銅綠假單胞菌污染藥品后，因生產(chǎn)工藝和藥品的影響，在溴代十六烷基三甲胺平板上的菌落形態(tài)可產(chǎn)生非典型形態(tài)。為避免漏檢，在挑取疑似菌落時(shí)，宜取2～3個(gè)以上菌落，分別進(jìn)行檢查，以提高銅綠假單胞菌的檢出率。8.2綠膿菌素是銅綠假單胞菌鑒定的重要特性，但色素的產(chǎn)生受許多因素的影響，除菌株差別及變異外，培養(yǎng)條件是重要因素，溫度、培養(yǎng)基成分等皆可影響色素產(chǎn)生。培養(yǎng)基中瓊脂、蛋白胨等均應(yīng)事先測試，選用適宜品牌，實(shí)驗(yàn)時(shí)并用陽性菌株作對照實(shí)驗(yàn)。（五）金黃色葡萄球菌1簡述金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）為葡萄球菌屬中的一種，廣泛分布于自然界。空氣、土壤、水及物品上，人和動物皮膚及與外界相通的腔道中，也經(jīng)常有本菌存在。本菌可產(chǎn)生多個(gè)毒素及酶，這些毒性物質(zhì)能引發(fā)局部及全身化膿性炎癥，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展成為敗血癥和膿毒血癥，是人類化膿性感染中重要的病原菌。本菌抵抗力較強(qiáng)，干燥狀況下能生存數(shù)月，80℃30min的條件下尚能存活，5％石碳酸或0.金黃色葡萄球菌檢查按增菌、分離、純培養(yǎng)、革蘭染色鏡檢和血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)等環(huán)節(jié)進(jìn)行。本法合用于外用藥品及普通滴眼劑、眼膏劑的檢查。2儀器、設(shè)備及用品（見大腸埃希菌檢查法2）3試液、批示液3.10.9％無菌氯化鈉溶液或無菌磷酸鹽緩沖液（pH7.2）（附件二3.1，3.3）3.2革蘭染色液（附件二2.4，2.10，2.16）3.3無菌枸櫞酸鈉氯化鈉溶液（附件二2.7）3.4血漿的制備以無菌注射器吸取滅菌的含5％枸櫞酸鈉的0.9％的氯化鈉溶液1ml，用無菌操作采用家兔（或羊、人）血9ml，輕輕混勻數(shù)分鐘。待血液不凝固時(shí)，漸漸放入滅菌離心管中，離心（500r／min離心5min），分離血漿，用滅菌吸管將血漿轉(zhuǎn)移至滅菌試管中，置冰箱備用。臨用前必須用已知血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)陽性的金黃色葡萄球菌（如金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]）測試，證明血漿合格后，方可用于實(shí)驗(yàn)。3.51％酚磺酞批示液（附件二4.4）4培養(yǎng)基4.1營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（附件二5.1）4.2營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.2）4.3亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基（附件二5.15）4.4卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.16）4.5甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.17）5對照用菌液取金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少量，接種至10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24h，用0.9％無菌氯化鈉溶液按10倍遞增稀釋濃度相稱于10～100cfu／ml，作陽性對照用菌液。其菌液濃度可在做陽性對照實(shí)驗(yàn)的同時(shí)用平板菌落計(jì)數(shù)法測得。（見辦法驗(yàn)證用原則菌株2.4）6操作辦法6.1供試品的檢查量[見細(xì)菌、霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)6]6.2供試液的制備[見細(xì)菌、霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)7]6.3增菌培養(yǎng)取營養(yǎng)肉湯（或亞碲酸鈉肉湯）培養(yǎng)基3份，每份100ml，1份加入10ml供試液，1份加入供試液及陽性對照菌，1份加入與供試液等量的0.9%無菌氯化鈉溶液或磷酸鹽緩沖液（pH7.2）作為陰性對照，置30～35℃培養(yǎng)18～24h（必要時(shí)可延至48h）。陰性對照應(yīng)無菌生長。6.4分離培養(yǎng)將上述供試品增菌培養(yǎng)液，以接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂平板或甘露醇氯化鈉瓊脂平板上，置30～35℃培養(yǎng)24～72h。當(dāng)供試品分離平板無菌落生長，或有菌落生長但不同于下表所列特性，可報(bào)告為1g或表5金黃色葡萄球菌在三種選擇性培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特性培養(yǎng)基菌落形態(tài)特性卵黃氯化納瓊脂金黃色，圓形凸起，邊沿整潔，光滑濕潤，外周有分解卵磷脂后產(chǎn)生的乳濁圈，菌落直徑1～2mm甘露醇氯化納瓊脂金黃色，圓形凸起，邊沿整潔．光滑濕潤．外周有黃色環(huán)。菌落直徑0.7～1mm6.5純培養(yǎng)當(dāng)供試品分離平板生長菌落與表1所列菌落特性相似或疑似時(shí)，應(yīng)選用2～3個(gè)以上菌落，分別用接種針，輕輕沾取菌落中心表面培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，于30～35℃培養(yǎng)18～24h，取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭染色、鏡檢及接種營養(yǎng)瓊脂肉湯于30～35℃培養(yǎng)18～24h做血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)。6.6革蘭染色、鏡檢6.6.6.6.7血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)試管法：取無菌試管（10mm×100mm）3支，各加入血漿和0.9％無菌氯化鈉溶液（1:1）0.5ml，1支加入瓊脂斜面培養(yǎng)物菌懸液（或被檢菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液）0.5ml，其它2支作對照管：1支加入金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]培養(yǎng)物菌懸液或營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液0.5ml作為陽性對照；另一支加入營養(yǎng)肉湯或0.9％無菌氯化鈉溶液0.5ml作陰性對照。三管同時(shí)置37℃7成果判斷如果革蘭染色成果清晰可靠（必要時(shí)加做已知革蘭染色成果的細(xì)菌進(jìn)行染色質(zhì)量控制），凝固酶實(shí)驗(yàn)陰性對照實(shí)驗(yàn)呈陰性，陽性對照實(shí)驗(yàn)呈陽性成果，供試品培養(yǎng)物按下列狀況報(bào)告或解決：7.1疑似菌革蘭染色呈陽性球菌，血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)陽性反映者，報(bào)告1g或1ml供試品檢出金黃色葡萄球菌（少量菌株可能不是金黃色葡萄球菌而是葡萄球菌屬的其它菌種）。7.2革蘭染色鏡檢不是革蘭陽性球菌，或血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)陰性反映，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出金黃色葡萄球菌。7.3陰性對照有菌生長，實(shí)驗(yàn)成果無效。7.4陽性對照實(shí)驗(yàn)呈陰性成果，應(yīng)當(dāng)加做驗(yàn)證明驗(yàn)，考察檢品與否有抑菌活性。8注意事項(xiàng)8.1金黃色葡萄球菌在上述兩種分離培養(yǎng)基上的典型菌落為金黃色。但由于受藥品影響或非典型菌株存在，亦可呈橙黃色、檸檬色或白色。做控制菌檢查，對非典型菌落也有必要進(jìn)行凝固酶實(shí)驗(yàn)做金黃色葡萄球菌的篩查，以防漏檢金黃色葡萄球菌。培養(yǎng)基寄存時(shí)間和培養(yǎng)時(shí)間影響色素產(chǎn)生，故培養(yǎng)基應(yīng)新鮮配制。培養(yǎng)時(shí)間宜48h以上。8.2如果使用干燥培養(yǎng)基，應(yīng)按闡明書配制，注意pH值與否符合規(guī)定，必要時(shí)應(yīng)校正pH后滅菌使用。8.3血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)應(yīng)用新鮮培養(yǎng)物及新鮮血漿。如用陳舊培養(yǎng)物及血漿（纖維蛋白常已析出）易造成假陰性反映。另外，觀察成果時(shí)不要搖動試管，因凝固早期凝塊易破壞，引發(fā)假陰性實(shí)驗(yàn)。8.4葡萄球菌屬在新版《Bergey手冊》中共收載為28種，在微生物菌種鑒定中現(xiàn)在應(yīng)用較多的出版的第八版《美國臨床微生物手冊》共收錄35個(gè)菌種，44個(gè)菌型。常見有金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌3種?？蓞⒖枷卤磉M(jìn)行鑒定。其中又以金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的鑒別最為重要。表63種葡萄球菌的重要性狀性狀金黃色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌菌落色素重要為金黃色重要為白色重要為檸檬色大?。ň渲睆剑?.8～10.5～10.5～1α溶血毒素＋－／極少＋－甘露醇需氧＋dd厭氧＋－－凝固酶＋－－卵黃反映＋－－耐熱DNA酶＋－－對新生霉素敏感性SSR噬菌體分型多數(shù)能分型不能分型不能分型A蛋白＋－－致病性強(qiáng)弱或無無d成果不擬定，S敏感，R耐藥8.5現(xiàn)在商品化的金黃色葡萄球菌檢測試劑多家微生物有關(guān)制劑公司有售，試劑含有較好的穩(wěn)定性、精確性。商品化的檢測試劑應(yīng)當(dāng)在合適的條件下保存，在使用期內(nèi)應(yīng)用。（六）梭菌1簡述梭菌屬（Clostridium）過去稱為梭狀芽孢桿菌屬，菌體1um×5um左右的革蘭陽性桿菌，能形成芽孢。芽孢多不不大于菌體的寬度，細(xì)菌膨脹呈梭形，故名梭狀芽孢桿菌。該菌屬中重要病原菌有產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)、破傷風(fēng)梭菌（C.tetani）、肉毒梭菌（C.botulinum）和艱難梭菌（C.difficile），均能產(chǎn)生強(qiáng)烈的外毒素使人和動物致病。因此，對于某些用于陰道、創(chuàng)傷、潰瘍的藥品，必須控制梭菌。檢查梭菌的辦法重要是增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)和鏡檢形態(tài)觀察，必要時(shí)做分離培養(yǎng)后再行鑒定。2儀器、設(shè)備及用品2.1玻璃器皿試管（30mm×200mm）等。洗滌干凈，無殘留抗菌物質(zhì)，包扎后，滅菌備用[見細(xì)菌、霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)]。2.2天平、離心機(jī)、顯微鏡、高壓蒸汽滅菌器、恒溫干燥箱[見細(xì)菌、霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)]。2.2.2.2厭氧培養(yǎng)袋、箱（罐）等2.3干凈實(shí)驗(yàn)室或凈化工作臺[見細(xì)菌、霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)2.2.4手術(shù)鑷、手術(shù)剪及取樣匙，應(yīng)嚴(yán)密包扎，滅菌備用。3試液3.1革蘭染色液（附件二2.10，2.16，2.4）3.2厭氧批示劑（附件二4.8）3.33％過氧化氫溶液3.475％乙醇溶液3.5碘酊溶液或碘伏3.60.9％無菌氯化鈉溶液（附件二3.1）3.7苯扎溴銨（1:1000）溶液4培養(yǎng)基4.1硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（附件二5.33）4.2梭菌增菌培養(yǎng)基（附件二5.29）4.3哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基（含慶大霉素20mg／L和不含慶大霉素）（附件二5.30）5對照用菌液生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）[CMCC(B)64941]。菌液制備取生孢梭菌接種至12ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，置30～35℃培養(yǎng)18～24h，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成1ml含10～100cfu的菌液。生孢梭菌原則菌液計(jì)數(shù)可取每毫升含100～1000cfu的菌液0.1ml涂布于哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板置厭氧條件下培養(yǎng)48～72h計(jì)數(shù)；也能夠取每毫升含10～100cfu的菌液1ml接種于不少于12ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，搖勻，置30～35℃培養(yǎng)18～20h計(jì)數(shù)其中的燈籠狀菌團(tuán)，普通狀況下該燈籠狀菌團(tuán)數(shù)與平板計(jì)數(shù)菌落數(shù)相稱。[見辦法驗(yàn)證2.4]生孢梭菌菌種的保存可取其硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)物混勻、凍存管分裝、超低溫保存（如－80℃6操作辦法6.1不同劑型樣品的前解決6.6.6.1.3軟膏劑及栓劑稱取樣品10g，按細(xì)菌、霉菌、(酵母菌)計(jì)數(shù)6.23規(guī)定的適宜辦法乳化，乳化后加入預(yù)熱至45℃6.2增菌培養(yǎng)6.6.2.1.1冷觸媒法臨用前，取試管或其它適宜容器3支，1支稱入硼氫化鈉0.22g（以厭氧培養(yǎng)容器容積1L計(jì)），1支稱取枸櫞酸0.33g、碳酸氫鈉0.37g，另1支放入經(jīng)活化的鈀粒約1g，與接種后的供試品培養(yǎng)管（或平板）及厭氧批示劑管1支，同時(shí)置于厭氧培養(yǎng)容器內(nèi)，隨即各加水5ml于前2支管（或容器）6.2.1.2焦性沒食子酸法用前，取培養(yǎng)皿或其它適宜容器1支，加入焦性沒食子酸10g及無水碳酸鈉5g（以厭氧容器容積1L計(jì)），與接種后的供試品培養(yǎng)管6.2.2增菌培養(yǎng)取供試液10ml（相稱于供試品6.3分離培養(yǎng)取上述每一培養(yǎng)物0.2ml，分別涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，置厭氧條件下培養(yǎng)48～72h。若供試品平板上無菌落生長，判供試品未檢出梭菌；若供試品平板上有菌落生長，應(yīng)挑選2～3個(gè)菌落分別進(jìn)行革蘭染色和過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)。6.4革蘭染色鏡檢取疑似菌落涂片，作革蘭染色、鏡檢，觀察染色及菌體特性。本菌形態(tài)特性較為典型。培養(yǎng)后形成的芽孢，初呈“火柴頭”狀卵圓形，繼而膨大呈球形，在菌體末端如鼓槌狀。培養(yǎng)時(shí)間至72h以上時(shí)，菌體可自溶而消失，僅見游離的芽孢囊，普通染色時(shí)呈圓圈狀。染色鏡檢有卵圓形至球形的芽孢，不不大于菌體，著生于菌體中央、次端或頂端，為梭菌典型形態(tài)。6.5過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)加一滴3％過氧化氫溶液至瓊脂表面的單個(gè)分散的菌落，或轉(zhuǎn)移至載玻片上的菌落上。有氣泡形成表達(dá)過氧化氫酶反映陽性，梭菌應(yīng)成陰性成果。可用枯草芽孢桿菌作為陽性反映對照菌。7成果判斷若上述可疑菌落為革蘭陽性梭菌，有或無卵圓形或球形的芽孢。過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)陰性，判供試品檢出梭菌，否則判供試品未檢出梭菌。8注意事項(xiàng)8.1操作時(shí)勿損傷皮膚，若有損傷，應(yīng)立刻注射破傷風(fēng)抗毒素，以防感染。8.2凡帶有活菌及毒素的器具，應(yīng)在徹底滅菌后方可洗滌。（七）白色念珠菌1簡述白色念珠菌（Candidaalbicans）又名白假絲酵母菌（Saccharomycesalbicaus）屬假絲酵母菌屬（Saccharomyces）。白色念珠茵是條件致病菌，是醫(yī)學(xué)全身性真菌感染病的重要構(gòu)成之一，一旦感染，?？梢l(fā)心內(nèi)膜炎、肺炎、尿布疹、鵝