不同溶劑對淫羊藿多糖提取率的考察研究 中藥學(xué)專業(yè)

不同溶劑對淫羊藿多糖提取率的考察研究錄摘要………………Ⅰ-ⅡTOC\o"1-2"\h\z\u1前言 前言淫羊藿(E.brevicornu)為小檗科(Berberidancea)淫羊藿屬(Epimedium)多年生草本植物。別名仙靈脾、千金兩、棄杖草、三枝九葉草等[1]。淫羊藿始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，現(xiàn)代研究文獻(xiàn)最早可以追溯回1960年代，上世紀(jì)90年代起海外也有相關(guān)研究[2]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)的淫羊藿種類多達(dá)42種，其中入藥品種有5種，主要研究品種有10種，來源遍布黔川隴等地區(qū)[3-5]。淫羊藿主要以莖、葉入藥，氣辛，味甘溫，無毒，歸肝、腎經(jīng)，有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效，主治腎陽虛衰，陽痿遺精，筋骨痿軟，風(fēng)濕痹痛，麻木拘攣。其中巫山淫羊藿因含有較多朝藿定C(C39H50O17)成分，可治絕經(jīng)期眩暈[6]。淫羊藿含有多糖、黃酮、生物堿、木脂素、萜類、微量元素等營養(yǎng)成分。其主要活性成分為淫羊藿苷(C33H40O15)、寶藿苷I(C27H30O10)和淫羊藿多糖(EPS)等。不同來源提取出來的淫羊藿其成分性質(zhì)也各有不同[7]。淫羊藿具有極高的藥用價值。淫羊藿可延緩性腺衰老而延緩生殖壽命，可在分娩高齡化帶來的種種醫(yī)學(xué)問題中保障優(yōu)生優(yōu)育率；加速骨修復(fù)過程，防止骨質(zhì)疏松，并與其它藥物配伍調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)。淫羊藿多糖有誘生干擾素(IFN)、促進(jìn)骨髓造血等作用影響免疫系統(tǒng)的發(fā)揮[8]。以上藥理作用說明中藥淫羊藿對人口老齡化帶來的醫(yī)學(xué)疾病的預(yù)防及治療有積極作用和促進(jìn)作用。多糖通常是指由十個以上單糖通過糖苷間連接而成的大分子化合物。多糖以其水溶性屬性不同分為兩類。不溶性多糖多為纖維素，在植物細(xì)胞組織中起支撐的作用；不溶性多糖多為粘液質(zhì)、菊糖、果膠、淀粉等，在植物細(xì)胞組織中起營養(yǎng)供給的作用。中藥中發(fā)現(xiàn)的植物活性多糖有人參多糖、茯苓多糖、黃芪多糖和海藻多糖等。大量實驗表明，這些從天然產(chǎn)物中分離出來的多糖有較強(qiáng)的生物活性。中藥多糖能調(diào)控細(xì)胞分裂和分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與衰老，特別在調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、抗病毒、心血管等方面的作用更為顯著[9]。植物多糖這一領(lǐng)域從1960年代起開始發(fā)展[9]。隨著醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)的不斷深入發(fā)展，淫羊藿苷已達(dá)到一定水平的研究，而淫羊藿多糖的研究仍處于起步階段。因其對免疫學(xué)方面有重要貢獻(xiàn)，且中藥本身安全無毒，故具有良好的開發(fā)前景，將淫羊藿作為輔助藥物治療疾病是近年來的研究熱點(diǎn)[10-11]。通過大量實驗發(fā)現(xiàn)，不同種類的淫羊藿多糖經(jīng)過水解后生成的單糖組分主要為阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等。不同產(chǎn)地間淫羊藿多糖的組分并無太大差異，但各單糖間組分含量分布會因生長條件而改變。故對淫羊藿多糖提取方法的討論可以增加特定種類淫羊藿多糖的提取率[7]。在中藥淫羊藿多糖提取部分，現(xiàn)多以傳統(tǒng)水提法、微波輔助提取法、酶提取法以及超聲提取法優(yōu)化研究為主[12-16]。對溶劑方面的優(yōu)化研究較少。故本文參考相關(guān)配伍中藥的溶劑提取方法，對淫羊藿多糖進(jìn)行醇水提取、堿水提取以及堿醇提取的方法考察研究[17-22]。苯酚硫酸法適用于淫羊藿多糖的含量測定[23-25]。淫羊藿多糖在濃硫酸的作用下水解為單糖，并與苯酚反應(yīng)生成橙黃色化合物。反應(yīng)后體系穩(wěn)定，可在紫外分光光度計中最大吸收峰處檢測吸光度，從而計算多糖含量。該方法操作快捷，反應(yīng)穩(wěn)定可靠，所用儀器簡單，故用于本實驗中中藥淫羊藿多糖的含量測定。本實驗以淫羊藿為材料，采用四種溶劑提取淫羊藿多糖：水提法、醇水法、堿水法、堿醇法，比較四種溶劑所提出膏率，粗多糖中多糖的含量，選出適合于淫羊藿多糖的提取方法。該實驗結(jié)果可以促進(jìn)淫羊藿資源的有效利用，為活性淫羊藿多糖的篩選，多糖產(chǎn)品的開發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。2材料淫羊藿購自萬怡藥店，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院程軒軒老師鑒定。材料陰干，室溫存放備用。2.1試劑純水實驗室自制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(AR)上海伯奧生物科技有限公司95%乙醇廣州市叢源儀器有限公司苯酚(AR)廣州化學(xué)試劑廠濃硫酸(AR)廣州化學(xué)試劑廠氫氧化鈉(AR)南京化學(xué)試劑股份有限公司2.2儀器設(shè)備UV-3100PC型紫外可見分光光度計上海美譜達(dá)儀器有限公司BS124S電子天平德國Sartorius公司101-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋常州澳華儀器有限公司Molgene1820a超純水系統(tǒng)上海摩勒科學(xué)儀器有限公司ZNHW型智能恒溫電熱套鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司PHS-3C數(shù)顯恒溫酸度計上海精密科學(xué)儀器有限公司RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠DLSB-5L/25低溫冷卻液循環(huán)泵鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司A11基本型粉碎機(jī)德國IKA公司SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵邦西儀器科技(上海)有限公司DZF-6050真空干燥箱上海申賢恒溫設(shè)備廠SB25-12DT超聲波清洗機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩浙江上虞市華豐五金儀器有限公司2.3溶液的配制2.3.15%苯酚溶液配制取苯酚(AR)避光置于2000mL已加水的大燒杯中，放入80°C水浴鍋中水浴。用1000mL大燒杯取不少于200mL配制用純水于同一水浴鍋中加熱。待苯酚完全融化成液體，于通風(fēng)櫥中，取融化成液體的苯酚5.0g于200mL燒杯中，用加熱后的純水溶解稀釋，并將溶液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，純水定容為5%濃度的苯酚溶液。配制好的5%苯酚溶液-20°C貯存于冰柜中，標(biāo)簽注明溶液名稱、濃度、配制時間及使用者姓名。妥善保存，用前即取，使用完畢及時放回，防止苯酚揮發(fā)降低試劑濃度、污染其它試劑或危害人身安全[26]。2.3.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液配制用萬分之一電子分析天平精密稱取無水葡萄糖0.0500g于50mL小燒杯中，加入純水使之完全溶解，少量多次轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中，以燒杯中溶液完全轉(zhuǎn)移至容量瓶中，無葡萄糖殘留為準(zhǔn)。用純水將容量瓶定容至刻度線，搖勻，作儲備液，濃度為0.2mg/mL。配制好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液-20°C貯存于冰柜中，標(biāo)簽注明溶液名稱、濃度、配制時間及使用者姓名。妥善保存，用前即取，使用完畢及時放回，防止葡萄糖液放置時間過長或溫度過高而變質(zhì)，或受其它試劑污染而變質(zhì)。2.3.3醇水提取溶劑配制取95%乙醇約473mL，加8550mL純水，用0°-50°量程酒精計標(biāo)定至5%酒精濃度，作醇水提取溶劑儲備液。儲備液應(yīng)臨配臨用，防止乙醇揮發(fā)使溶劑含醇量降低或被外界污染。2.3.4堿水提取溶劑配制取氫氧化鈉顆粒，逐次少量加入9000mL純水中，用已校準(zhǔn)的pH計標(biāo)定至12.0，作堿水提取溶劑儲備液。儲備液應(yīng)臨配臨用，防止被外界污染。2.3.5醇堿提取溶劑配制取95%乙醇約473mL，加8550mL純水，用0°-50°量程酒精計標(biāo)定至5%酒精濃度。逐次少量加入氫氧化鈉顆粒，用已校準(zhǔn)的pH計標(biāo)定至12.0。儲備液應(yīng)臨配臨用，防止乙醇揮發(fā)使溶劑含醇量降低或被外界污染。2.3.6樣品液的制備用稱量天平稱取原藥材30g，依照方法3.2.2進(jìn)行提取，乙醇沉淀后真空干燥得粗多糖干膏為樣品。精密稱取樣品0.6000g，以純水復(fù)溶并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，定容。移取2.5mL定容液至50mL容量瓶中，以純水定容，制成0.3mg/mL樣品液，貯存于-20°C冰箱中，備用。3方法3.1方法學(xué)考察3.1.1最大波長的選擇精密移取樣品液1.0mL至試管中，垂直加入1.0mL的5%苯酚溶液和5.0mL濃硫酸，加橡膠塞置于水浴鍋中沸水浴反應(yīng)30min，立即取出，置入冰水中冷卻。于紫外分光光度計儀器中進(jìn)行全波長(200nm-800nm)掃描。結(jié)果見圖4-1。最大吸收波長為485nm。3.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立分別移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液2.5mL、5.0mL、7.5mL、10.0mL、12.5mL至25ml容量瓶中，用純水定容，為0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.10mg/mL溶液。上述溶液各取1.0mL加入具塞試管中，并另取1.0mL純水于新的具塞試管中作空白溶液。垂直加入1.0mL的5%苯酚溶液和5.0mL濃硫酸于6支試管中，加橡膠塞置于已預(yù)熱的水浴鍋中沸水浴反應(yīng)30min，立即取出，置入冰水中冷卻5min以上，至溶液溫度降值室溫。在485nm處測定吸光度，以吸光度值y為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度x為橫坐標(biāo)，回歸處理得回歸方程：y=10.548x-0.0502，r=0.9996，線性范圍：0.0200~0.1000mg/mL，與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見圖4-2。3.1.3精密度試驗精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液7.5mL至25mL容量瓶中，用純水定容，為0.06mg/mL溶液。精密移取上述溶液3.0mL加入具塞試管中，并另取1.0mL純水于新的具塞試管中作空白溶液。垂直加入3.0mL的5%苯酚溶液和15.0mL濃硫酸，加橡膠塞置于水浴鍋中沸水浴反應(yīng)30min，立即取出，置入冰水中冷卻5min以上至溶液溫度降值室溫。取樣品反應(yīng)液平均分成5份，于485nm處連續(xù)測定吸光度，結(jié)果見表4-1。3.1.4重復(fù)性試驗精密移取樣品液1.0mL至試管中，并另取1.0mL純水于新的具塞試管中作空白溶液。垂直加入1.0mL的5%苯酚溶液和5.0mL濃硫酸，加橡膠塞置于水浴鍋中沸水浴反應(yīng)30min，立即取出，置入冰水中冷卻5min以上至溶液溫度降值室溫。在485nm處測定吸光度。重復(fù)以上操作5次。結(jié)果見表4-3。3.1.5穩(wěn)定性試驗精密稱取三種樣品各0.6000g，依照方法3.2.2分別制成樣品液。各移取樣品液1.0mL至三支試管中，并另取1.0mL純水于新的具塞試管中作空白溶液。垂直加入1.0mL的5%苯酚溶液和5.0mL濃硫酸，加橡膠塞置于水浴鍋中沸水浴反應(yīng)30min，立即取出，置入冰水中冷卻5min以上至溶液溫度降值室溫。在485nm處測定吸光度。隔20min進(jìn)行一次測定。共連續(xù)測定5次。結(jié)果見表4-2。3.1.6回收率試驗各取樣品液5.0mL至6支50ml離心管中，分別加入純水、0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.10mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0mL，混勻。純水為空白對照。精密移取混勻后溶液1.0mL至6支具塞試管中，垂直加入1.0mL的5%苯酚溶液和5.0mL濃硫酸，加橡膠塞置于水浴鍋中沸水浴反應(yīng)30min，立即取出，置入冰水中冷卻5min以上至溶液溫度降值室溫。在485nm處測定吸光度。結(jié)果見表4-4。3.2實驗步驟總體實驗步驟如下：藥材前處理—提取—濃縮—醇沉—水浴揮發(fā)—真空干燥—樣品含量測定3.2.1藥材前處理：將干燥的淫羊藿莖葉粉碎，過20目及60目篩，取可通過20目篩而不可通過60目篩者，為淫羊藿粗粉。收集粗粉，干燥陰涼處保存。3.2.2提取參考前人方法[18-22]，采用熱水提取，堿水提取、純水提取、堿醇提取四種溶劑提取方法，分別進(jìn)行淫羊藿多糖的提取。4種溶劑具體提取步驟如下：熱水提?。河秒娮犹炱椒Q取30.00g已粉碎過篩的粗粉，加入純水600mL，于電熱套中90°C回流提取，料液比1∶20。每次回流提取2小時，紗布過濾分離濾渣和濾液，濾渣取600mL純水進(jìn)行第二次回流提取，濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行真空濃縮。以此類推，共提取3次。堿水提?。河秒娮犹炱椒Q取30.00g已粉碎過篩的粗粉，加入制備好的堿水提取溶劑儲備液600mL，于電熱套中90°C回流提取，料液比1∶20。每次回流提取2小時，紗布過濾分離濾渣和濾液，濾渣取600mL純水進(jìn)行第二次回流提取，濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行真空濃縮。以此類推，共提取3次。醇水提?。河秒娮犹炱椒Q取30.00g已粉碎過篩的粗粉，加入制備好的醇水提取溶劑儲備液600ml，于電熱套中90°C回流提取，料液比1∶20。每次回流提取2小時，紗布過濾分離濾渣和濾液，濾渣取600mL純水進(jìn)行第二次回流提取，濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行真空濃縮。以此類推，共提取3次。堿醇提?。河秒娮犹炱椒Q取30.00g已粉碎過篩的粗粉，加入制備好的堿醇提取溶劑儲備液600mL，于電熱套中90°C回流提取，料液比1∶20。每次回流提取2小時，紗布過濾分離濾渣和濾液，濾渣取600mL純水進(jìn)行第二次回流提取，濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行真空濃縮。以此類推，共提取3次。3.2.3濃縮濾液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中以合適轉(zhuǎn)速于50°C-60°C進(jìn)行真空濃縮，低溫冷卻液循環(huán)泵視天氣溫度調(diào)整冷卻參數(shù)8°C-10°C。注意使用時應(yīng)先開啟低溫冷卻系統(tǒng)，待真空泵壓力達(dá)-0.09MPa以下再開啟加熱。加熱溫度應(yīng)從50°C設(shè)起，待實際溫度達(dá)到目標(biāo)溫度時再逐漸升高。不可直接選擇60°C參數(shù)，防止溶液暴沸，濃縮液倒吸入冷凝回收器中受污染，造成損失。3.2.4醇沉提取完畢，合并濾液，總體積濃縮至30mL。加入四倍體積95%乙醇，用100°酒精計標(biāo)定至80%以上含醇量。用保鮮膜將燒杯封口，常溫保存，陰蔽處靜置過夜(8小時)。3.2.5水浴揮發(fā)取靜置過夜的醇沉液置于已預(yù)熱的水浴鍋中水浴揮發(fā)至浸膏狀，轉(zhuǎn)移至已稱重的50mL空離心管中繼續(xù)水浴揮發(fā)至稠膏狀。因醇沉液中酒精濃度較高，揮發(fā)時會隨蒸汽帶出，故實驗應(yīng)在通風(fēng)櫥或無火通風(fēng)處進(jìn)行。注意離心管與其管蓋應(yīng)一一標(biāo)號對應(yīng)，確保最終實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確。3.2.6真空干燥將已呈稠膏狀的樣品連離心管盛于瓷盤中，真空干燥箱中60°C真空干燥約3小時，至樣品呈干膏狀，倒置不會流出為止，此為淫羊藿粗多糖樣品。用電子天平稱量離心管總重，則粗多糖樣品干膏重即為離心管總重與空離心管重之差。結(jié)果見表4-5至表4-9。3.2.7樣品含量檢測淫羊藿粗多糖中多糖的含量測定采用苯酚硫酸法。精密移取1.0mL樣品液，垂直加入1.0mL的5%苯酚溶液和5.0mL濃硫酸，加橡膠塞置于水浴鍋中沸水浴反應(yīng)30min，立即取出，置入冰水中冷卻5min以上至溶液溫度降值室溫。在485nm處測定吸光度。四種溶劑提取的結(jié)果見表4-10。3.3樣品存儲經(jīng)真空干燥后的干膏品即為最終的粗多糖樣品。樣品直接用對應(yīng)的離心管蓋擰緊，或用大藥匙將樣品取出，置于稱量紙中包裝，并用塑封袋密封，貼標(biāo)分類保存于-20°C冰柜中。3.4計算方法4結(jié)果4.1觀測現(xiàn)象淫羊藿原藥材上表面綠色，下表面灰綠色，網(wǎng)脈明顯，中脈及細(xì)脈突出。邊緣具有黃色刺毛狀細(xì)鋸齒，近革質(zhì)。經(jīng)過提取濃縮后樣品呈棕褐色至黑色，氣微，味微苦，固體。將四倍體積95%乙醇加入濃縮好的樣品進(jìn)行醇沉?xí)r，有棕色固體于樣品溶液中析出，可見淫羊藿多糖不溶于乙醇。多糖在進(jìn)行苯酚硫酸法反應(yīng)時，加入濃硫酸時有氣體產(chǎn)生，溶液濃度越大，其反應(yīng)顏色越深。4.2經(jīng)過加工整理的圖表圖4-1多波長掃描曲線如圖4-1，樣品經(jīng)苯酚硫酸法反應(yīng)后于200nm-800nm處進(jìn)行多波長掃描，紫外圖譜顯示多糖提取液在485nm處有最大吸收峰。因此選擇其作為多糖測定的吸收波長。以吸光度值y為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度x為橫坐標(biāo)，回歸處理得回歸方程：y=10.548x-0.0502，r=0.9996，線性范圍：0.0200~0.1000mg/mL，該結(jié)果顯示葡萄糖濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果如圖4-2。圖4-2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線表4-1精密度數(shù)據(jù)項目12345均值RSD%樣10.21280.21290.21270.21300.21330.21290.11%樣20.21330.21330.21360.21390.21340.21350.12%樣30.21210.21290.21230.21210.21260.21240.16%樣40.21300.21310.21230.21220.21220.21260.21%樣50.21300.21360.21360.21320.21280.21320.17%如表4-1。該數(shù)據(jù)結(jié)果顯示精密度實驗的五組數(shù)據(jù)其RSD值均在0.5%以下，符合國家藥典標(biāo)準(zhǔn)，儀器測量結(jié)果重現(xiàn)性好。表4-2穩(wěn)定性數(shù)據(jù)項目0min20min40min60min80min均值RSD%樣10.04880.04880.04860.04870.04880.04880.18%樣20.03740.03740.03730.03740.03720.03740.21%樣30.03880.03870.03870.03870.03860.03870.18%如表4-2。該數(shù)據(jù)結(jié)果顯示穩(wěn)定性實驗的三組數(shù)據(jù)其RSD值均在0.5%以下，表明淫羊藿多糖液經(jīng)苯酚硫酸法反應(yīng)后80min內(nèi)結(jié)果穩(wěn)定，符合國家藥典標(biāo)準(zhǔn)。表4-3重復(fù)性數(shù)據(jù)項目12345均值RSD%樣10.45630.45910.46050.45880.45830.45860.33%樣20.46750.46580.46820.46740.46320.46640.43%樣30.47370.47670.47430.47040.47450.47390.48%樣40.47820.47200.47200.47190.47290.47340.57%樣50.44320.44510.44290.44670.44280.44410.38%如表4-3。該數(shù)據(jù)結(jié)果顯示重復(fù)性實驗的五組數(shù)據(jù)其RSD值均在1%以下，表明該操作方法可靠，方法標(biāo)準(zhǔn)，可重復(fù)度高，符合國家藥典標(biāo)準(zhǔn)。表4-4回收率數(shù)據(jù)葡萄糖濃度(mg/mL)樣品濃度(mg/mL)理論含糖量(mg/mL)吸光值計算得含糖量(mg/mL)回收率(%)0.04300.03000.03650.30540.033792.36%0.30200.033491.48%0.30320.033591.79%0.30230.033491.56%0.30560.033792.42%如表4-4。該數(shù)據(jù)結(jié)果顯示回收率實驗的五組數(shù)據(jù)其回收率均在100%±10%以內(nèi)，平均回收率為92.00%，符合國家藥典標(biāo)準(zhǔn)。表4-5堿水法出膏率12345藥材干重(g)30.0030.0030.0030.0030.00樣品總重(g)22.9520.2621.1317.7521.55出膏率(%)38.5028.6731.3321.1032.27平均出膏率(%)30.37表4-6醇水法出膏率12345藥材干重(g)30.0030.0030.0030.0030.00樣品總重(g)19.5519.8328.8619.0021.55出膏率(%)26.4327.6718.6324.6732.27平均出膏率(%)25.93表4-7水提法出膏率12345藥材干重(g)30.0030.0030.0030.0030.00樣品總重(g)28.8242.0218.5417.7115.28出膏率(%)19.5723.9723.5320.1012.53平均出膏率(%)19.94表4-8堿醇法出膏率12345藥材干重(g)30.0030.0030.0030.0030.00樣品總重(g)33.2531.5121.9918.8619.82出膏率(%)33.7029.2735.0725.6327.33平均出膏率(%)30.20表4-9出膏率總表12345?χ水提法(%)19.5723.9723.5320.1012.5319.94堿水法(%)38.5028.6731.3321.1032.2730.37醇水法(%)26.4327.6718.6324.6732.2725.93堿醇法(%)33.7029.2735.0725.6327.3330.20如表4-9，水提法、醇水法、堿水法、堿醇法提取出來的平均出膏率分別為19.94%、25.93%、30.37%、30.20%。故四種溶劑的淫羊藿出膏率大小為堿水法>堿醇法>醇水法>水提法。該結(jié)果表明溶液pH與含醇量會影響淫羊藿多糖的提取率，且pH12.0的堿性溶劑提取率其影響大于5%乙醇溶劑。表4-10樣品濃度測定結(jié)果12345?χ水提法吸光度0.41130.46370.52820.53290.39350.4659濃度(mg/mL)0.04380.04870.05480.05530.04210.0489堿水法吸光度0.43360.44900.40390.44580.47080.4406濃度(mg/mL)0.04590.04760.04330.04730.04970.0468醇水法吸光度0.50780.46420.34380.35670.39350.4132濃度(mg/mL)0.05290.04880.03740.03860.04210.0439堿醇法吸光度0.54770.60640.48580.61320.51230.5531濃度(mg/mL)0.05670.06220.05080.06290.05330.0572如表4-100，數(shù)據(jù)顯示水提法、堿水法、醇水法、堿醇法的樣品濃度均值分別為0.0489mg/mL、0.0468mg/mL、0.0439mg/mL、0.0572mg/mL。該數(shù)據(jù)表明四種溶劑所提取的粗多糖中多糖的濃度大小分別為堿醇法>水提法>堿水法>醇水法。表4-11粗多糖中多糖含量12345?χ水提法(%)14.5816.2418.2818.4314.0216.31堿水法(%)15.2915.8714.4315.7716.5715.58醇水法(%)17.6316.2612.4512.8614.0214.64堿醇法(%)18.8920.7516.9420.9717.7819.06如表4-11。數(shù)據(jù)顯示水提法、堿水法、醇水法、堿醇法的平均粗多糖中多糖含量分別為16.31%、15.58%、14.64%、19.06%。該數(shù)據(jù)表明四種溶劑所提取的粗多糖中多糖的含量大小分別為堿醇法>水提法>堿水法>醇水法。表4-12藥材含糖量多糖濃度(mg/mL)樣品液濃度(mg/mL)粗多糖中多糖的含量(%)出膏率(%)藥材含糖量(%)水提法0.04890.316.3119.943.25堿水法0.046815.5830.374.73醇水法0.043914.6425.933.79堿醇法0.057219.0630.205.75如表4-12，數(shù)據(jù)顯示水提法、堿水法、醇水法、堿醇法的藥材含糖量分別為3.25%、4.73%、3.79%、5.75%。該數(shù)據(jù)表明四種溶劑所得藥材含糖量大小分別為堿醇法>堿水法>醇水法>水提法。表4-13假設(shè)檢驗匯總原假設(shè)測試顯著性水平?jīng)Q策者1粗多糖中多糖的含量的分布在溶劑組別類別上相同獨(dú)立樣本Kruskal-Wallis檢驗.025拒絕原假設(shè)。2出膏率的分布在溶劑組別類別上相同.0253藥材含糖量的分布在溶劑組別類別上相同.006注：顯示漸進(jìn)顯著性。顯著性水平是.05。如表4-13?？芍诒?-13所匯總的數(shù)據(jù)中，出膏率、粗多糖中多糖的提取率以及藥材含糖量均有漸進(jìn)顯著性，即為：數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示每個假設(shè)均有一對或以上組相互間有顯著性差異(P<0.05)。具體分析見表4-14、4-15、4-16。表4-14粗多糖中多糖含量成對比較樣本1-樣本2檢驗統(tǒng)計量標(biāo)準(zhǔn)誤差標(biāo)準(zhǔn)檢驗統(tǒng)計量顯著性水平調(diào)整顯著性醇水法-堿水法1.9003.740.508.6111.000醇水法-水提法4.2003.7401.123.2611.000醇水法-堿醇法-10.7003.740-2.861.004.025堿水法-水提法2.3003.740.615.5391.000堿水法-堿醇法-8.8003.740-2.353.019.112水提法-堿醇法-6.5003.740-1.738.082.493注：1.每行檢驗原假設(shè)：樣本1和樣本2分布相同。2.顯示漸進(jìn)顯著性（2-side檢驗）。顯著性水平是.05。如表4-14?？芍姆N溶劑提取所得粗多糖中多糖的提取率有漸進(jìn)顯著性，其中醇水法與堿醇法、堿水法與堿醇法兩兩比較有顯著性差異(P<0.05)，表明堿醇法的粗多糖中多糖的含量大大高于堿水法與醇水法粗多糖中多糖的含量。表4-15出膏率成對比較樣本1-樣本2檢驗統(tǒng)計量標(biāo)準(zhǔn)誤差標(biāo)準(zhǔn)檢驗統(tǒng)計量顯著性水平調(diào)整顯著性水提法-醇水法-5.5003.740-1.470.141.849水提法-堿水法-9.7003.740-2.593.010.057水提法-堿醇法-10.0003.740-2.674.008.045醇水法-堿水法4.2003.7401.123.2611.000醇水法-堿醇法-4.5003.740-1.203.2291.000堿水法-堿醇法-.3003.740-.080.9361.000注：1.每行檢驗原假設(shè)：樣本1和樣本2分布相同。2.顯示漸進(jìn)顯著性（2-side檢驗）。顯著性水平是.05。如表4-15?？芍姆N溶劑提取所得出膏率有漸進(jìn)顯著性，其中水提法與堿水法、水提法與堿醇法兩兩比較有顯著性差異(P<0.05)，表明堿醇法的出膏率大大高于水提法與堿水法的出膏率。表4-16藥材含糖量成對比較樣本1-樣本2檢驗統(tǒng)計量標(biāo)準(zhǔn)誤差標(biāo)準(zhǔn)檢驗統(tǒng)計量顯著性水平調(diào)整顯著性水提法-醇水法-2.8003.740-.748.4541.000水提法-堿水法-6.8003.740-1.817.069.415水提法-堿醇法-12.4003.740-3.314.001.006醇水法-堿水法4.0003.7401.069.2851.000醇水法-堿醇法-9.6003.740-2.566.010.062堿水法-堿醇法-5.6003.740-1.497.134.807注：1.每行檢驗原假設(shè)：樣本1和樣本2分布相同。2.顯示漸進(jìn)顯著性（2-side檢驗）。顯著性水平是.05。如表4-16。可知四種溶劑提取所得藥材含糖量有漸進(jìn)顯著性，其中水提法與堿水法、醇水法與堿醇法兩兩比較有顯著性差異(P<0.05)，表明堿醇法提取所得的藥材含糖量大大高于水提法與醇水法的出膏率。4.3小結(jié)綜合以上結(jié)果，出膏率中堿水法和堿醇法較高，粗多糖中多糖的含量測定中堿醇法和水提法較高，最終計算所得藥材中多糖含量堿醇法最高，堿水法次之，水提法最低?？傻媒Y(jié)論：堿醇法為四種方法中提取率最高者，與預(yù)期結(jié)果相符。堿醇溶劑提取方法為：5%苯酚溶液，pH為12.0，料液比為1∶20，回流提取3次，每次2小時，合并溶液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1∶1，醇沉過夜，真空干燥至干膏狀，為樣品。5討論5.1討論所有試劑試樣和儀器均須按照管理標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行使用和存放，保證試劑的有效性，儀器的精密性，實驗環(huán)境整潔有序。嚴(yán)格按照要求進(jìn)行操作，如本文中5%苯酚溶液的配制以及苯酚硫酸法的操作應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，保障人身安全。實驗操作應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)心，如移液操作時應(yīng)保證溶質(zhì)已完全溶解，少量多次轉(zhuǎn)移至另一容器中，保證原容器無溶質(zhì)殘留；定容時應(yīng)保證凹液面最低處與刻線平齊，視線與其呈水平狀態(tài)，防止誤差。實驗中因環(huán)境氣候變化差異大，導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)可能因溫度、濕度而產(chǎn)生偏差，對最終結(jié)果造成影響。故因妥善保管實驗儀器設(shè)備，定期進(jìn)行養(yǎng)護(hù)，以保障實驗儀器精密性、穩(wěn)定性。5.2展望本實驗僅為溶劑方法考察。由水提法、堿水法、醇水法提取所得的多糖內(nèi)分別含較多中性多糖、酸性多糖以及極性較大多糖。而堿性多糖及極性較小多糖提取所得含量可能變小，其具體作用及成分結(jié)構(gòu)有待研究。如需對其成分組成、結(jié)構(gòu)及藥理方面進(jìn)一步研究，應(yīng)在除雜除蛋白等純化后，通過HPLC、GC、MS等儀器分析方法，分析由不同溶劑提取出不同多糖的成分組成及其分子結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行藥效學(xué)等相關(guān)實驗。下一步研究可以圍繞堿醇法這一溶劑提取方法，對醇含量、pH值等影響因素進(jìn)行單因素考察，并用正交或響應(yīng)面法優(yōu)化堿醇法提取因素，或進(jìn)行藥物抗炎抗敏等實驗，以豐富淫羊藿多糖的相關(guān)研究。亦可與其它藥物配伍，考察其在堿醇提取下有效成分的溶出率。對于藥材過后所剩的藥材細(xì)粉，可以對原藥材-粗粉-細(xì)粉做藥材粉碎度對藥材出膏率考察研究，充分利用藥材資源，減少浪費(fèi)。堿醇提取法可以增加多糖提取效率，提高淫羊藿藥材的資源利用率，不僅可以為淫羊藿多糖大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)，而且對于其多糖成分的研究可為進(jìn)一步開發(fā)該種植物提供依據(jù)。5.3結(jié)論本文通過用不同溶劑提取中藥淫羊藿多糖，研究考察出較優(yōu)的淫羊藿多糖提取溶劑，對中藥淫羊藿多糖提取提供一定參考基礎(chǔ)。在水提法、醇水法、堿水法、堿醇法中，堿醇法提取率較高，與其它組相比顯著性差異較大，因此為本研究篩選出的結(jié)果，符合預(yù)期實驗結(jié)果。

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綜述中藥淫羊藿的研究進(jìn)展1概述淫羊藿具有很高的藥用價值，臨床應(yīng)用廣泛，多用于陽痿遺精、筋骨痿軟、風(fēng)濕痹痛、麻木拘攣等?？偨Y(jié)了近年來關(guān)于淫羊藿的相關(guān)報道，對淫羊藿化學(xué)成分、藥理作用、提取方法等方面進(jìn)行了較為詳盡的論述，表明淫羊藿具有較為突出的藥理作用及臨床療效，提示淫羊藿為極具開發(fā)前景的中藥材，為其深入研究和拓寬其臨床應(yīng)用范圍提供了科學(xué)依據(jù)[1]。本綜述對國內(nèi)外在淫羊藿領(lǐng)域的主要研究成果、最新進(jìn)展、研究動態(tài)、前沿問題等進(jìn)行綜合分析，并在中藥淫羊藿相關(guān)領(lǐng)域中較全面的反映專題歷史背景、前人工作、爭論焦點(diǎn)、研究現(xiàn)狀和發(fā)展前景等內(nèi)容，以達(dá)到淫羊藿多糖提取的前期資料搜集的目的，明確實驗開展的意義。2正文淫羊藿(HerbaEpinedii)為小檗科(Berberidaceae)淫羊藿屬(EpinediumL.)植物的直立草本植物淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿或朝鮮淫羊藿的干燥地上部分。別名仙靈脾、三叉鳳等。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“淫羊藿主陰痿絕傷，莖中痛，利小便，益力氣，強(qiáng)志。”該藥材主產(chǎn)于陜西、遼寧、山東、四川等地，且不同地區(qū)的品種各有不同。據(jù)《中華人民共和國藥典》(2015年版，一部)記載，淫羊藿性溫，味辛、甘，歸肝、腎經(jīng)，“補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕。用于陽痿遺精、筋骨痿軟，風(fēng)濕痹痛，麻木拘攣”[2]淫羊藿的研究在60年代就開始了，而淫羊藿多糖的研究在80年代中期才緩慢展開。直至2005年，淫羊藿才被作為中藥正式被編入國家藥典中，規(guī)范用藥選材。2.1化學(xué)成分淫羊藿含有多糖、黃酮類化合物、生物堿、木脂素、萜類化合物、綠原酸、必需脂肪酸、微量元素等營養(yǎng)成分或生物活性成分。目前對淫羊藿總黃酮、淫羊藿苷和淫羊藿多糖的研究較多。2.1.1淫羊藿總黃酮淫羊藿總黃酮是從淫羊藿葉中提取的有效成分，其主要功效是補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、去風(fēng)濕。臨床上可用于治療陽痿遺精、筋骨痿軟、風(fēng)濕痹痛、麻木拘攣和更年期高血壓，對血管的生成也有一定的抑制作用[3]。而且淫羊藿總黃酮對體外成骨細(xì)胞增殖和分化成熟具有促進(jìn)作用[4]。2.1.2淫羊藿多糖淫羊藿多糖是淫羊藿藥材的重要有效成分，由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等單糖組成。淫羊藿多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗衰老等功效。有研究證明淫羊藿多糖可以增強(qiáng)小鼠對H1N1的免疫應(yīng)答[5]，有促進(jìn)DNA合成、肝細(xì)胞增殖和血小板凝聚的作用[6]。2.1.3淫羊藿苷淫羊藿苷為淫羊藿的干燥莖葉提取物，其化學(xué)分子式為C33H40O15，分子量為676.65，結(jié)構(gòu)上屬于8-異戊烯基黃酮醇苷類化合物。淫羊藿苷對心臟具有明顯的保護(hù)和增強(qiáng)作用，可增加心腦血管血流量、促進(jìn)造血功能，還具有補(bǔ)腎壯陽、抗衰老等功效。有研究證實淫羊藿苷具有骨誘導(dǎo)潛能[7]，可以促進(jìn)成骨細(xì)胞，骨髓基質(zhì)細(xì)胞和其他細(xì)胞的增殖[8]，并可抑制腫瘤細(xì)胞基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞鈣化[9]。有關(guān)淫羊藿苷的研究較多，所以對淫羊藿苷功能的發(fā)現(xiàn)也較多。2.2藥理作用現(xiàn)代藥理實驗研究表明，淫羊藿對心腦血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、骨髓系統(tǒng)等有一定的保健作用，具有調(diào)節(jié)雄性發(fā)育、調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤、改善心血管系統(tǒng)功能、舒張血管、緩解婦女更年期癥狀、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抗骨質(zhì)疏松、抗肝毒素、抗氧化、抗衰老等生理活性。2.2.1對生殖系統(tǒng)的作用淫羊藿對生殖器官和細(xì)胞也表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用，淫羊藿灌胃治療可以延緩性腺衰老，防止睪丸退行性變化，并增加精子數(shù)量等[11，12]，對精子膜的過氧化損傷起到保護(hù)作用[13]，對女性不僅可以延緩生殖壽命，還可以延緩卵巢的衰老[14]。2.2.2對骨組織的作用淫羊藿對骨骼系統(tǒng)有直接的影響[15]，因腎經(jīng)的充足與否決定了骨的生長發(fā)育和營養(yǎng)，充足的腎精可以加速骨的修復(fù)過程，而淫羊藿則可以補(bǔ)腎精，故其可以促進(jìn)家兔骨折愈合。淫羊藿總黃酮則可以維持骨代謝的正平衡狀態(tài)，減少骨量丟失，從而防止骨質(zhì)疏松的發(fā)生[16]，而且淫羊藿總黃酮可以降低腎上腺皮質(zhì)激素所致的骨壞死發(fā)病率。2.2.3對心血管系統(tǒng)的作用淫羊藿對心血管系統(tǒng)在臨床上具有較好的運(yùn)用價值，可以起到降低血脂、血壓和膽固醇的作用[17]，雖然淫羊藿單獨(dú)作用并不能發(fā)揮降低血壓的作用，但可以通過一系列物質(zhì)而最終達(dá)到降血壓的目的。2.2.4對免疫系統(tǒng)的作用淫羊藿可以促使胸腺縮小[18]，是白介素2合成增加，其與淫羊藿總黃酮制成的復(fù)合脂質(zhì)體，可以顯著改善調(diào)節(jié)因子的活性，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的免疫活性。淫羊藿多糖能使小鼠胸腺和脾臟細(xì)胞合成IL-2增多，有誘生干擾素(IFN)的作用。淫羊藿多糖可以促進(jìn)骨髓造血，并可影響初次和再次免疫應(yīng)答反應(yīng)[19]。2.2.5對腫瘤的作用淫羊藿苷可以提高兒童和成人扁桃體單核細(xì)胞的殺傷活性，并可協(xié)同IL-2提高LAK細(xì)胞對K562和HL-60細(xì)胞的殺傷活性，并且與劑量的大小呈正相關(guān)關(guān)系。淫羊藿苷也可以抑制肝癌細(xì)胞的增值，促進(jìn)其凋亡[20]。淫羊藿苷可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗原性。2.2.6抗衰老作用淫羊藿黃酮可以對抗免疫衰老的主要指標(biāo)，減少肝臟過氧化脂質(zhì)的形成，并減少心、肝等組織的脂褐色素形成，消除自由基，保護(hù)細(xì)胞免遭氧自由基損害，進(jìn)而延緩器官和整個機(jī)體的衰老[21]。由于淫羊藿可以增強(qiáng)免疫功能，防止人體受到疾病的侵害，使腎上腺皮質(zhì)和免疫功能保持在正常水平，從而可以推遲人體的老化過程[22]。2.2.7其他藥理作用目前臨床上對淫羊藿的研究較多，故對其藥理作用發(fā)現(xiàn)的也較多，研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿具有一定的抗炎、止咳、平喘、祛痰效果，可以用于哮喘病的治療，能降低血糖，減輕驗證，降低組織胺所致的毛細(xì)血管通透性增加，還有明顯的鎮(zhèn)靜作用。2.3提取方法2.3.1淫羊藿多糖提取程浩然[23]采用熱水提取、超聲輔助提取、酶提法、和微波輔助提取得出四種多糖，結(jié)果顯示四種多糖的抗氧化能力最強(qiáng)者為熱水提取法。在成分分析中熱水提取和微波輔助提取的糖醛酸含量較高，而超聲含量最低，說明淫羊藿多糖是一種酸性多糖，不同的提取方法會影響多糖的化學(xué)成分。2.3.2黃酮類提取朱裕林[24]以黃酮苷提取率為指標(biāo)，優(yōu)選淫羊藿醇提取和水提取工藝，并對兩種提取方法進(jìn)行對比，結(jié)果顯示水提法淫羊藿苷提取率較高，雖低于醇提法，但兩種方法出膏率無明顯差別，并且節(jié)時、節(jié)能，為其在工業(yè)化大生產(chǎn)的推廣應(yīng)用提供了一定的參考依據(jù)。3總結(jié)中藥淫羊藿的研究根據(jù)主要圍繞有效成分的研究展開。對于淫羊藿苷等黃酮類化合物已有一定程度的研究基礎(chǔ)，而對于淫羊藿多