生物高分子的三維結(jié)構(gòu)

生物高分子的三維結(jié)構(gòu)

人類進入21世紀，科學知識也帶來了一個新時代。2001年2月12日參與人類基因組計劃的六國科學家共同向世人正式公布了人類基因組圖譜及初步分析結(jié)果,這是生命科學史,也是人類科學史上的又一次飛躍,同時標志著后基因組時代的來臨,但是隨著大量生物體全基因組序列的獲得,人們發(fā)現(xiàn)僅從基因組序列的角度根本無法完整、系統(tǒng)地闡明生物體的功能。蛋白質(zhì)作為生命體的主要組成成分和生命活動的主要執(zhí)行者,正在成為新的研究熱點;而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)則是蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域中的一個重要環(huán)節(jié)。以蛋白質(zhì)為主體的生物大分子的功能主要取決于它們的三維結(jié)構(gòu)、運動及相互作用。只有全面了解相關(guān)蛋白質(zhì)及其復(fù)合物、組裝體的精細三維結(jié)構(gòu)、運動和相互作用網(wǎng)絡(luò),及其在亞細胞、細胞層次上表現(xiàn)出來的生命活動的功能關(guān)系,才能最終闡釋人類個體發(fā)育、生長、衰老和凋亡機理,才能在分子和原子水平上理解神經(jīng)活動、認知等腦功能表現(xiàn)機理,細胞增殖、分化和凋亡機理,信息傳遞和作用機理,疾病發(fā)生、發(fā)展機理等一切生命科學問題。在不同的細胞中,由基因編碼的遺傳信息都是相同的,但是不同的細胞在不同的時空所表達的蛋白質(zhì)是不同的。不同的蛋白實現(xiàn)著細胞的不同功能,而功能的實現(xiàn)往往與蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)有關(guān),只有知道蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)才能了解它的功能。20世紀50年代,Anfinsen提出蛋白質(zhì)的特定三維結(jié)構(gòu)是由氨基酸排列順序決定的,并因此獲諾貝爾獎。MaxPerutz在1959年解開第一個蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu),即血紅蛋白的三維結(jié)構(gòu)時用了整整22年時間;而今天,以核糖體為代表的復(fù)雜的蛋白質(zhì)機器都陸續(xù)得到了解析。自20世紀90年代以來,已解蛋白結(jié)構(gòu)的數(shù)量呈指數(shù)增長趨勢,現(xiàn)在大約有42000個蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析,并被存入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(ProteinDataBank,PDB)。從當前的發(fā)展趨勢來看,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究必將成為整個生命科學領(lǐng)域的前沿和帶頭學科,僅在蛋白質(zhì)晶體學領(lǐng)域中就有11名科學家獲得過諾貝爾獎,可見其重要性。1ay、nmr、三維電鏡重構(gòu)技術(shù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定方法主要包括X射線晶體學(X-raycrystallography,X-ray)、核磁共振波譜學(nuclearmagneticresonance,NMR)技術(shù)和三維電鏡重構(gòu)(3-dimensionelectronmicroscopyreconstitution)。這三種方法都可以完整獨立地在原子分辨水平上測定出蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)。1.1蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的研究X射線晶體學是最早也是最主要的測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法,第一個蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)——血紅蛋白的結(jié)構(gòu)就是通過X-ray方法解析的。目前PDB中收錄的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)85%左右是利用X射線晶體學方法解析的。蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的X射線衍射分析包含樣品制備、蛋白質(zhì)結(jié)晶、衍射數(shù)據(jù)收集和處理、相位求解、模型建立和修正等五個主要步驟。五個步驟彼此密切相關(guān),每一個部分取得進展可以加快下一步的研究,同樣任何一個部分的瓶頸也可以成為下一步的限速步驟。其中樣品制備和蛋白質(zhì)結(jié)晶階段是要獲得足夠量的蛋白樣品以及可以用于衍射數(shù)據(jù)收集的高質(zhì)量單晶,前者可以通過針對所選目的基因的特性構(gòu)建和改造高效表達質(zhì)粒,而后利用多種表達系統(tǒng),如大腸桿菌、酵母、桿狀病毒、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)以及無細胞(CellFree)表達系統(tǒng)進行表達,利用親和層析、離子交換、分子篩、疏水層析和反相層析等多種層析技術(shù),大量表達、分離和純化目標蛋白,為晶體的生長提供合適足量的樣品。高質(zhì)量單晶的獲得是蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)研究的主要瓶頸之一,由于不同蛋白質(zhì)的物理化學性質(zhì)差別很大,而且蛋白質(zhì)的各種修飾和相互作用更增加了蛋白質(zhì)的復(fù)雜性,所以不是所有的蛋白質(zhì)都可以獲得單晶的。近年來一些新技術(shù)的應(yīng)用增加了晶體培育的成功率,如加利福尼亞大學圣地亞哥醫(yī)學院的研究者利用一種氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)(enhancedamidehydrogen/deuterium-exchangemassspectrometry,DXMS)來觀察那些不能結(jié)晶的蛋白中究竟是哪一部分不能很好折疊,然后設(shè)計重組蛋白去除這一部分。結(jié)果,去除不能正確折疊部分后,已折疊的部分結(jié)構(gòu)沒有變化。試驗的24個蛋白在經(jīng)過這樣的檢測和操作后有6個成功結(jié)晶并解出結(jié)構(gòu)。此外,五個主要步驟中相位求解也是關(guān)鍵環(huán)節(jié),因為衍射效應(yīng)包含衍射波的振幅和相位,而目前能夠普遍使用的試驗方法只能記錄到衍射波的振幅,要推算出蛋白的結(jié)構(gòu),就必須先找回丟失了的相位。用于解決相位問題的主要方法有分子置換法、多對同晶型置換法(MIR)、多波長反常散射法(MAD)和單波長反常散射法(SAD)。第一種方法用于測定有已知同源類似物的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu);后三種方法用于測定未知的蛋白結(jié)構(gòu)。1990年以后,利用X射線晶體學解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)取得了突飛猛進的發(fā)展,目前平均每天有15個蛋白質(zhì)通過該方法獲得結(jié)構(gòu)。國際上很多難度高、意義重大的三維結(jié)構(gòu),均是在近十幾年實現(xiàn)突破的。2004年3月18日,世界上權(quán)威性的著名雜志Nature以主題論文的方式發(fā)表了由中國科學院生物物理研究所和植物研究所合作完成的“菠菜主要捕光復(fù)合物(LHC-II)2.72?分辨率的晶體結(jié)構(gòu)”研究成果。該晶體的結(jié)構(gòu)彩圖被選作本期雜志的封面圖片。該成果首次基于精確的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)對高等植物的光能吸收、傳遞和光保護等光合作用機理研究的熱點問題進行了探討,發(fā)現(xiàn)了膜蛋白結(jié)晶的第三種類型,命名為“TYPE-III”膜蛋白晶體,并建立了包括膜蛋白、色素分子和脂分子在內(nèi)的蛋白脂質(zhì)體的完整的LHC-II結(jié)構(gòu)模型,提供了近3萬個(29038)獨立的精確的原子坐標。2005年7月1日,清華大學-中國科學院生物物理研究所結(jié)構(gòu)生物學聯(lián)合研究小組經(jīng)過3年努力,率先在世界上解析了線粒體膜蛋白復(fù)合物II的精細結(jié)構(gòu),填補了線粒體結(jié)構(gòu)生物學和細胞生物學領(lǐng)域的空白,成為線粒體呼吸鏈研究領(lǐng)域的一個新的里程碑。進一步研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合物II是一個跨膜蛋白復(fù)合物,從而糾正了教科書中認為“復(fù)合物II是一個外周膜蛋白”的傳統(tǒng)認識。這一結(jié)構(gòu)的解析,為研究與人類很多疾病,諸如嗜鉻細胞瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤和李氏癥等相關(guān)線粒體疾病提供了真實可用的模型。X射線晶體學的缺點是分子在晶體中往往是被鎖定于某一狀態(tài),所得到的晶體往往是分子處于基態(tài)或不同構(gòu)象的平均,而分子行使功能時多發(fā)生在激發(fā)態(tài)、過渡態(tài)、X-射線晶體技術(shù)很難捕捉到分子的動態(tài)信息。但是無論怎樣,X-射線晶體學方法無論過去、現(xiàn)在或?qū)矶紩堑鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)研究的主要方法。1.2nmr的應(yīng)用核磁共振波譜學是對X-射線晶體學的有力補充。1971年,比利時科學家JJeener提出二維核磁共振的概念,1985年,KurtWüthrich在此基礎(chǔ)上發(fā)明了一種新的方法,他選擇生物大分子中的質(zhì)子(氫原子核)作為測量對象,連續(xù)測定所有相鄰的兩個質(zhì)子之間的距離和方位,這些數(shù)據(jù)經(jīng)計算機處理后就可形成生物大分子的三維結(jié)構(gòu)圖。KurtWüthrich用該方法測定了一個蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu),從而奠定了NMR作為確定生物大分子的主要手段之一,他也因此獲得了2002年諾貝爾化學獎。時至今日,NMR已經(jīng)成為確定生物大分子溶液三維空間結(jié)構(gòu)的主要手段。NMR技術(shù)在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA等分子間的相互作用方面,具有高分辨率的特點,僅次于X-射線晶體學技術(shù),可以在溶液中操作,在近似蛋白質(zhì)生理環(huán)境下測定其結(jié)構(gòu),甚至可以對活細胞中的蛋白質(zhì)進行分析,獲得“活”的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。NMR技術(shù)在分析蛋白質(zhì)折疊穩(wěn)定性、運動性和蛋白質(zhì)復(fù)合體中各亞基的相互作用方面具有優(yōu)勢。最近科學家就是用NMR方法解析了啤酒酵母ubiquitin相關(guān)修飾因子1(ubiquitinrelatedmodifier-1,Urm1)的溶液結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)Urm1是ubiquitin超家族中一個獨特的“分子化石”,并找到了真核生物中ubiquitin和一系列ubiquitin-類似蛋白修飾因子(Ubls)的進化起源。NMR技術(shù)的缺點是只能測定小蛋白和中等大小的蛋白質(zhì)分子(相對分子質(zhì)量一般在30000以下),并且圖譜分析工作極為費時,往往需要數(shù)月到一年的時間,導(dǎo)致實驗周期延長,速度緩慢;另外核磁共振衍射技術(shù)的反應(yīng)是在溶液中進行的,研究對象必須是可溶的蛋白,對不溶蛋白的研究就比較困難;而且樣品需要同位素標記等,這些在一定程度上制約了NMR技術(shù)的應(yīng)用。隨著一些新技術(shù)的發(fā)現(xiàn),如G矩陣傅立葉變換式NMR(G-matrixfouriertransformNMR,GFT-NMR)技術(shù)等,使得NMR的發(fā)展速度也很快,目前PDB中收錄的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)15%左右是利用NMR方法解析的,其快速發(fā)展主要歸功于以下幾個方面:儀器技術(shù)的不斷發(fā)展,計算速度的飛速提升和實驗方法上的不斷創(chuàng)新和發(fā)展。1990年以前平均每年只能解10個結(jié)構(gòu),現(xiàn)在平均每天可以解2個結(jié)構(gòu),相信隨著NMR技術(shù)不斷的改進和發(fā)展,NMR技術(shù)在未來結(jié)構(gòu)生物學上的貢獻將會越來越大。1.3電子顯微鏡成像技術(shù)電子顯微鏡在結(jié)構(gòu)生物學中的應(yīng)用近年來變得越來越重要,成為解析大型蛋白質(zhì)復(fù)合體、病毒乃至細胞器的三維納米分辨率結(jié)構(gòu)的有力手段,同時電子顯微鏡二維晶體學在膜蛋白的三維精細結(jié)構(gòu)解析上也有特殊的優(yōu)勢。冷凍電鏡三維重構(gòu)的基本技術(shù)路線為:利用快速冷凍技術(shù)對樣品進行冷凍固定,然后利用冷凍電鏡和低劑量成像技術(shù)對樣品進行電子成像,利用高靈敏底片進行成像記錄,利用高分辨率掃描儀對底片進行數(shù)字化,對數(shù)字化的圖像進行二維圖像分析——選點、分類、校正和平均,最后完成樣品的三維重構(gòu)計算。自從1968年DeRosier和Klug第一次用電子顯微鏡對T4噬菌體的尾部進行了結(jié)構(gòu)解析至今,已有140余種蛋白質(zhì)通過該方法獲得了結(jié)構(gòu),尤其是最近5年隨著計算機圖像處理技術(shù)和顯微鏡設(shè)備的不斷發(fā)展,使得三維電鏡重構(gòu)技術(shù)成為繼X-ray和NMR技術(shù)后,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的另一種重要方法。三維重構(gòu)技術(shù)的優(yōu)勢在于:(1)可以直接獲得分子的形貌信息,即使在較低分辨率下,電子顯微學也可給出有意義的結(jié)構(gòu)信息;(2)適于解析那些不適合應(yīng)用X射線晶體學和核磁共振技術(shù)進行分析的樣品,如難以結(jié)晶的膜蛋白、大分子復(fù)合體等;(3)適于捕捉動態(tài)結(jié)構(gòu)變化信息;(4)易同其他技術(shù)相結(jié)合得到分子復(fù)合體的高分辨率的結(jié)構(gòu)信息;(5)電鏡圖像中包含相位信息,所以在相位確定上要比X射線晶體學直接和方便。2蛋白質(zhì)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)生物學的發(fā)展根據(jù)預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)大概有2000種不同的折疊類型,3000-5000蛋白質(zhì)超家族,當前僅發(fā)現(xiàn)1000余種不同的折疊類型和1600種蛋白質(zhì)超家族。人類基因組測序研究揭示,人體大約有3萬個編碼蛋白質(zhì)的基因,這就是說,人類生命過程中大約需要3萬種不同的基礎(chǔ)蛋白質(zhì),它們在生命活動中發(fā)揮著重要功能,而這些功能的發(fā)揮則依賴于這些蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。因此,獲得這些蛋白質(zhì)并闡明它們的精細三維結(jié)構(gòu)及與其生物功能的關(guān)系,成為揭示生物體活動本質(zhì)的關(guān)鍵一步。近年來基因組工程的迅猛發(fā)展及生物信息學的新進展,給結(jié)構(gòu)生物學開創(chuàng)了道路,使此目標的實現(xiàn)成為可能。1998年4月,美國國立衛(wèi)生研究院和WellcomeTrust發(fā)起了結(jié)構(gòu)基因組研究。結(jié)構(gòu)基因組是利用多種結(jié)構(gòu)生物學方法和基因(DNA或RNA)序列數(shù)據(jù),結(jié)合計算機分析查明和確定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu),再利用X-射線衍射技術(shù)測定蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)來確認對蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的推測。2000年,美國NIH啟動了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)計劃(proteinstructureinitiative,PSI),目標是10年內(nèi)解析10000個蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。日本在蛋白質(zhì)研究中也表現(xiàn)出極大的熱情,提出了蛋白質(zhì)“3000”計劃,目標是5年內(nèi)確定出3000個蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因組技術(shù)的成熟與進步,越來越多的蛋白質(zhì)或其結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)被獲得,2006年平均每天有18個蛋白的結(jié)構(gòu)被解析;但是令人遺憾的是,對于構(gòu)成極為復(fù)雜和多樣的蛋白質(zhì)復(fù)合物和膜蛋白這兩類極為重要的、生命活動所必需的生物大分子而言,高通量的結(jié)構(gòu)解析技術(shù)并不能“包治百病”。蛋白質(zhì)復(fù)合物是一類龐大的“分子機器”,可分為結(jié)構(gòu)型蛋白質(zhì)復(fù)合物和功能型蛋白質(zhì)復(fù)合物,前者比較穩(wěn)定;后者是許多蛋白質(zhì)在執(zhí)行功能時聚合在一起形成復(fù)合物,任務(wù)完成以后分開,如轉(zhuǎn)錄蛋白復(fù)合物。蛋白質(zhì)復(fù)合物的組裝過程和功能執(zhí)行都受到嚴格而精細的調(diào)控。近些年,伴隨著生物化學和細胞生物學等手段的改進和提高,蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成、功能及它們在所參與的生物學途徑中的重要作用被不斷揭示出來,對某些蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)生物學的研究也取得了豐碩成果。比如,核糖體(Ribosome)結(jié)構(gòu)生物學研究使人們對核糖體作用機制產(chǎn)生了革命性的認識。核糖體作為生命體中最復(fù)雜的動態(tài)的分子機器,其功能涉及蛋白質(zhì)合成的各個步驟,1999年,美國耶魯大學的Ban等和英國劍橋醫(yī)學研究中心分子生物學實驗室的Clemons等分別獲得了5?分辨率的50S大亞基的結(jié)構(gòu)和5.5?分辨率的30S小亞基的結(jié)構(gòu),并在此結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上為已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)和多個雙鏈rRNA區(qū)進行了定位。隨后科學家發(fā)現(xiàn)盡管核糖體是由大小亞基與幾十種蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白體,但是50S核糖體中的23SrRNA具有肽酰轉(zhuǎn)移酶的功能,也就是說,核糖體事實上是一種核酶(ribozyme)。這一革命性的結(jié)論揭示了核糖體作為蛋白質(zhì)合成機器的作用機制,解決了人們對核糖體機制上的疑團,徹底改變了人們的固有印象,并對核酶的認識有了進一步的提高。這些發(fā)現(xiàn)是以核糖體作為整體進行結(jié)構(gòu)研究得到的,僅靠研究其中的單一成分是不可能揭示的。然而,當前解析蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)也面臨著一些難題,主要是因為復(fù)合物內(nèi)部用于維護其完整性的相互作用較為復(fù)雜。由于核磁技術(shù)的內(nèi)在限制,目前蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)研究多采用電鏡和晶體學,尤其是晶體學,因其研究對象可大可小,特別適合進行復(fù)合物整體及單獨亞基的結(jié)構(gòu)解析,但是用于結(jié)晶的試劑對于復(fù)合物內(nèi)部間相互作用的影響具有相當?shù)牟豢深A(yù)見性,因此,復(fù)合物的結(jié)晶成功比例遠低于一般單體蛋白。對于不易結(jié)晶的蛋白質(zhì)復(fù)合物則常常采用電鏡進行研究,以得到其整體結(jié)構(gòu),細節(jié)結(jié)構(gòu)可通過將其亞基的晶體結(jié)構(gòu)“填充”入電鏡結(jié)構(gòu)而獲得。膜蛋白作為擔負復(fù)雜生物學功能的一類重要蛋白質(zhì),在各種各樣重要生物學的基本過程中起著關(guān)鍵的作用,如光合作用、呼吸作用、神經(jīng)信號傳導(dǎo)、免疫反應(yīng)和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收等。此外,目前藥物研究中發(fā)現(xiàn)近70%的藥物作用靶點是膜蛋白,因此,膜蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究既是蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域中的基本問題,也是國際生命科學研究中的前沿問題。對于膜蛋白所承擔的重要生物學功能的深入理解還有賴于高分辨率膜蛋白三維結(jié)構(gòu)的解析。1998年,美國洛克菲勒大學的Mackinnon成功獲得世界第一個高分辨率的離子通道三維結(jié)構(gòu),來自于青鏈霉菌的KcsA鉀離子通道。位于通道上面的selectivityfilter恰好完美地容納鉀離子,但卻能將體積較小的鈉離子拒之門外,這樣在原子水平上解釋了為何此離子通道蛋白對鉀離子有高度選擇性,以至于每秒鐘可以通過一億個離子。這張照片觀察到的離子通道呈現(xiàn)關(guān)閉狀態(tài)。隨后在2002年Mackinnon解出了鈣離子活化型鉀離子通道MthK的三維結(jié)構(gòu),并且是離子通道的開放狀態(tài)。Mackinnon在鉀離子通道蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究的貢獻,不但解釋了離子選擇性和通道開關(guān)的機制,而且為研究多種疾病的分子機制和藥物設(shè)計提供了可能,他也因此獲得了2003年諾貝爾化學獎。這說明膜蛋白結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究不但是國際研究的熱點,而且它的突破可以使人們更加清楚地了解生命的基本過程,在實際應(yīng)用中具有重大的意義,但是由于膜蛋白天然含量低和分離純化困難以及疏水特性等,從而制約了膜蛋白的研究。截至2007年1月,占蛋白總數(shù)近1/3的膜蛋白僅有242個結(jié)構(gòu)被PDB收錄,占所有存入數(shù)據(jù)的0.6%,其中獨立結(jié)構(gòu)僅為122個。關(guān)于膜蛋白的結(jié)構(gòu)研究在1988、1997和20